白僵菌孢子_涡旋法提取白僵菌孢子DNA技术研究
时间：2019-05-20 03:27:16 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
白僵菌（Beauveria）是一类具有重要生防价值的应用真菌，目前已被认定的有8个种，其中7个种为虫生真菌[1-2]，对多种害虫均有很好的生防效果[3-5]。但是白僵菌种间形态差异很小，难于根据形态特征进行区分[6]，基于DNA序列对白僵菌进行种间区分可克服形态分类上的一些困难[7]。关于白僵菌DNA的提取方法，过去文献上介绍的多是从菌丝上提取，一般采用液氮加碱裂解法[8-13]。由于白僵菌在培养过程中，容易产生大量孢子，菌落上孢子比菌丝要多，利用白僵菌孢子提取DNA，从取材上更为方便。利用液氮加碱裂解法从白僵菌中提取DNA时，在液氮研磨过程中很容易使孢子粉飞散，DNA提取效果不佳。为克服这一问题，选用涡旋来促进白僵菌孢子细胞裂解，并通过正交优化，探索出从白僵菌孢子中提取DNA的较好方法，现总结如下。
1材料与方法
1.1试验材料
供试白僵菌菌株为河南科技大学林学院真菌实验室保存的白僵菌BB01。供试裂解液配制方法：裂解液1，EDTA 13.399 2 g，NaOH 1.44 g，Tris 1.211 g，浓HCl 0.42 mL，加去离子水定容至100 mL；裂解液2，SDS 2 g加入80 mL去离子水中65 ℃水浴溶解，定容至100 mL。使用时根据用量取等量裂解液1和裂解液2混匀。供试3 moL/L NaAc配制方法：NaAc 40.8 g溶解于100 mL去离子水，冰醋酸调pH值至5.2。供试TE缓冲液：Tris-HCl 10 mmoL/L，pH值8.0；EDTA 1 mmoL/L，pH值8.0。
1.2试验方法
1.2.1白僵菌DNA提取。称取适量白僵菌孢子放入5 mL容量离心管中，加入适量石英砂和SDS提取缓冲液，放在旋涡混匀器上涡旋混匀若干分钟，每隔1 min用力上下晃动1次离心管；65 ℃水浴10 min，3 min颠倒混匀1次；加入适量NaAc，轻匀，冰浴5 min；12 000 r/min离心5 min；取700 μL 上清液于1.5 mL容量离心管中，加入1/2倍体积异丙醇，轻匀，冰浴5 min；12 000 r/min离心5 min，弃上清液；用500 μL 70%冰乙醇洗涤DNA；12 000 r/min离心5 min，弃上清液；风干20 min，溶于100 μL TE，-20 ℃保存。
1.2.2DNA提取体系的正交优化。以孢子量、石英砂、裂解液、涡旋时间、NaAc为试验因子，利用L16（45）正交设计5因素4水平正交试验表，具体见表1，提取步骤同1.2.1。
1.2.3DNA检测。100 V电泳35 min，EB染色10 min，凝胶成像分析照相，对获得的DNA进行紫外分光光度计检测[14]。
1.2.4试验方案验证。选用实验室保存的6个白僵菌菌株作为样品，使用获得的方案提取DNA，并使用液氮研磨方法提取DNA作对照[9]。对提取的DNA进行ITS、IGS、β-tubulin PCR扩增，以进一步检测试验结果。
（1）ITS PCR对优化结果的验证。以优化体系提取的DNA为模板，采用通用引物ITS1和ITS4进行扩增[15]，ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATA TGC。试剂用量：Buffer 2.5 μL；dNTP 0.5 μL；ITS1 0.5 μL；ITS4 0.5 μL；ddH2O 19.5 μL：Taq酶0.5 μL：模板1.0 μL。反应程序：94.0 ℃预变性2 min；94.0 ℃变性30 s，50.0 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸1 min，30个循环；72.0 ℃补平5 min；4.0 ℃保存。PCR扩增产物取5 μL DNA溶液，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶电泳图像分析系统分析电泳结果。
（2）IGS PCR对优化结果的验证。以优化体系提取的DNA为模板，采用IGS引物CNL12和5SA进行扩增[15]，CNL12：CTGAACGCCTCTAAGTCAG；5SA：CAGAGTCCTATG GCCGTGGAT，引物由上海生工生物工程有限公司合成。试剂用量：Buffer 2.5 μL；dNTP 0.5 μL；ITS1 0.5 μL；ITS4 0.5 μL；ddH2O 19.5 μL：Taq酶0.5 μL：模板1.0 μL。反应程序：94.0 ℃预变性2 min；94.0 ℃变性30 s，53.0 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸1 min，30个循环；72.0 ℃补平5 min；4.0 ℃保存。PCR扩增产物取5 μL DNA溶液，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶电泳图像分析系统分析电泳结果。
（3）β-Tubulin PCR对优化结果的验证。以优化体系提取的DNA为模板，参考Genbank白僵菌β-Tubulin序列设计引物，BAIBF：CGTTGTTCGTCGTGAGGCCGAA；BAIBR：ATG AAGGAAAGC- CTTGCGACGG，引物由上海生工生物工程有限公司合成。试剂用量：Buffer 2.5 μL；dNTP 0.5 μL；ITS1 0.5 μL；ITS4 0.5 μL；ddH2O 19.5 μL：Taq酶0.5 μL：模板1.0 μL。反应程序：94.0 ℃预变性2 min；94.0 ℃变性30 s，61.0 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸1 min，30个循环；72.0 ℃补平5 min；4.0 ℃保存。PCR扩增产物取5 μL DNA溶液，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶电泳图像分析系统分析电泳结果。
2结果与分析
2.1涡旋体系试验结果
将16个处理所得DNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳，并进行凝胶成像分析。
从图1可以看出，16个试验中，6、16的DNA电泳条带较亮，其他DNA电泳条带亮度较弱，即第6、16个试验提取DNA较好。对所获得的DNA经紫外分光光度计检测，A260 /A280比值较低，仅根据A260值分析，结果见表2。
通过极差分析可知，5个因素的影响作用由大到小分别为：NaAc>石英砂>裂解液>涡旋时间>孢子量。根据K1、K2、K3和K4值综合分析较优的提取体系为孢子量0.02 g、石英砂1.0 g、裂解液2 mL、NaAc 200 μL、涡旋时间5 min。
2.2试验结果验证
2.2.1不同白僵菌DNA电泳结果。根据优化结果，提取实验室保存的白僵菌BB01、BB02、BB03、BB04、BB05、BB06菌株的孢子DNA。将优化方案提取的DNA在琼脂糖凝胶电泳检测，泳道为1、2、3、4、5、6。使用液氮研磨提取BB01 DNA作对照（CK）。从图2可以看出，优化方案提取的白僵菌孢子总DNA有清晰的主带，提取的总DNA质量较好。
2.2.2PCR检测验证。以2.2.1提取的6个白僵菌菌株的DNA和对照为模板，分别进行ITS序列、IGS序列、β-Tubulin序列PCR电泳检测，各自对应PCR产物电泳泳道为CK、1、2、3、4、5、6，从图3、图4、图5可以看出，正交优化提取的DNA都能扩增出PCR产物，并且效果很好。
