【替代模板法制备甲硝唑分子印迹聚合物及其在血清样品固相萃取中的应用】 分子印迹聚合物

　　摘 要 [HTSS]以甲硝唑酯化物（MNZ�Es）为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，氯仿为致孔剂，合成了对甲硝唑（MNZ）具有特异吸附性能的分子印迹聚合物（MIP）。由静态吸附实验结果得知，印迹指数为2.02，说明MIP对MNZ具有良好的识别性能。MIP吸附属于Langmuir 吸附模型，其对MNZ的吸附属于单层分子吸附，其最大表观吸附量Q��max�为116
　　�SymbolmA@ mol/g，结合常数K为0.65 L/mmol。在固相萃取实验中，MNZ在分子印迹固相萃取（MISPE）和非印迹固相萃取（NISPE）上的回收率分别为97.4%和44.3%，而结构类似物MNZ�Es和对硝基苯酚在印迹和非印迹柱子上的回收率均小于11.6%，表明替代模板MIP对MNZ具有很高的选择性吸附。应用MISPE分离富集血清样品中的MNZ回收率为94.5%，说明替代模板MIP可实现血清样品中MNZ的选择性分离富集，且没有模板渗漏。
　　关键词 [HTSS]甲硝唑; 替代模板; 分子印迹聚合物; 固相萃取�
　　1 引 言�
　　甲硝唑（MNZ）是临床常用的硝基咪唑类抗微生物药物，可抑制阿米巴原虫氧化还原反应，使原虫氮链发生断裂，具有抗菌和消炎的作用��[1]�。在环境和生物样品中，检测MNZ的方法有气相色谱法��[2]�、高效液相色谱法��[3～6]�、质谱法��[7]�和分光光度法��[8]�等。�
　　溶剂萃取和固相萃取法（Solid phase extraction，SPE）是提取生物样品中MNZ的有效前处理手段��[9]�。但传统的SPE吸附剂和被分析物之间的作用力是非特异性的，吸附率和回收率均不佳。与之相比，分子印迹聚合物（MIP）具有高选择性、亲和性及预定性，故MIP作为SPE材料得到了广泛应用。Mohamed等��[10]�制备了硝基咪唑类化合物的MIP，但并未给出功能单体等重要因素。Jafari等��[11]�将MNZ作为模板分子制备MIP，其回收率仅89%，也未考察聚合物的印迹效果。但MISPE应用中有模板分子渗漏的缺陷，会干扰目标物测定。为解决模板渗漏，Matsui等��[9]�提出了替代模板法。该法是将目标化合物的结构类似物作为模板分子，制备对目标分子有选择性MIP的一种新方法。已对多种化合物使用替代模板法制备了MIP，基本解决了模板渗漏问题��[12～16]�。�
　　本研究采用替代模板法制备MNZ�MIP，将其作为SPE吸附剂，考察聚合物的吸附量和选择性，并应用于生物样品的分离与富集。
　　2 实验部分�
　　2.1 仪器与试剂
　　�
　　ProStar高效液相色谱分析仪（美国VARIAN公司）； UV�2450紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）；5S1020固相萃取仪（北京振翔工贸有限公司）。甲硝唑 （MNZ，杭州大阳化工有限公司）；甲基丙烯酸 （MAA，纯度＞99.5%，Acros�Organics公司）；对硝基苯酚（4�NP，杭州大阳化工有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（用前除阻聚剂，EDMA，分析纯，百灵威化学技术有限公司）；偶氮二乙丁腈（用甲醇重结晶，AIBN，化学纯，上海试剂厂）；甲醇（MeOH，色谱纯，TEDIA，New Jersey），其它试剂均为分析纯。�
　　2.2 替代模板的合成�
　　将3.0 mL （32 mmol） 乙酸酐滴入1.0 g （5.84 mmol） MNZ中，水浴加热至70 ℃，搅拌反应4 h，减压蒸干��[17]�。剩余物经柱色谱分离，得0.9348 g 金黄色晶体（MNZ�Es），熔点为75～76 ℃，产率为75%。��1H NMR （400 MHz�, CDCl�3） �δ�＝7.96 （s, 1H）, 4.58 （m, 2H）, 4.41 （m, 2H）, 2.51 （s, 3H）, 2.03 （s, 3H）。�
　　2.3 MIP的制备�
　　将0.1704 g （0.8 mmol）MNZ�Es、0.3444 g （4 mmol）MAA、40 mg AIBN、3.1715g （16 mmol）EDMA，�5.5 mL氯仿�，置于聚合瓶中，充分溶解混匀，超声脱气5 min，通氮气10 min，密封。将聚合瓶放入50 ℃恒温油浴锅中加热24 h，得到白色块状聚合物。将块状聚合物用湿法研磨，过筛收集得到粒径38～�75
