维生素D3对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠氧化应激的保护作用研究
时间：2023-06-29 21:10:01 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
余跃 杨涛涛 俞璐
自身免疫性甲状腺炎又称桥本甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT），是一种器官特异性自身免疫性疾病，是最常见的甲状腺疾病之一。目前尚无有效措施能延缓这种甲状腺炎症的发展[1-2]。HT 的发病机制主要涉及细胞和体液免疫，但导致甲状腺组织破坏的病理机制仍未阐明[3-4]。近年来研究表明，氧化应激导致的甲状腺组织损伤、细胞凋亡等在HT 发病过程中扮演关键角色[5-6]。研究发现，实验性自身免疫性甲状腺炎（experimental autoimmune thyroiditis，EAT）模型大鼠体内存在明显的氧化应激紊乱[7]。因此，使用适宜抗氧化制剂可能是HT 治疗的一个新思路。诸多研究证实，维生素D 除了具有调节钙磷及骨代谢等作用外，还具有抗氧化应激、免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多种医疗价值[8-9]，如通过减少活性氧、增加抗氧化能力来减轻糖尿病肾病、酒精性肝损伤、脑缺血再灌注损伤等疾病中的氧化应激反应，从而发挥组织保护作用[10-12]。目前关于HT 患者体内缺乏维生素D 的报道逐渐增多，提示维生素D 可能参与了HT 的发生、发展，补充维生素D 或有助于HT 相关症状的缓解[13-15]，但是维生素D 治疗和改善HT 的作用机制还未见报道。本研究构建EAT 大鼠模型并予维生素D3药物干预，观察甲状腺组织烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶亚基p22phox、gp91phoxmRNA 和蛋白表达的变化，血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平的变化，来探究维生素D3对HT 患者氧化应激的保护作用机制。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠30 只，体质量（200±10）g，雌雄各半，购于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养及实验均在宁波大学实验动物中心（SYXK[浙]2019-0005）进行。实验方案通过宁波大学实验动物伦理委员会伦理审查。
1.1.2 主要试剂 维生素D3粉剂（纯度98%）购自上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C12700602；
猪甲状腺球蛋白（porcine thyroglobulin，PTg）购自北京酷尔化学科技有限公司，批号：20211223；
不完全弗氏佐剂（incomplete Freund"s adjuvant，IFA）和完全弗氏佐剂（complete Freund"s adjuvant，CFA）购自美国Sigma 公司，批号分别为SLCB8702、SLBW7430；
甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）和甲状腺球蛋白抗体（thyroid globulin antibody，TgAb）ELISA试剂盒购自美国Thermo 公司，批号分别为EHTPO、EHTG；
SOD、GSH-Px 和MDA 测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，批号分别为20220507、20220506、20211214；
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自美国Proteintech 公司，批号：10494-1-AP；
anti-p22phox抗体购自美国GeneTex 公司，批号：GTX133970；
antigp91phox抗体购自英国Abcam公司，批号：ab129068；
Trizol 购自美国Invitrogen 公司，批号：235005；
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔抗体和二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为A0208、P0010；
聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）转印膜购自美国Millipore 公司，批号：R9NA96863。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组和处理 大鼠适应性喂养1 周，随机分为5 组，每组6 只。正常对照组不作处理，其余4 组参照张杰等[7]方法造模。取0.05 ml PTg 溶液（2 g/L）与CFA 按体积比1∶1 混合，乳化成油包水乳剂；
