麻脸蘑菇发酵液的化学成分研究
时间：2023-06-29 18:00:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
程子芥,兰嘉豪,刘晓敏,魏 婕,梅 瀚,曹金凤,刘世巍,丁建海
(宁夏师范学院 化学化工学院,宁夏 固原 756099)
真菌(Fungi)是一种具有真核的、产孢的和无叶绿体的微生物.它包含霉菌、酵母、蕈菌以及其他人类所熟知的菌菇类.真菌不但具有食用价值,其次生代谢产物还具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等生物活性[1-3].正因如此,真菌的代谢产物研究已成为现代科学家们关注的焦点.菌物中子实体体积较大的一类真菌被称为高等真菌或大型真菌,通常称为蘑菇.高等真菌主要分为子囊菌和担子菌.高等真菌属于“创造系数”很高的生物资源,它们所含的次生代谢产物结构多样且新颖,这种化学结构多样性对于现代药物和农药先导化合物的发现至关重要.此外高等真菌菌种可以长期保存,很多种类易发酵培养,一旦发现有应用价值的化合物,将有可能通过发酵方法解决资源来源问题[4].
麻脸蘑菇(AgaricusvillaticusBrond)又名麻脸菇,隶属于担子菌门、蘑菇科和蘑菇属的高等真菌,主要生长于春天到秋天的草原上,单生到群生.麻脸蘑菇主要分布于宁夏、新疆、吉林、西藏、山西、内蒙古和甘肃等地,有很高的食用价值[5-7].然而其中的化学成分尚不明确.本文研究的麻脸蘑菇采自宁夏师范学院古雁校区内,经过液体发酵培养,从其发酵液的乙酸乙酯提取物中分离出7个化合物.分别鉴定为(22E,24R)-5,8-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇、2-苯乙醇、2,3-丁二醇、甘油三酯、邻苯二甲酸二丁酯、正十五烷酸和甘油.
1.1 试剂
牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨和大豆琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司),乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚和甲醇(国药集团化学试剂有限公司),香草醛、浓硫酸、氘代氯仿、氘代甲醇、80～100目和200～300目柱层层析硅胶(上海麦克林生化科技有限公司),HSGF254薄层色谱硅胶预制板(烟台维启化工产品有限公司),Sephadex LH-20凝胶(瑞典 Amersham Biosciences公司).
1.2 仪器
Bruker DRX-500 MHz型和 Bruker AV-400 MHz型超导核磁共振仪(德国Bruker公司),AutoSpec Premier P776型三扇型双聚焦磁质谱仪(美国Waters公司),ZF-20D型暗箱式紫外分析仪(上海光豪分析仪器有限公司),FA2204B型电子天平(上海声源超声波仪器设备有限公司),DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司),FA2204B型电子分析天平(上海精科天美科学仪器有限公司),RE-2000A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),WAC-60型全自动高压蒸汽灭菌锅(大韩科学有限公司),HR-Ⅱ A2型接种工作台(青岛海尔特种电器有限公司),SKY-2112C型超特大容量恒温培养摇床(上海苏坤实业有限公司),1260 Infinity II Prime型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司).
1.3 菌种的培养与液体发酵
1.3.1 培养基的制备
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)由马铃薯20 g(煮20 min后过滤)、葡萄糖2 g、琼脂2 g和蒸馏水100 mL配制而成,在高压灭菌锅中于121℃灭菌30 min.
改良马丁培养基由葡萄糖15 g、磷酸氢二钾0.15 g、蔗糖30 g、硫酸镁0.15 g、酵母粉1.5 g和蒸馏水300 mL配制而成,在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌30 min.
1.3.2 菌种的分离与纯化
采用组织分离法来分离纯化菌丝体.将麻脸蘑菇子实体菌柄剪短,用75%乙醇进行表面消毒.在无菌环境下用火焰灭菌的手术刀纵向切开麻脸蘑菇子实体,取菌伞和菌柄连接部分约绿豆大小的子实体组织块,迅速接种到PDA平面培养基上,将培养基置于28℃恒温培养箱中,观察2周.
当麻脸蘑菇子实体组织块周围长出菌丝体后,在无菌环境下用高温灭菌的接种铲挑取外围生长最旺盛的菌丝体,用三点法接种于PDA平面培养基上.置于28℃恒温培养箱中,观察菌丝和菌落的形态,判断是否为单一菌落.若无单一菌落则按上述步骤继续纯化,直至纯化出单一菌落,将单一菌落转接至PDA斜面培养基保存.
