突破供肝短缺难题：,异种肝移植的发展与创新
时间：2022-12-02 16:10:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
李 霄， 窦科峰
空军军医大学西京医院 肝胆外科， 全军器官移植研究所， 西安 710032
2021年10月19日和2022年1月7日，美国相继完成以基因编辑小型猪为供体的异种肾移植和心脏移植的临床试验并获得成功[1-2]，自此，以猪为供体的异种移植迅速占据全球生命科技领域的中心，成为全人类关注的焦点。近期，美国食品药物监督管理局宣布正在制订计划，即将允许对猪器官移植开展大规模的临床试验。TheNewEnglandJournalofMedicine、Nature等权威期刊近期连续发表专家述评[3-4]，一致认为异种移植将很快走向临床实用，有望彻底解决供体器官短缺的难题。
随着基因工程技术的不断发展，以基因编辑猪为供体的异种肝移植稳步进展，虽与肾移植、心脏移植和胰岛移植相比尚有差距，但目前猪肝移植的最长存活时间也已延长至1个月[5]，为临床利用异种肝移植作为暴发性肝功能衰竭的“桥接移植”提供了可能。异种肝移植即将走向临床实用。
“异种移植一定会不断发展进步”，国际肝移植先驱Thomas Starzl教授曾在讨论异种移植时这样说，“但在这个领域开展的一切都是非常艰难的，我们付出了很多努力。然而这并没有引起什么确切改变。我甚至并不看好它的前景(我们还有太多的东西需要去探索)，但我认为它迟早会完成的……”。
1992年，第一个移植了狒狒肝脏的患者死亡之后(移植肝存活70 d)，Starzl教授等肝移植专家推进了一系列狒狒肝脏到人的原位移植计划。1993年，Starzl教授团队又对另1例患者实施狒狒肝移植，但该患者在术后26 d因系统性感染而死亡。由于临床效果不理想，Starzl教授团队停止了使用狒狒肝脏这一临床研究计划。同年，美国学者Makowka等对1例26岁的自身免疫性肝炎女性患者实施世界第一例临床异种猪肝移植。该患者因自身免疫性肝炎导致暴发性肝昏迷入院，而供体是一头野生型大白猪。手术的目的是通过移植猪肝暂时代偿肝功能而保证患者存活，直到有人类供体的肝脏可用为止。术后6 h后见金黄色胆汁不断流出，患者血清AST、ALT及乳酸等含量持续减少，提示移植肝在患者体内发挥生理生化功能；
同时，受体颅内压持续下降，凝血功能也逐渐转向正常。然而，在移植后3 h便检测到了移植物排斥反应，并在移植后34 h进展为缺血性坏死。最终，患者因不可逆的脑损伤于2 d内死亡。
1995年，美国学者Wakowka等对1例因自身免疫性肝炎导致暴发性肝功能衰竭的3～4级肝昏迷患者实施辅助性肝移植，供肝同样来自野生型大白猪。术前采用血浆洗脱法和特异性抗体移出法对患者进行预处理，清除了受体循环血液中90%的抗猪天然抗体，减轻超急性排斥反应。术后采用“环孢素A+环磷酰胺+前列环素E1+硫唑嘌呤”的四联免疫抑制治疗方案。最终，供肝功能存活20 h，受体存活34 h。尸检发现肝脏存在由抗体介导的超急性排斥反应所致的大面积梗死，提示受体循环血液内的异种抗体清除后可迅速回升。
在临床初步尝试失败后，异种肝移植研究转向基础研究，试图寻找导致移植失败的原因及解决方法。2002年和2003年，美国2个研究团队先后在Science上报道培育出α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除小型猪(GTKO猪)。随后全世界开展了一系列以GTKO猪为供体，非人灵长类动物为受体的异种器官移植实验，取得了重大进展。2017年，中美两国科学家联手采用CRISPR/cas9技术，将猪体内的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)的62个基因拷贝全部敲除，根除了猪细胞里面所有的内源性病毒活性，并通过核移植克隆技术成功获得了第一批37头无病毒活性的试验猪，为异种移植走向临床排除了种间交叉感染的风险[6]。目前，异种肾移植最长存活499 d[7]，原位心脏移植最长存活199 d[8]，而异种肝移植进展显得较为困难，当前最长存活时间为29 d[5]，但已足够证明猪的肝脏可在人体内发挥一定的代谢功能，能够为急性肝衰竭患者提供一段时间的肝功能支持，从而起到“桥接”同种肝移植治疗的目的[9]。
1968年，Calne等率先利用猪肝开展异种肝移植研究，进行了7例野生型猪-狒狒原位肝移植手术，移植肝和受体最长存活时间3.5 d。随后，多个研究小组均开展相同的手术实验，但存活时间均未超过4 d。随后，随着GTKO猪及转人补体调节蛋白猪的问世，多个研究小组尝试使用转基因猪的肝脏以提高存活率。然而，所有的手术实验均发现猪肝在恢复血流灌注后，受体将很快出现严重的血小板减少，直至发生致死性凝血功能调节障碍，导致多个部位自发性出血，因而生存时间均<7 d。
