桑树东莨菪素体外抗假丝酵母菌活性初步研究
时间：2021-02-05 04:00:57 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘要：试验运用生长速率法，初步测定了桑树活性物质东莨菪素体外抗假丝酵母菌活性。结果表明，东莨菪素对假丝酵母菌具有明显的抑制作用，其MIC=7.81，作用时间和作用浓度分别在48-72h、500-1000μg/ml间为宜。这为东莨菪素抗菌活性的进一步研究奠定了基础。
关键词：桑树；东莨菪素；假丝酵母菌；生长速率法
中图分类号：S888.2文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-11-0075-2
基金项目：教育部新教师基金项目(20090182120018)、国家现代农业(蚕桑)产业技术体系项目(nycytx-27-gw504)。
0 引言
桑属植物临床应用广泛，药理活性多样，含多种生物活性成分[1]。香豆素类化合物为其中之一，具有抗炎、抗菌、扩张血管、抗凝血、抗血栓、退热、镇静等广泛的药理活性[2]。东莨菪素又名东莨菪内酯，属于简单香豆素类化合物，其化学名为6-羟基-7-甲氧基香豆素，是桑树体内主要的香豆素类化合物[3、4]。
1992年Kashman等[4]首次分离出的香豆素具有抑制HIV逆转录酶活性，同时能够保护人类T淋巴细胞不受攻击。1993年，Ptail等在藤黄科植物Calophyllum inophyllum中发现inophyllums B和inophyHums P，可抑制HIV逆转录酶，IC50分别为38μmol/L和130μmol/L，这两个化合物抑制MOLT-4细胞中HIV复制的IC50分别为1.4μmol/L和1.6μmol/L，治疗指数(TI)分别为39和16。Spino等[6]从藤黄科植物的种子中得到具有强烈抗HIV逆转录酶作用的香豆素化合物costatolide和inophyllums[4-6]。
多种植物在受到微生物侵染或激发子诱导时能够合成香豆素类化合物，因此，在农业上香豆素类化合物东莨菪苷经常作为植保素。早在1960年就发现土豆被感染后会有东莨菪苷的积累。1970s发现被TMV侵染的烟草中也有东莨菪苷的合成和积累。东莨菪内酯2mM能抑制荷兰榆树病菌芽孢的发芽，剂量达4mM时能不可逆地抑制菌丝体的生长[7,8]。沈泳坚等人[9]报道，东莨菪素可以用于剖宫产，不仅对母亲有镇痛作用，而且对婴儿安全有利。张维芳等人[10]证明，东莨菪素在佐治婴幼儿肺炎方面，具有加快血液循环，催进肺部啰音消失等优点，而且其副作用小，安全度大。郭宁等人[11]报道，东莨菪素联合卡马西平治疗难治性癫痫，有一定效果且安全性好。目前，东莨菪素有很好的医药价值，随着对东莨菪素更深入研究，其将得到更广阔的开发和应用。[12]
本实验利用生长速率法，以假丝酵母菌（Candida albicans）为供试菌种，对桑品种嘉陵20号的桑枝中分离提取的东莨菪素的体外抗真菌活性进行了初步检测，这将可能为东莨菪素的进一步研究及其在农业中的利用奠定一定的理论实验基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
东莨菪素（scopoletin），从嘉陵20号桑枝中提取。
1.2 试验方法
1.2.1 药液的准备 配制4、2、1、0.5、0.25 mg/ml五个浓度梯度的东莨菪素溶液。配制0.25mg/ml的酮康唑溶液作为阳性对照，灭菌水为阴性对照。
1.2.2 菌种的准备 将假丝酵母菌接种于液体PDA培养基中27℃150r/min振荡培养24h，取菌液并稀释至105-106cfu/ml，取100μl，均匀涂布在固体PDA培养基上，27℃培养7天，获得菌落。