1.3.3 液体发酵
菌种活化需在无菌环境下,将保存于PDA斜面培养基的麻脸蘑菇菌丝体转接到PDA平面培养基上,置于28℃恒温培养箱中,直至菌丝体长满平板再进行液体发酵培养.
液体发酵培养要在无菌环境下,打开已活化好的平板,用经过火焰灭菌的接种铲将长有菌丝的培养基切成9 mm×9 mm的菌饼,分别接入提前灭菌完毕的改良马丁培养基中并封口(每个液体培养基接入一个菌饼).总计接种发酵100瓶共30 L.将完成接种的培养基置于恒温摇床中,在28℃,180 r/min条件下发酵25天.
1.4 发酵液的提取与分离
将发酵物用纱布过滤,分离菌丝体和菌液.其中菌丝体用甲醇-乙腈(v/v 1∶1)浸泡,并将其置于超声清洗仪中超声破壁1 h,再用纱布过滤,分离菌丝体和滤液,将滤液减压浓缩得菌丝体提取物.重复提取菌丝体3次,合并提取物.菌液减压浓缩后和菌丝体提取物合并,然后加入去离子水稀释,再用乙酸乙酯萃取5次,将萃取液合并,浓缩得浸膏15.8 g.
乙酸乙酯层浸膏用柱层析法分离,洗脱剂以石油醚-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱,期间逐步增加乙酸乙酯组分的比例至纯乙酸乙酯,用薄层色谱法检测洗脱产物,再合并相同部分,最终得到5个组分P1～P5.
P1经正相硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯 v/v 10∶1)洗脱,Sephadex LH-20凝胶柱(乙酸乙酯)纯化,得化合物a邻苯二甲酸二丁酯(5.8 mg),以石油醚/乙酸乙酯 v/v 4∶1洗脱,Sephadex LH-20凝胶柱(乙酸乙酯)纯化,得到化合物b正十五烷酸(6.9 mg).
P2经正相硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯v/v 3∶1)洗脱,Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇)分离纯化,得到化合物c (22E,24R)-5,8-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(15.3 mg).
P3经正相硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇v/v 30∶1)洗脱,得到化合物d 2-苯乙醇(9.5 mg),用二氯甲烷/甲醇 v/v 20∶1洗脱,Sephadex LH-20凝胶柱(二氯甲烷/甲醇 v/v 1∶1)纯化,得到化合物e 2,3-丁二醇(6.6 mg).
P4经正相硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇v/v 20∶1)洗脱,Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇)纯化,得化合物f 甘油三酯(22.5 mg).
P5用高效液相制备色谱仪(Pursuit XRs 10 μm C18 250×10.0 mm,25℃,水/乙腈 v/v 1∶1,流速3 mL/min)按固定比例的洗脱剂洗脱,分离纯化得化合物g 甘油(tR= 8.53 min,8.7 mg).
化合物a为邻苯二甲酸二丁酯,其性状是白色粉末.质谱显示其分子量为m/z301.1400 [M+Na]+,进而推测该化合物的分子式C6H22O4,不饱和度为6.如图1与图2所示,化合物a的1H NMR中δH3048 Hz(H-3,6)和3008 Hz (H-4,5)两组信号峰的峰面积相同,表明该化合物是二取代苯环衍生物.13C NMR中δC16770 Hz (COO -)信号表明该化合物存在酯基,同时δC6550 Hz (C-1′,1″)说明该C原子和酯基中的O原子相连.其余碳信号均在高场区分布,结合碳信号数量表明该化合物有丁基碳链,同时根据氢谱中氢信号的比例,可判断该化合物有2条丁基碳链,呈对称分布.进一步查阅文献得知,上述数据与文献[8]报道一致,因此鉴定化合物a为邻苯二甲酸二丁酯,其结构式如图3所示.
图3 邻苯二甲酸二丁酯的结构式
化合物b为正十五烷酸,其性状是无色油状物.质谱显示其分子量为m/z483.2173 [2M-H]-,进而推测该化合物的分子式C15H30O2,不饱和度为1.如图4与图5所示,化合物b的13C NMR中δC18020 Hz (C-1)为羧酸信号,δH500 Hz (H-4～14)之间大量的氢信号说明该化合物是脂肪酸.结合碳谱与质谱确定该化合物含有15个碳信号.进一步查阅文献得知,上述数据与文献[9]报道一致,因此鉴定化合物b为正十五烷酸,其结构式如图6所示.