起初认为在凝血功能调节障碍过程中，移植物血管内的血栓形成与猪内皮细胞抗凝功能受损有直接关系，而抗体和补体介导的内皮细胞激活则促使内皮细胞由抗凝状态向促凝状态转化。但实际研究发现，预清除天然抗体并中和受体补体后，并不能完全阻止凝血调节功能障碍的发生。Ekser等[10]和Ezzelarab等[11]的研究发现，受体死亡后，在对移植肝标本行电镜检查时，发现肝血窦内有大量的血小板、炎性细胞和纤维蛋白沉积，人和非人灵长类动物血小板可能被猪肝移植物识别为“外来物”，并被猪Kupffer细胞和肝血窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)吞噬而遭到大量破坏。这种吞噬作用与灵长类动物血小板表面表达的CD47，与猪Kupffer细胞、LSEC等表面表达的信号调节蛋白-α(SIGNAL regulatory protein-α，SIRPα)之间的不相容性有关。有学者提出将hSIRPα编码基因转入小型猪，使其LSEC和Kupffer细胞表达hSIRPα，以消除对人血小板的吞噬作用。但实验中发现hSIRPα与猪CD47的结合力显著高于hCD47，因而并不能诱导出抑制性酪氨酸磷酸化信号，没有得到理想的干预效果。此外，SIRPα并非只表达于Kupffer细胞和肝内皮细胞，循环中的巨噬细胞也有表达。因此，循环中的巨噬细胞需要与内皮细胞或其他细胞表面的CD47结合才能阻止其激活和吞噬，有效的策略可能是同时转入hSIRPα和hCD47[12]。
其他可能介导凝血调节功能障碍的因素包括：(1)免疫反应导致供肝LSEC激活，进而细胞内P-选择素、E-选择素、组织因子(tissue factor，TF)等表达上调，触发外源性凝血途径。(2)受体血小板和外周血单核细胞内组织因子表达上调。(3)微循环内白细胞-血小板聚集体的形成。(4)猪的TF途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)和人TFPI之间存在结构性差异，导致猪TFPI和人TFPI的功能不兼容，因而猪TFPI不能有效抑制人TF途径的激活[13]。
考虑到原位肝移植带来严重的凝血调节功能障碍，那么能否将GTKO猪肝作为辅助移植物植入非人灵长类动物体内以减轻对受体血小板的破坏？从1968年到2016年，猪到非人灵长类动物肝移植的存活时间从未超过9 d。2013年，笔者团队在国际上首次尝试异种脾窝辅助性肝移植研究。实验过程中，首先切除受体的脾脏，而后将部分GTKO猪的供肝(约120 g)植入脾窝，术后受体存活时间延长至14 d。尸检病理学检查证实移植肝内存在一定程度的血栓性微血管病，但术后严重血小板丢失现象并未出现，其计数始终维持在50 000/mm3以上，未出现致死性的血小板匮乏[14]。随后美国麻省总医院借鉴该术式，也完成了全美首例异种异位辅助性肝移植术，移植肝和受体最长存活15 d[15]，但凝血问题始终没有得到解决。
针对异种肝移植术后受体出现致死性血小板减少的问题，美国麻省总院的肝移植团队，分别于2016年和2017年在2例GTKO猪-狒狒的肝移植术后，持续给予受体输注外源性人凝血酶原复合物(human prothrombin concentrate complex，hPCC)，并检测外周血液循环中维生素K依赖凝血因子和非维生素K依赖凝血因子的活动度。结果发现，移植肝可合成并分泌凝血因子，且受体出血异常得到明显改善。最终，2例受体存活时间分别延长至25 d[16]和29 d[5]，这也是目前以GTKO猪为供体的异种原位肝移植受体的最长存活时间记录。
2020年，杭州启函生物科技有限公司和云南农业大学动物医学院在国际上首次成功培育出基因改造程度最大的PERV敲除猪，实现了“13种基因编辑”，即PERV-KO/GalT-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hβ2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39(PERV-KO/3-KO/9-TG)。该基因编辑小型猪除了完全敲除PERV，还敲除了诱发异种超急性排斥反应的3个主要抗原α-Gal、β4GalNT2和CMAH，并导入了9个人源化基因以抗急性排斥。随后，笔者团队将其作为供体，实施了猪-恒河猴异种心脏、肝脏和肾移植的临床前研究，探索了此种类型供体猪在异种器官移植中的临床应用前景。心脏采用腹部异位心脏移植术；
肝脏采用脾窝异位辅助性肝移植术；
肾脏采用临床常规的左髂窝肾移植术，并切除受体自身的双侧肾脏。免疫抑制方案为：术前抗胸腺细胞球蛋白+眼镜蛇毒因子+CD20抗体+CD40抗体，术后CD40抗体+吗替麦考酚酯+他克莫司+甲基强的松龙。手术过程顺利，各移植物血流恢复后均显示颜色红润、质地柔软、血流灌注状态良好。其中，移植心脏即刻复跳，搏动规律有力；