　　�SymbolmA@ m的微粒�，以冰乙酸�甲醇（1∶9, V/V）溶液洗至无MNZ�Es检出；再用甲醇洗去乙酸，最后真空干燥至恒重。NMIP的制备：除不加入MNZ�Es外，其余步骤与MIP的制备过程相同。�
　　2.4 静态吸附实验�
　　称取20 mg MIP（或NIP），置于5 mL容量瓶中，加入4 mL MNZ�二氯甲烷溶液（10～350 mg/L），室温振荡12 h。溶液经微孔膜过滤，滤液用二氯甲烷适当稀释，测317 nm处的吸光度，计算MNZ的回收率。�
　　2.5 分子印迹固相萃取（MISPE）�
　　称取100 mg干燥的MIP（或NIP），置入1 mL SPE 小柱中，在聚合物上放置塞板。小柱分别用2 mL甲醇和2 mL二氯甲烷活化，MNZ�二氯甲烷溶液上样1 mL，依次用1 mL二氯甲烷和1 mL乙腈�二氯甲烷（5∶95, V/V）淋洗，1 mL甲醇洗脱两次，以吸光度计算回收率。�
　　2.6 样品的制备及萃取�
　　取空白牛血清样品0.4 mL，置于具塞离心管中，准确加入0.1 mL 450 mg/L MNZ水溶液，涡旋混匀�1 min�；加3 mL氯仿�异丙醇 （95∶5, V/V）混匀，2000 r/min离心10 min，除去蛋白质；准确量取上层清液�2.5 mL�，在40 ℃水浴中用氮气吹干，用1.0 mL二氯甲烷溶解，按照2.5节的方法进行固相萃取。萃取液用HPLC法测定，色谱柱为依利特C��18�分析柱（150 mm×4.6 mm，5
　　�SymbolmA@ m），流动相为甲醇�水（15∶85，V/V）；流速1 mL/min；进样量20
　　�SymbolmA@ L；柱温为25 ℃；检测波长315 nm。
　　3 结果与讨论�
　　3.1 替代模板分子与功能单体的相互作用
　　�
　　MNZ是一种水溶性药物，在常用的制备MIP的溶剂（氯仿、乙腈、甲苯）中溶解性差。因此，用自制的MNZ酯化物作为替代模板法制备对MNZ具有特异吸附性能的MIP，在Silicon Graphics Octane running IRIX 6.5操作系统上，采用SYBYL 6.9TM软件的LEAPFROG��TM�算法进行了计算机模拟��[17，18]�。模拟结果显示， MAA分子中的�OH替代模板分子, MNZ�Es，中的C���O�有强氢键作用（图1），并形成稳定的复合物。以EDMA为交联剂，氯仿为致孔剂，AIBN为引发剂时，能在复合物周围形成固定的网状结构的MIP，对MNZ有很强的特异吸附性能。�
　　
　　3.2 MIP的结合能力和印迹指数�
　　除去模板分子后，在MIP中形成与模板分子在空间和结合位点上相匹配的具有多重作用位点的空穴，这样的空穴对模板分子具有很高的选择性��[19]�。通过吸附前后溶液中MNZ含量变化，计算MIP（或NIP）对MNZ的结合量（Q）：Q＝（C�0－C）V/m （C�0和C分别是吸附前后溶液中MNZ的浓度（mg/L），�V是溶液的体积�，m是MIP（或NIP）的质量。[TS（][HT5”SS]图1 替代模板分子MNZ�Es与功能单体MAA的结构式及其计算机模拟�
　　Fig．1 Chemical structures of dummy template metronidazole ester （MNZ�Es）, monomer methacrylic acid （MAA） and results of computer modelling[TS）]
　　
　　由图2可见，随着浓度的提高，MIP和NIP的吸附量随之增大；浓度为1.46 mmol/L时，吸附达到饱和。此时MIIPs和NIP对MNZ的吸附容量分别为34.0和�16.8
　　�SymbolmA@ mol/g�，印迹指数为2.02，表明MIP对MNZ具有良好的选择性吸附能力。�
　　[TS（][HT5”SS] 图2 MIP和NIP的吸附等温曲线�
　　Fig．2 Adsorption isotherms of MIP and non�molecularly imprinted polymer （NIP）[TS）]
　　以Langmuir等温吸附模型��[20]�, 1/Q ＝1/Q��ma���x�KC ＋1/Q��max� （Q��max�为结合位点的最大表观吸附量，K为结合位点的结合常数）, 拟合图2中的MIP吸附曲线。经1/Q对1/C线性回归，得方程y＝0.0133x＋�0.0086�，R�2＝0.998，与Langmuir等温吸附模型吻合很好。说明在所研究的浓度范围内，MNZ在MIP上的吸附是单层分子吸附。通过曲线截距计算最大表观吸附量Q��max�为116
　　�SymbolmA@ mol/g，由截距和斜率之比计算结合常数K为0.65 L/mmol。�
