miR-M11,基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响
时间：2023-06-30 10:55:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
王伟东，滕 蔓，郑鹿平，刘金玲，张文凯，4，李林燕，4，张志会，樊剑鸣，罗 俊，4
（1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/农业农村部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；
2.郑州大学 公共卫生学院，河南 郑州 450001；
3.河南省农业科学院 中英禽病国际研究中心，河南 郑州 450002；
4.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003）
马立克病病毒（Marek’s disease virus，MDV）是一类具有细胞结合性和嗜淋巴细胞特性的α疱疹病毒，感染宿主鸡可诱发马立克病（Marek’s disease，MD），该病以淋巴细胞增生和内脏肿瘤形成为主要特征[1]。自1907 年该病首次报道[2]后，目前世界范围内均存在MD 的流行，每年给全球家禽养殖业造成了巨大的经济损失[3]。尽管早期使用疫苗免疫雏鸡来防控MD 取得了较好的成效，但随着MDV 毒力的增强，部分流行毒株的毒力突破了现有MD 疫苗的免疫保护，使得MD疫情仍时有暴发[4-8]。
MicroRNA（miRNA）是一类小的非编码RNA 分子，长度22～24 nt。自从LEE等[9]首次在秀丽隐杆线虫中发现lin-4 后，越来越多的miRNA 在动物、植物以及病毒中被发现[10]。这些小分子RNA 在细胞的发育与分化、疾病发生、肿瘤形成等生物学过程发挥重要的调控功能[11-12]。目前已鉴定出500 多个病毒miRNA，其中绝大多数编码于各种人类或动物疱疹病毒基因组中[13]。作为α 疱疹病毒家族的重要成员，血清1 型MDV（MDV-1）编码14 个miRNA 前体基因，可表达加工生成26 个成熟体miRNA，在MDV基因组反转重复序列区中共形成3 个基因簇，即Meq 基因簇、Mid 基因簇和LAT 基因簇[14-15]。虽然少数几个病毒miRNA 已被证明参与调控MDV 的基因表达、肿瘤发生或潜伏感染[16-25]，但大部分MDV miRNA的潜在功能和分子调控机制仍不清楚。
基于成簇的规律性间隔短回文重复序列（Cluster regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）和CRISPR 相关蛋白9（Cas9）系统的基因编辑技术，自2013年首次应用于哺乳动物真核细胞基因编辑以来，因其设计简单、成本低、效率高而被广泛应用于多种生物学研究领域。在病毒学领域尤其是疱疹病毒的基因功能及疫苗研究中，该技术也已展现出巨大的技术优势[26-28]。随着CRISPR/Cas9 系统首次应用于改造MDV 基因组以来，国内外学者通过该系统成功构建了一系列MDV蛋白质编码基因（如meq、pp38、gB）和miRNA 基因编辑缺失毒株[29-34]，为深入研究MDV 的基因功能和致病机制提供了新的技术支撑。鉴于此，以MDV国内分离株HN302 为研究对象，利用CRISPR/Cas9 系统构建HN302 的miR-M11 前体基因缺失毒株，探究miR-M11 缺失后对MDV 体外复制能力的影响，旨在为MDV 编码的miRNA 的调控功能及分子机制研究奠定基础。
1.1 试验材料
鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）由9～10日龄SPF鸡胚制备；
MDV 毒株HN302[7]以及pMD18T-gB/meq/OVO质粒为河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存；
pX459 v2.0 基因编辑质粒、鼠源抗MDV-pp38 单克隆抗体和兔源抗MDV-Meq 多克隆抗体由英国Pirbright 研究所Venugopal Nair教授馈赠；
鼠源抗MDV-gB 单克隆抗体由山东农业大学崔治中教授馈赠。
1.2 主要试剂
M199、Opti-MEM 培养基购自Gibco 公司；
10×Annealing Buffer 购自北京索莱宝科技有限公司；
TransIT-X2®Dynamic Delivery System 购自Mirus Bio公 司；