移植肝脏有金黄色的胆汁从胆管流出；
移植肾可见尿液从输尿管中流出。心脏、肝和肾移植受体的存活时间分别为7、26和1 d，分别死于下腔静脉血栓形成、凝血紊乱所致低血压和严重心律失常。尸检后的病理检查结果显示，在移植终点，移植心脏和肾组织结构接近正常，而移植肝脏表现为片状坏死，肝组织结构出现紊乱，并伴有明显炎症损伤、间质出血和血栓性微血管病。上述实验在世界范围内首次实现了PERV敲除联合3种主要异种抗原基因敲除(GalT、β4GalNT2、CMAH)，以及抑制补体活化(hCD46、hCD55、hCD59)、调节凝血紊乱(hTHBD、hTFPI、hCD39)、抗炎抗吞噬(hB2M、hHLA-E、hCD47)的9种人源化基因转入，是目前基因改造程度最大、人源化程度最高的供体猪类型。理论上，该类供体既可解决异种器官移植后PERV交叉感染及超急性排斥反应的问题，也可以降低异种器官移植术后急性排斥反应和凝血功能紊乱等问题。研究结果显示，移植物再灌注后颜色红润、质地柔软、血流灌注状态良好，提示GalT、β4GalNT2、CMAH敲除可抑制异种移植超急性排斥反应，与其他学者前期的研究结果一致。但是，随着受体生存期延长，移植肝脏出现明显的体液性排斥反应，表现为片状坏死，肝组织结构出现紊乱，并伴有炎症损伤、间质出血和血栓性微血管病等，提示供体猪9种人源化基因的转入并不能完全避免异种移植物损伤。该研究中，肝移植受体突破了猪-猴辅助性肝移植国际同类术式最长存活时间记录，在一定程度上证实了PERV-KO/3-KO/9-TG猪在改善移植排斥反应、受体凝血异常等方面仍有自身优势，但其能否作为临床异种器官移植的潜在供体仍需进一步评估[17]。此外，PERV敲除理论上可阻断病毒跨物种传播。该研究也提示PERV不会传播到受体血液或组织中，但PERV监测仍然是一个值得关注的问题，尤其是在长期存活的受体当中。
考虑到长期疗效和当前公众对异种移植的接受程度，笔者建议以猪为供体的异种肝移植的初步临床试验，应侧重于暴发性肝衰竭、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭和原发性同种异体肝移植失败等患者。这些情况下，患者往往由于缺少有效的替代疗法，且无法及时获得同种供肝而死亡。此时，可考虑应用异种肝移植作为一种“桥接治疗”的方式，支持患者渡过最危险的时刻，直至自身肝功能恢复或等到获得同种供肝进行移植。如果此类临床试验获得成功，再加上对供体猪进行更为完善、全面的基因修饰改造，有理由相信，以猪为供体的异种肝移植有望成为有效的临床治疗方式。
美国学者Horslen等[18]最早提出以下标准，可考虑应用异种肝移植作为桥接治疗：(1)急性肝衰竭患者在ICU持续治疗后病情进一步恶化；
(2)适合行同种异体肝移植的患者；
(3)肝性脑病，并进展为Ⅳ级昏迷；
(4)已行气管内插管且短期内无法拔除；
(5)颅内压监测中出现极端脑灌注压；
(6)缺少合适的同种异基因供肝。
英国国民健康服务(National Health Service，NHS)肝脏咨询小组为急性肝衰竭患者制定了一套超紧急的选择标准(其中至少1项必须满足)(表1)[19]。该标准可以被考虑用于选择患者行原位猪肝移植，再“过渡”到同种异体移植的临床试验。
表1 英国NHS急性肝衰竭超紧急选择标准
总的来讲，在异种肝移植开始临床试验之前，选择最佳患者对于试验能否取得成功至关重要。目前最妥善的方案是将受试者范围定为具有严重或危及生命疾病的受者，这类患者需要立即接受器官移植治疗，但因缺少捐赠器官，无法及时得到恰当的治疗而死亡[20]。这些患者不符合接受同种异体移植的标准，例如高龄(>65岁)、骨骼肌减少症、慢加急性肝衰竭和同时患有其他重大疾病等，并被判定为“因病重而无法移植”。利用异种肝移植的“桥接治疗”，可能延长此类晚期患者的生存期，延长“移植窗口期”，促进同种异基因肝移植的成功，并降低死亡率。
尽管凝血功能障碍仍然是一个巨大的挑战，但基因编辑猪的肝脏已经能够在非人灵长类动物体内有功能存活近30 d，这为异种肝移植进入临床试验奠定了重要基础。同时，PERV-KO/3-KO/9-TG猪在克服超急性排斥反应、缓解体液性排斥反应及凝血紊乱方面具有一定优势，是当前临床异种器官移植最有价值的潜在供体。然而，异种器官移植临床前研究实施难度大，受体依从性差，给药窗口窄，用药、护理等术后管理也十分困难。这些问题，需要多学科通力合作去解决。随着异种移植研究事业的推进，相信异种移植终将走向临床实用，彻底解决供体短缺的难题，造福人类！
利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：李霄负责文献检索，撰写论文；
窦科峰负责指导撰写文章并最终定稿。