　　3.3 固相萃取（SPE）条件的优化�
　　分别用水、甲醇、乙腈、氯仿和二氯甲烷作为溶剂，考察MISPE和NISPE对MNZ的保留能力。由�图3可见�，在水中回收率最低（NIP 和 MIP的分别为12.1%和16.4%），而二氯甲烷中回收率最高（NIP和MIP的分别为86.2%和98.3%），即回收率随溶剂极性降低而升高，故选二氯甲烷为上样溶剂。 �
　　目标分子在MIP表面上的结合形式并非是完全的特异性吸附，选用合适的淋洗剂，可减少非特异性吸附。由图4可见，用1 mL甲醇或乙腈时，不但能淋洗MISPE上非特异性吸附的MNZ，同时特异性吸附的MNZ也被林洗掉，回收率分别是6.3%和�14.5%�。二氯甲烷作为淋洗剂时，MIP的形态转变为有利于形成氢键的状态，MNZ被选择性地保留在MIP上，而其它杂质物都被淋洗剂除去。为了获得高选择性，将少量的乙腈加入到二氯甲烷中，作为淋洗剂，除去样品中非特异性吸附的残留物。当乙腈含量为5%时，MNZ在NISPE上的回收率较低（�77.5%�），而在MISPE上很高（97.9%）。
　　因此，选定1 mL二氯甲烷和1 mL 5%（V/V）乙腈�二氯甲烷作为后续实验的淋洗溶剂。极性强的溶剂能有效破坏MIP和
　　[TS（5*2][HT5”SS] 图3 不同溶剂中MNZ（50 mg/L）在MIP和NIP上回�收率��
　　Fig．3 MIP and NIP recoveries （%） for 1 mL 50 mg/L of metronidazole in different loading solvents�
　　[TS）]
　　[TS（5*2][HT5”SS] 图4 用不同淋洗溶剂时MNZ在MISPE 和 NISPE上回收率�
　　Fig．4 Effect of washing solvents on recoveries of MNZ on molecularl imprinted�solid phase extraction (MISPE) and NISPE[TS）]目标分子之间的特异性结合。本实验使用甲醇为洗脱液时回收率最高。因此，选择2×1.0 mL甲醇为洗脱液。�
　　3.4 MIP的选择性实验�
　　为评价替代模板MIP的选择性，以MNZ�Es和4�NP作为结构类似物，研究它们在MISPE（或NISPE）上的保留能力。由图5可见，MNZ在MISPE和NISPE上的回收率分别为97.4%和44.3%，说明MIP对MNZ有很高的吸附选择性。然而，MNZ�Es和4�NP在MISPE上的保留能力很差，回收率分别为11.6%和4.3%，它们在NISPE上的回收率分别为5.6%和5.2%。这些化合物在MIP上的吸附主要是非特异性吸附，所以都能被大量淋洗除去。�
　　作为结构类似物的MNZ�Es，具有与MNZ相同的分子结构和官能团，它的回收率略高于4�NP。虽然�4�NP分子中也有能形成氢键的官能团（硝基，羟基）�，但它的形状和大小与MIP中的空穴相差很大，很难与识别位点发生作用。MIP在选择性吸附过程中，目标分子的独特形状和特有功能基团同时起关键作用。�
　　
　　[TS（][HT5”SS]图5 50 mg/L MNZ, MNZ�ester, 4�NP二氯甲烷溶液在MISPE和NISPE上的萃取分离�
　　Fig．5 Extraction profiles obtained with MISPE and NISPE after percolation of dichloromethane spiked with MNZ, MNZ�ester, 4�NP at 50 mg/L （n＝4, RSD＝1.5%～7%）[TS）]
　　
　　3.5 血清样品的测定�
　　在上述条件下，用替代模板分子印迹固相萃取对血清样品的MNZ进行分离富集。血清样品是一个非常复杂的体系，其中的一些蛋白质会影响测试结果，本研究采用氯仿/异丙醇分离血清中的蛋白
　　[FQ（８�２\.22,Y－ＷＺ][HT5”SS][HJ*4]表1 MISPE净化牛血清中MNZ后HPLC分析结果�
　　Table 1 Results from HPLC analysis of MISPE�purified extracts of MNZ�spiked calf serum
　　质。按照MNZ在人体中有效血药浓度（1.0～5.0 mg/L），选取3个浓度配制血清样品，去除蛋白质后用MISPE处理，用HPLC平行测定4次，结果见表1。MNZ分析柱的保留时间为4.98 min，方法的检出限为0.2 mg/L。可见，替代模板MISPE对血清药品中的MNZ较高的萃取回收率（平均值为94.5%），具有一定应用价值。