TIANamp Genomic DNA Kit 和TIANgel Midi Purification Kit 购自TIANGEN 公司；
E.Z.N.A®Endofree Plasmid Mini Kit Ⅱ购自Omega Bio-Tek 公司；
2×Easy Taq®PCR SuperMix、Trans1-T1 感受态细胞购自北京全式金生物公司；
T4 连接酶和BbsⅠ-HF酶购自NEB 公司；
DyLight 488/594 羊抗鼠/兔IgG 购自Abbkine 公司；
pMD-18T 载 体、PrimeScript™RT Master Mix 购 自TaKaRa 公 司；
FastStart Universal SYBR Green®Master（ROX）购 自Roche 公 司；
TaqMan™ MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan Probe、TaqMan™Universal Master Mix Ⅱ、TaqMan®MicroRNA Assays购自Thermo Fisher公司。
1.3 试验方法
1.3.1 gRNA 及PCR 引物设计与合成 利用Benchling（https://www.benchling.com）在线设计软件，分别设计靶向Mid 基因簇miR-M11 茎环结构及其邻近序列的gRNA，其中非G开头的gRNA oligo序列在其5′端加上额外的1 个G，并在序列5′端添加BbsⅠ的酶切位点（表1），gRNA 靶点见图1。利用Premier Primer 5.0 软件设计聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）引物，基因序列见表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司（上海生工）合成。
表1 靶向miR-M11的gRNA及用于鉴定miR-M11缺失株的PCR引物序列Tab.1 gRNA targeting miR-M11 and PCR primer sequences for identification of miR-M11-deleted viruses
图1 MDV编码Mid基因簇miRNA的基因座位及gRNA靶点Fig.1 Genomic location encoding MDV miR-M11 in the Mid-cluster and target sites of gRNAs
1.3.2 pX459-gRNA 质粒的构建 使用BbsⅠ-HF酶切pX459 v2.0 质粒并胶回收载体。使用10×Annealing Buffer 将表1 中的gRNA 互补双链进行复性，利用T4 DNA 连接酶将其连接到pX459 v2.0 载体中，转化Trans1-T1 感受态细胞，涂布LB 平板，过夜培养后挑取单菌落。用Step2-F/Step2-R 引物对进行菌液PCR 鉴定后，送上海生工测序。鉴定连接成功后提取pX459-gRNA质粒，测定浓度后-20 ℃保存备用。
1.3.3 基因编辑效果鉴定 提前准备好24 孔细胞板CEF 单 层，依 据TransIT-X2®Dynamic Delivery System 使用说明，将靶向miR-M11 茎环结构上下游的pX459-gRNA 表达质粒各250 ng 共转染至CEF后，培养24 h。随后将HN302病毒按1 000 pfu/孔感染转染后的CEF，48 h后取50%细胞培养物，将其用1×DNA 提取缓冲液（200 μg/mL 蛋白酶K、10 mmol/L Tris-HCl，pH 值8.0、1 mmol/L EDTA、25 mmol/L NaCl）重悬，置于金属浴中65 ℃30 min、95 ℃5 min后获得细胞培养物总DNA。以其为模板，用Mid-F/Mid-R进行PCR 扩增。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，对目的条带切胶回收后连接pMD-18T载体，并送上海生工测序。
1.3.4 病毒纯化及鉴定 将1.3.3 中转染接毒后的24孔细胞板内剩余50%的CEF重悬，用有限稀释法接种至6孔细胞板CEF 单层。培养3～4 d，观察到明显的病毒噬斑后，显微镜下无菌操作挑取单克隆病毒噬斑，分别转接至24孔细胞板CEF单层中。继续培养2 d 后，按照1.3.3 中所述方法进行PCR 鉴定。选取编辑产物电泳条带较亮的孔，进行下一轮噬斑纯化。3 轮病毒噬斑纯化后，获得miR-M11 编辑缺失的毒株HN302ΔM11。将其连续传代15 次，取第1—5 代、第10 代、第15 代病毒样品，提取DNA 后进行PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定基因缺失毒株的稳定性。