1.2.3 体外抗菌实验 将东莨菪素溶液与培养基混合，使培养基中东莨菪素的终浓度分别是1000、500、250、125和62.5μg/ml，制成平板，阴性和阳性对照分别用无菌水与62.5μg/ml的氟康唑替代东莨菪素，每个处理设两个重复。无菌条件下，在1.2.2中的菌落中取长势良好且均匀的直径6mm菌饼，将其倒贴在含药培养基中心。27 ℃下培养。每间隔24h，便用十字交叉法精确测量菌落直径三次，取平均值，按照抑制率公式：
抑制率=（阴性对照组-给药组）/阴性对照组×100%计算抑制率
运用SPSS11.5统计软件[13]对数据进行Duncan、LSD多重比较检验和方差分析，标记字母法表示不同浓度的东莨菪素抑菌活性的差异显著性。
1.2.4 MIC的测定 假丝酵母用改良PDA液体培养基培养至对数生长期，然后用相应培养基稀释至A620为0.001；在预先经灭菌处理的96孔板中每个孔加入90μL菌液。东莨菪素用最高浓度为1000μg/ml的溶液倍比稀释，最低浓度为3.91μg/ml，以纯水作为阴性对照，将各浓度的东莨菪素溶液加入96孔板中，10μL/孔，每个处理设置3个重复。并以经灭菌处理的锡箔纸覆盖96孔板。将96孔板在振荡器上轻柔振荡使样品和菌液充分混合，置于摇床(转速为 200 r/min) 30℃培养48h。采用酶标仪测定每个孔的OD值以衡量东莨菪素对假丝酵母生长的抑制作用，东莨菪素对假丝酵母的最低抑制浓度 (MIC) 用[a]–[b]表示，其中[a]代表假丝酵母继续生长的最大浓度，而[b]代表假丝酵母完全被杀灭的最低浓度。
2 结果与分析
每间隔24h，精确测量菌落直径，测三次，取平均值，计算东莨菪素体外对假丝酵母的抑制率随时间的变化，其结果如表1所示。
从表1中数据得知东莨菪素对假丝酵母的抑制率作用随着浓度的增加而增大，其抑制率低于氟康唑阳性对照组，最小抑制浓度在0μg/ml-62.5μg/ml之间且在48-72h左右达到最佳抑制效果。
针对时间和浓度两个变量因素，运用SPSS11.5统计软件对表1中的数据进行方差分析，结果如表2所示。校正模型的平方和与自由度是“时间”、“浓度”两个主效应值之和。F=113.685，P=0.000<0.001，表明该统计分析模型有统计学意义。
同时，时间和浓度的F值分别为13.064、194.182时，P值皆为0，差异极显著，表明药物浓度和培养时间对假丝酵母的抑制率均存在极显著性影响，因此，运用Duncan法，在0.05和0.01两个显著性水平上分别对培养时间和浓度两个因素进行多重比较，采用标记字母法对其进行差异性标示，结果如表3、表4。
从表3中可以看出，48h和72h之间、72h和96h之间无显著差异，但是48h和96h之间存在显著差异，这说明在24h的间隔内，其抗菌效果无差异性，而在间隔48h后才存在显著性差异，因此，在保证抗菌效果的前提下，合适的使用时间在48h-72h为宜。
表4显示出，除了500和250μg/ml之间不存在显著差异外，其他浓度相互之间均存在极显著差异，这说明较高浓度和较低浓度时，浓度的变化都能引起抑制性的显著性变化，因此，根据需要可以选择较高浓度（大于500μg/ml）或者较低浓度（小于250μg/ml）的某一浓度，一般选择使用浓度在500μg/ml-1000μg/ml为宜。
2.2 东莨菪素抗假丝酵母的MIC测定
MIC是描述药物作用的一个重要因子，可为药物的进一步研究及应用提供参考，经过酶标仪测定，东莨菪素抗假丝酵母的MIC=7.81。这与上边的十字交叉法测定平板抑菌圈的方法所得到的数据精确得多。