图6 正十五烷酸的结构式
化合物c为(22E,24R)-5,8-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇,其性状是白色针状晶体.质谱显示其分子量为m/z429.3208 [M+H]+,进而推测该化合物的分子式C28H44O3,不饱和度为7.如图7与图8所示,化合物c的1H NMR中δH3250 Hz (H-6)与3120 Hz (H-7)为一对双键上的H,并且双键α位和O原子相连.13C NMR中δC10287.5 Hz (C-5)和9937.5 Hz (C-8)也证明了这一点.该信号为过氧麦角甾醇的特征峰.进一步查阅文献得知,该化合物数据与文献[10]报道一致,因此鉴定化合物c为(22E,24R)-5,8-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇,其结构式如图9所示.
图9 (22E,24R)-5,8-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇的结构式
化合物d为2-苯乙醇.其性状是淡黄色油状物.质谱显示其分子量为m/z267.2329 [2M+Na]+,进而推测该化合物的分子式C8H10O,不饱和度为4.如图10与图11所示,化合物d的1H NMR中δH3660 Hz(H-3′,4′,5′)和3620 Hz (H-2′,6′)信号表明该化合物是单取代苯环衍生物.1H NMR中δH1935 Hz (H-1)和1440 Hz (H-2)为2个亚甲基信号而且均为3重峰,表明2个亚甲基相连,而且其中一个亚甲基δH1935 Hz (H-1)和羟基相连,另一个亚甲基与苯环相连.进一步查阅文献得知,上述数据与文献[11]报道一致,因此鉴定化合物d为2-苯乙醇,其结构式如图12所示.
图12 2-苯乙醇结构式
化合物e为2,3-丁二醇.其性状是淡黄色油状物.质谱显示其分子量为m/z203.0791 [2M+Na]+,进而推测该化合物的分子式C4H10O2,不饱和度为0.如图13与图14所示,化合物e的1H NMR中δH1360 Hz (H-2,3)和312 Hz (H-1,4)的峰面积比例为1∶3,而且δH1360 Hz (H-2,3)为多重峰,δH312 Hz (H-1,4)为双峰,结合DEPT图谱可知δC7040 Hz (C-2,3)为连O次甲基,1640 Hz (C-1,4)为甲基.进一步查阅文献得知,上述数据与文献[12]报道一致,因此鉴定化合物e为2,3-丁二醇,其结构式如图15所示.
图15 2,3-丁二醇结构式
化合物f为甘油三酯.其性状是黄色油状物.如图16与图17所示,化合物f的1H NMR中δH516 Hz处有大量信号,表明该化合物含有脂肪链结构.13C NMR中δC6880 Hz (C-2)与6210 Hz (C-1,3)为甘油的特征峰.而δC17320 Hz (C-4,4′′)和17280 Hz (C-4′)处的信号显示该化合物存在3个酯基.进一步查阅文献得知,上述数据与文献[13]报道一致,因此鉴定化合物f为甘油三酯,其结构式如图18所示.
图18 甘油三酯结构式
化合物g为甘油.其性状是淡黄色油状物.质谱显示其分子量为m/z185.0124 [2M+H]+,进而推测该化合物的分子式C3H8O3,不饱和度为0.如图19与图20所示,化合物g的1H NMR中两组氢信号峰面积为1∶4.结合13C NMR中δC7380 Hz (C-2)和6430 Hz (C-1,3)表明该化合物有2个亚甲基和1个次甲基,而且均与O原子相连.进一步查阅文献得知,上述数据与文献[14]报道一致,因此鉴定化合物g为甘油,其结构式如图21所示.
图21 甘油结构式
本文采用柱层析法,高效液相色谱法对麻脸蘑菇发酵液提取物进行分离,从中得到7个化合物.通过核磁共振波谱仪及高分辨质谱仪确定了化合物的结构.经鉴定分别为邻苯二甲酸二丁酯、正十五烷酸、(22E,24R)-5,8-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇、2-苯乙醇、2,3-丁二醇、甘油三酯和甘油.所有化合物均为首次从麻脸蘑菇中分离得到.麻脸蘑菇作为一种食用菌,含有丰富的营养物质,本文初步研究了其中发酵液的化学成分,为麻脸蘑菇的进一步开发利用提供了理论依据.
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