1.3.5 间接免疫荧光试验（IFA）从液氮中取出HN302亲本毒株和miR-M11缺失毒株HN302ΔM11，分别将其转接至24 孔细胞板CEF 单层内。3 d 后，用预冷的甲醇∶丙酮（1∶1，250 μL/孔）固定；
室温固定10 min 后，用含0.05%Tween-20 的PBS（PBST）洗涤3 遍，甩干；
加入含5%脱脂奶粉的PBST，放于37 ℃温箱中封闭。封闭30 min 后，用PBST 洗3 遍，甩干；
加入稀释的MDV-pp38 鼠源单克隆抗体（1∶5 000，200 μL/孔），放于37 ℃温箱中孵育。孵育30 min 后，用PBST 洗3 遍，甩干，加入稀释的荧光二抗DyLight 488 羊抗鼠IgG（1∶1 000，200 μL/孔），放于37 ℃温箱中孵育。孵育30 min 后，用PBST 洗3遍，甩干。随后，再按照以上步骤孵育稀释的MDV-gB 鼠源单克隆抗体（1∶5 000）和稀释的荧光二抗DyLight 594 羊抗鼠IgG（1∶1 000）。PBST 洗3遍后，每孔加入200 μL PBST，放于倒置荧光显微镜下观察结果。
同时，另取一孔平行接毒的细胞，按照上述操作步骤孵育MDV-Meq 兔源多克隆抗体（1∶5 000）、荧光二抗DyLight 488羊抗兔IgG（1∶1 000）、MDV-gB鼠源单克隆抗体（1∶5 000）和荧光二抗DyLight 594羊抗鼠IgG（1∶1 000）。最后用PBST 洗3 遍，每孔加入200 μL PBST，放于倒置荧光显微镜下观察结果。
1.3.6 qPCR 从液氮中取出HN302 亲本毒株和
miR-M11 缺失毒株HN302ΔM11，分别将其转接至6孔细胞板CEF 单层内，3 d 后收取细胞培养物，用TRIzol 法提取细胞培养物总RNA。使用PrimeScript™RT Master Mix 制备cDNA，以此cDNA为模板，使用表1 中荧光定量引物进行qPCR，检测病 毒 蛋 白 编 码 基 因gB、meq、pp38、RLORF4、RLORF5a和ICP4的相对表达水平。以总RNA 为模板，使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和MDV miRNA 反转录引物制备病毒miRNA 的cDNA，使用购自Thermo Fisher 公司的MDV TaqMan探针检测miR-M11-5p、miR-M11-3p、miR-M31-3p、miR-M1-5p、miR-M4-5p 和miR-M13-3p 等6 个病毒miRNA的相对表达水平。
1.3.7 病毒增殖曲线绘制 从液氮中取出HN302
亲本毒株和miR-M11 缺失毒株HN302ΔM11，转接至6 孔细胞板CEF 单层内，500 pfu/孔。病毒感染后，每间隔24 h收取1个孔内的全部细胞培养物（约106个细胞），至病毒感染后144 h 共收集6 次样品。用TIANamp Genomic DNA Kit 提取上述样品DNA，测定DNA 质量浓度后稀释为50 ng/μL，备用。同时，将pMD18T-meq、pMD18T-gB和pMD18T-OVO质粒10 倍倍比稀释后（108拷贝/μL～103拷贝/μL），构建qPCR 标准曲线。取上述病毒感染细胞的DNA样品，使用表1 中列示的荧光定量引物进行qPCR，分别测定2 个毒株在不同时间点gB、meq和OVO的基因拷贝数，并绘制病毒体外增殖曲线。
2.1 pX459-gRNA质粒的构建及鉴定
根据MDV-1编码的Mid基因簇miRNA基因座位及序列（图1），针对miR-M11 前体基因设计2 条gRNA，通过破坏miR-M11的茎环结构实现miRNA基因敲除的目的。将gRNA上下游互补双链gR1F/gR1R和gR2F/gR2R分别复性后与pX459 v2.0载体连接并进行测序。序列比对分析的结果表明（图2），成功构建了2 个靶向miR-M11 的gRNA/Cas9 表达质粒：pX459-gR1和pX459-gR2。
图2 pX459-gRNA重组质粒gRNA连接区域测序结果Fig.2 Sequencing results of the gRNA junction region of pX459-gRNA recombinant plasmids
2.2 基因编辑效率分析