　　 本研究以自制的甲硝唑酯化物（MNZ�Es）为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，氯仿为致孔剂，合成了高度选择性的替代模板MISPE，实现了血清样品中的MNZ分离富集和检测，解决了模板渗漏。
　　致 谢 Crandield University的Elena V. Piletska在计算机模拟方面给予的帮助
　　
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　　Dummy�template Molecularly Imprinted Polymer for Selective Solid Phase�
　　Extraction of Metronidazole in Bovine Serum
　　
　　TURGHUN Muhammad�*, ABDUKIREM Kadier, HALIDAN Mamat, NILUPAER Abudukeyoumu
　　�
　　�（Key Laboratory of Oil and Gas Fine Chemicals, Ministry of Education and Xinjiang Uyghur Autonomous Region,�
　　College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830046）
　　��
　　�
　　Abstract Metronidazole （MNZ） ester was chosen as a dummy template, methacrylic acid as monomer, ethylene glycol dimethacrylate as crosslinker and chloroform as porogen to synthesize dummy�template molecularly imprinted polymers （MIP） for MNZ. The result of batch rebinding tests showed that imprinting factor of the polymer was 2.02, indicating high recognition ability of the MIP �against� MNZ. MIP adsorption isotherm was fit to Langmuir adsorption model, therefore it was monolayer adsorption, with maximum binding capacity �Q���max� of 116
　　�SymbolmA@ mol/g and binding constant �K� of �0.65 L/mmol�. The �recoveries� of MNZ on MIP and nonimprinted cartridges were 97.4% and 44.3% �respectively� in solid phase extraction （SPE） experiment. However, the analogues of MNZ, MNZ �ester� and 4�nitrophenol, had �recoveries� less than 11.6% on both MIP and NIP in SPE, showing the high selectivity of the dummy template MIP �against� MNZ. The MIP was successfully used for the separation and concentration of MNZ spiked serum sample with mean recovery of 94.5%, which �demonstrated� that MIP was feasible of pre�treatment of MNZ serum sample without template �bleeding.��
　　Keywords Metronidazole; Dummy�template; Molecularly imprinted polymer; Solid phase extraction�
　　（Received 14 April 2011; accepted 6 August 2011）

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