取100 μg 乳化的PTg 多点皮下注射大鼠，作为初次免疫，第2 周起每周再取0.05 ml 注射，作为加强免疫，共加强免疫4 次。造模完成后24 h，正常对照组和模型对照组均给予蒸馏水10 ml/（kg·d）灌胃，维生素D3高剂量（200 μg/L）组、维生素D3低剂量（20 μg/L）组给予10 ml/（kg·d）维生素D3灌胃，共给药5 周。维生素D3预防（200 μg/L）组自造模开始即给予10 ml/（kg·d）维生素D3灌胃，共给药9周。
1.2.2 大鼠血清指标检测 末次给药6 h 后，所有大鼠麻醉后心脏取血6 ml，3 000 r/min 离心10 min，取上层血清。采用ELISA 法，按试剂盒说明书测定血清TPOAb、TgAb 水平；
采用羟胺法测定血清SOD 活性，采用比色法测定血清GSH-Px 活性，采用硫代巴比妥酸法测定血清MDA 水平。
1.2.3 大鼠甲状腺组织p22phox、gp91phoxmRNA 表达的检测 采用qRT-PCR 法。大鼠取血后颈椎脱臼处死，解剖并迅速取出双侧甲状腺，pH 7.4 PBS 研磨制备组织匀浆液，按试剂盒说明书方法提取各组大鼠甲状腺组织总RNA 并合成cDNA，采用qRT-PCR 法检测，根据2-ΔΔCt法计算mRNA 的表达水平。引物序列见表1。
表1 引物序列
1.2.4 大鼠甲状腺组织p22phox、gp91phox蛋白表达的检测 采用Western blot 法。取大鼠部分甲状腺组织，加入RIPA 裂解液匀浆，提取总蛋白，SDS-PAGE 电泳，转PVDF 膜后分别加anti-p22phox抗体和anti-gp91phox抗体，4 ℃孵育过夜，TBST 漂洗3 次，加入HRP 标记二抗，室温1 h，ECL 显影、曝光，使用ImageJ 软件进行蛋白质灰度分析，以GAPDH 为参照，计算p22phox、gp91phox蛋白相对表达量。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD t 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 5 组大鼠血清TgAb 和TPOAb 水平比较 相比正常对照组，模型对照组TgAb 和TPOAb 水平均显著升高（均P＜0.05）。相比模型对照组，维生素D3低剂量组TgAb 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），TPOAb 也降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。相比模型对照组和维生素D3低剂量组，维生素D3高剂量组及预防组TgAb、TPOAb 水平均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。相比维生素D3高剂量组，维生素D3预防组TgAb 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
表2 5 组大鼠血清TgAb、TPOAb 水平比较（IU/ml）
2.2 5 组大鼠血清SOD、GSH-Px 活性和MDA 水平比较 相比正常对照组，模型对照组SOD、GSH-Px 活性均显著降低，MDA 水平显著升高（均P＜0.05）。相比模型对照组，维生素D3低剂量组、高剂量组和维生素D3预防组SOD、GSH-Px 活性均显著升高，MDA 水平均显著降低（均P＜0.05）。与维生素D3低剂量组比，维生素D3高剂量组SOD、GSH-Px 活性上升，MDA 水平下降，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）；
维生素D3预防组SOD 活性显著升高（P＜0.05），GSH-Px 活性和MDA 水平比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），见表3。
表3 5 组大鼠血清SOD、GSH-Px 活性和MDA 水平比较
2.3 5组大鼠甲状腺组织中p22phox和gp91phoxmRNA 水平比较 相比正常对照组，模型对照组p22phox和gp91phoxmRNA水平均显著升高（均P＜0.05）。相比模型对照组，维生素D3低剂量组、高剂量组和维生素D3预防组p22phox和gp91phoxmRNA 水平均显著降低（均P＜0.05）。相比维生素D3低剂量组，维生素D3高剂量组和预防组p22phox-mRNA 水平均显著降低（均P＜0.05），gp91phoxmRNA 水平下降，但差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表4。
表4 5 组大鼠甲状腺组织p22phox、gp91phox mRNA 水平比较