通过pX459-gRNA 转染细胞+病毒感染的方式，将2 个gRNA 表达质粒各250 ng 共转染至24 孔细胞板CEF 单层内，24 h 后感染HN302，病毒感染48 h 后检测基因编辑效果。结果显示，感染病毒的阴性对照仅扩增出1 135 bp 的大条带，而转染了pX459-gR1/gR2 质粒组合并感染HN302 的CEF 中除了扩增出1 135 bp 的大条带之外，还均扩增出841 bp 大小的与预期相符的基因编辑小条带（图3A）。胶回收目的小条带，测序结果显示，该基因片段确为miR-M11 被编辑剪切后的剩余序列，表明gR1 和gR2 有效编辑了病毒基因组。其中gR1 的切割位点为PAM 序列上游4 bp 处，而gR2 切割位点位于PAM 序列上游3 bp 处，与预期完全相符（图3B、图3C）。
图3 miR-M11基因编辑及缺失毒株HN302ΔM11的PCR鉴定及测序分析Fig.3 PCR identification and sequencing analysis of the miR-M11 gene editing and the mutant HN302ΔM11
2.3 病毒纯化及传代稳定性分析
将1.3.3中剩余的50%病毒感染细胞，以不同剂量梯度转接至6孔细胞板内，3～4 d后置于倒置显微镜下操作，挑取96 个单克隆病毒噬斑至24 孔细胞板不同孔CEF 中，培养48 h 后再次消化取样进行PCR 鉴定，选取编辑条带较亮的阳性孔，如上所述进行第2 轮和第3 轮的病毒单噬斑纯化，各随机挑取48 个和24 个单噬斑，最终获得1 株纯化的miRM11 基因编辑缺失毒株，命名为HN302ΔM11（克隆号C58-8-4）。再次测序鉴定的结果与之前相一致（图3B、3C）。将HN302ΔM11 连续传代15 次，然后分别取样进行基因编辑稳定性分析，PCR 扩增鉴定的结果显示，第1—5、10、15 代样品中均只扩增出841 bp大小的基因编辑小条带（图3D），表明基因缺失毒株HN302ΔM11的稳定性良好。
2.4 病毒miRNA和蛋白质编码基因的表达分析
为分析Mid 基因簇miR-M11 的缺失是否影响其他 miRNA以及病毒蛋白编码基因的表达，用HN302 和HN302ΔM11 分别感染CEF，3 d 后收取细胞培养物，提取总RNA 后反转录为cDNA。使用TaqMan 探针法检测Mid 基因簇中miR-M11-5p、miR-M11-3p、miR-M31-3p、miR-M1-5p、miR-M4-5p 和miR-M13-3p 的相对表达水平。使用SYBR Green 法检测gB、meq、pp38、RLORF4、RLORF5a和ICP4的相对表达水平。以miR-M13-3p 为内参分析的结果显示，亲本株HN302 的miRNA 均可正常表达，而HN302ΔM11 的miR-M11-5p 和miR-M11-3p 均未检测到表达，其余miRNA 均可表达（图4）。以ICP4为内参基因分析的qPCR 结果显示，HN302ΔM11 和亲本株的gB、meq、pp38、RLORF4和RLORF5a均正常表达（图 5）。
图4 HN302和HN302ΔM11感染CEF中部分病毒miRNA的相对表达水平Fig.4 Relative expression levels of MDV miRNAs in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs
图5 HN302和HN302ΔM11感染CEF中部分病毒蛋白编码基因的相对表达水平Fig.5 Relative expression levels of MDV protein-coding genes in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs
2.5 miR-M11基因缺失毒株的IFA鉴定结果
为分析miR-M11 的缺失是否影响MDV 噬斑形成及病毒蛋白的表达，用特异性抗MDV gB、pp38和Meq 蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体分别孵育HN302 和HN302ΔM11 感染的CEF 细胞，进行IFA染色。结果显示，在荧光显微镜下，HN302 和HN302ΔM11 的绿色荧光染色的pp38 蛋白或Meq 蛋白均与红色荧光染色的gB 蛋白所指示的病毒噬斑形成良好的共定位（图6）。以上结果表明，miRM11的编辑缺失不影响MDV 的噬斑形成及gB、Meq和pp38蛋白的正常表达。
图6 HN302和HN302ΔM11感染CEF中的gB、Meq和pp38蛋白表达的IFA分析Fig.6 IFA analysis of the gB，Meq and pp38 protein expressions in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs
2.6 miR-M11基因缺失毒株体外增殖曲线绘制结果
为测定miR-M11 的缺失是否影响MDV 的增殖，将HN302 和HN302ΔM11 分别感染6 孔细胞板CEF 单层，并在感染后24～144 h 内每间隔24 h 收集1份样品，提取总DNA 后检测不同时间点MDV 基因gB、meq以及宿主OVO基因的拷贝数，计算等量细胞内病毒基因拷贝数并绘制病毒体外增殖曲线。结果显示，与亲本毒株HN302 相比，HN302ΔM11 的增殖速度更快，在等量接种感染CEF 后96 h 和120 h，基因缺失毒株的病毒增殖量均显著高于亲本毒株（图7）。表明miR-M11 的编辑缺失显著增强了MDV的体外复制能力。
图7 HN302和HN302ΔM11在CEF中的增殖曲线Fig.7 Growth kinetics of HN302 and HN302ΔM11 viruses in CEFs
作为一种致瘤性α 疱疹病毒，MDV 在研究病毒致病和肿瘤形成机制中扮演重要角色。过去几十年里，为研究MDV 编码的基因功能，利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）技术，已构建了多种不同毒株的感染性BAC 克隆[35-37]。随后利用Rec E/T 同源重组技术，可在BAC 克隆的基础上进一步对目的基因进行敲除或敲入。近年来，利用该技术对MDV 编码的miRNA 功能进行研究也陆续报道[16，18-19]。但是，疱疹病毒基因组很大，BAC克隆的构建过程比较耗时费力，操作步骤烦琐且Rec E/T 同源重组的效率较低。为方便突变体的筛选，往往还会在病毒基因组中插入外源的抗性筛选基因，如果作为疫苗候选毒株还需要进一步将其从基因组中剔除。此外，在研究miRNA 功能时，因剔除抗性筛选基因后残余的重组序列元件如FRT 的大小与miRNA 相似，也会对miRNA 重组毒株的筛选和鉴定造成很大的困难。
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的出现解决了BAC克隆和Rec E/T 同源重组技术的一些难题，因其构建过程简单，可直接靶向病毒基因组且编辑效率非常高，不会将外源片段残留至病毒基因组内，很快在病毒学领域的基因功能研究及疫苗研发中得到了广泛的应用[26-28]。本研究利用CRISPR/Cas9系统，采用双重敲除策略，构建2 个gRNA 靶向MDV 国内分离株HN302 编码的miR-M11 基因，构建了1 株稳定的miR-M11 基因编辑缺失毒株HN302ΔM11。病毒体外增殖曲线测定的结果显示，HN302ΔM11 在感染CEF 后96 h 和120 h 的病毒基因组拷贝数均显著高于其亲本毒株HN302，这与此前报道的GXΔmiR-M11 和RB-1BΔmiR-M11 基因缺失毒株的相关研究结果一致[19，33]。上述研究进一步证实，miR-M11 不仅不是病毒复制的必需基因，将其编辑缺失反而可以显著增强MDV 的体外复制能力。但是miR-M11编码的miRNA是直接调控MDV的病毒基因从而影响病毒增殖，还是通过靶向宿主基因及相关信号通路来调控细胞的增殖和/或凋亡以调节病毒复制，仍需要进一步深入研究。
在MDV-1 编码的3 个miRNA 基因簇中，研究较多的是Meq 基因簇的miRNA。其中miR-M4-5p已被证实是宿主癌基因miR-155 的病毒同功分子，可能作为MDV 促癌因子参与肿瘤的形成；
敲除Meq基因簇的其他miRNA（miR-M2、miR-M3、miR-M5、miR-M9和miR-M12）后，肿瘤的发生率也都显著降低，表明Meq 基因簇的miRNA 在MD 肿瘤形成过程中发挥着重要作用[16-18]。Mid 基因簇和LAT 基因簇的miRNA 研究较少，其中Mid 基因簇miR-M31-3p的缺失也可显著降低病毒的致病性和致瘤率，显示出与miR-M4-5p 相似的调控功能[19]。前人研究表明，敲除GX0101 的miR-M4-5p 后，miR-M11 的表达水平明显增加[18]。而本研究中发现miR-M11 被编辑缺失后，miR-M4-5p 和miR-M31-3p 的表达水平则显著提高（P＜0.05），这表明miR-M11 与另外2个miRNA 的表达水平在MD 发病或肿瘤发生过程似乎保持着相互的制约和平衡，miR-M11 很可能作为抑瘤基因参与调控MD 肿瘤的形成。总之，本研究利用CRISPR/Cas9 基因编缉技术对HN302 的miR-M11 进行编辑和缺失，构建1 株稳定的miRM11 缺失毒株，为后续研究MDV 编码miRNA 的调控功能及分子机制奠定了重要基础。