2.4 5 组大鼠甲状腺组织中p22phox和gp91phox蛋白相对表达量比较 相比正常对照组，模型对照组p22phox、gp91phox蛋白相对表达量均显著升高（均P＜0.05）。相比模型对照组，维生素D3低剂量组gp91phox蛋白相对表达量显著降低（P＜0.05），p22phox蛋白相对表达量降低但差异无统计学意义；
维生素D3高剂量组和维生素D3预防组p22phox、gp91phox蛋白相对表达量均显著降低（均P＜0.05）。相比维生素D3低剂量组，维生素D3高剂量组和维生素D3预防组p22phox、gp91phox蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图1。
图1 5 组大鼠甲状腺组织中p22phox、gp91phox蛋白相对表达量比较（A：蛋白相对表达量；
B：蛋白电泳图）
TgAb 和TPOAb 作为甲状腺自身抗体，在HT 发病和病程进展中具有重要作用，HT 的特征表现为高滴度的TgAb 和TPOAb。李心爱等[16]综述了维生素D 与HT的关系后发现，HT 自身抗体上调可能是维生素D 水平的下降导致，提示补充维生素D 或许可降低TgAb、TPOAb 滴度。刘思琪等[17]通过Meta 分析研究了HT 患者补充维生素D 治疗后甲状腺自身抗体水平的变化，结果发现维生素D 补充治疗6 个月，HT 患者TgAb、TPOAb 水平显著下降。本研究发现EAT 大鼠TgAb 和TPOAb 水平均显著升高，经维生素D3干预后TgAb 和TPOAb 水平均显著降低，且高剂量维生素D3效果优于低剂量、提前预防给药效果优于正常给药，可见维生素D3能通过降低HT 自身抗体滴度来减少对甲状腺组织的破坏，延缓病程进展。
NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）家族中，同源物NOX1-5和双氧化酶1-2（dual oxidase1-2，DUOX1-2），拥有共同的亚基p22phox和gp91phox，是体内活性氧的主要来源[18]。研究表明NADPH 氧化酶活性升高会产生过多活性氧，可引发氧化应激损伤并导致人体多种疾病的发生、发展[19-21]。因此，抑制NADPH 氧化酶的过度激活有望成为治疗多种疾病的潜在作用靶点。徐申[22]在细菌内毒素所致急性肾损伤的研究中发现，模型小鼠肾脏NADPH 氧化酶亚基gp91phox和p47phox明显上调，维生素D3预处理能明显抑制这种上调，并减轻细菌内毒素引起的肾脏氧化应激损伤。Cui 等[23]对外伤脑损伤大鼠模型给予维生素D 类似物骨化三醇治疗，结果发现大鼠海马组织NOX2活性降低，从而减少了NOX2依赖的NADPH 氧化酶活性，减轻了大脑神经元的损伤。本研究中EAT 模型大鼠甲状腺组织中NADPH 氧化酶亚基p22phox和gp91phoxmRNA 水平和蛋白相对表达量明显增加，经维生素D3干预后，两者表达明显受到抑制，减轻过度氧化对甲状腺组织的损伤。提示维生素D3对HT 的治疗作用机制可能是通过下调NADPH氧化酶的活性而实现。
氧化应激紊乱除会产生过量活性氧外，还与抗氧化酶活性降低、脂质过氧化程度增加及抗氧化能力的减弱密切相关。Wang 等[24]构建了急性肝损伤和维生素D 缺乏型急性肝损伤大鼠模型，比较两种模型的抗氧化酶水平发现，维生素D 缺乏组大鼠SOD 和GSHPx 活性明显降低、MDA 水平显著升高，导致该组大鼠肝酶显著升高、肝组织坏死明显，表明维生素D 缺乏加重了急性肝损伤的氧化应激反应。刘军等[25]对瘦素受体基因纯合突变（leprdb/db，db/db）小鼠进行了有氧运动治疗、维生素D 治疗及有氧运动联合维生素D 干预治疗，观察不同组小鼠肝脏抗氧化活性变化，结果发现，相比对照组，各干预组SOD 和GSH-Px 活性均显著升高，MDA 水平均显著降低，表明运动或/和维生素D 干预能通过提高肝脏抗氧化酶活性，从而降低肝细胞的氧化应激作用。本研究发现EAT 大鼠模型抗氧化能力明显下降，SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 水平升高；
给予维生素D3治疗和预防均能明显提高抗氧化酶的活性，相比低剂量组，预防组SOD 活性明显升高，提示维生素D3能通过增强抗氧化水平来纠正HT 的氧化应激紊乱，从而发挥对甲状腺应激损伤的保护作用。
综上所述，EAT 大鼠存在自身抗体水平升高和明显的氧化应激紊乱，补充维生素D3能显著降低TgAb 和TPOAb 水平，减轻氧化应激损伤，包括下调NADPH 氧化酶亚基p22phox、gp91phoxmRNA 水平和蛋白相对表达量，减少活性氧产生，提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA 水平，增加抗氧化能力，从而减少对甲状腺组织的破坏和损伤，延缓自身免疫性甲状腺炎疾病的进展。补充维生素D3可为预防和治疗HT提供新的思路和方法。
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