核富集转录体1、肌细胞增强因子2D在子宫内膜癌中的表达及其与预后的相关性*
时间：2023-06-29 16:50:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
白雪, 任雪慧, 常颖, 李爱明, 赵婧
延安市人民医院妇产科(陕西延安 716000)
子宫内膜癌(Endometrial cancer，EC)是子宫体部最常见的恶性肿瘤。全球每年死亡例数高达7.6万例，是我国女性癌症相关死亡的第二大原因[1]。外科手术是早期EC患者治疗最有效的治疗方案，而对于晚期转移性EC患者，即使经积极手术及放化疗等综合治疗，患者的临床预后仍然较差[2]。通过分子遗传学等手段寻找EC发病机制中的分子基础，有助于对不同分子特征的EC患者进行个体化诊治，以改善临床预后[3]。核富集转录体1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)是一种长链非编码RNA，基因位于人类11号染色体，存在于细胞核中，形成了散斑亚细胞器的核心结构成分。近年来发现，在前列腺癌及乳腺癌等恶性肿瘤中均存在NEAT1异常表达上调的现象，其作为一种原癌基因，通过激活细胞周期素依赖的激酶19的磷酸化，肿瘤细胞的过度增殖及转移[4- 5]。肌细胞增强因子2D (myocyte enhancer factor 2D，MEF2D)基因位于人类1号染色体，是肌细胞特异性增强因子2家族成员，参与控制肌肉和神经元细胞的分化和发育调节[6- 7]。研究表明，MEF2D在肝细胞肝癌、胰腺癌等恶性肿瘤中表达上调，其作为一种致癌因子，能够激活AKT通路，介导肿瘤细胞的免疫逃逸，促进肿瘤细胞的恶性增殖及转移[8- 9]。目前EC中NEAT1、MEF2D的表达及临床预后价值尚不明确，本研究检测EC中NEAT1、MEF2D表达，探讨相关的机制，研究潜在的临床应用价值。
1.1 一般资料 选择以2016年3月至2018年3月间我院91例手术治疗EC患者的临床资料进行回顾性研究。
纳入标准：(1)EC诊断符合病理学检查标准；
(2)患者为初次诊断；
(3)患者临床资料不完整或不愿意纳入本研究。
排除标准：(1)合并心肺功能障碍；
(2)合并其他恶性肿瘤；
(3)合并自身免疫系统疾病，如系统性红斑狼疮等。
患者年龄36～67岁，平均(55.4±6.4)岁；
肿瘤直径：≤5 cm者 60例，>5 cm者31例；
肿瘤分化程度：高中分化49例，低分化42例；
肿瘤FIGO分期：Ⅰ期67例，Ⅱ期24例；
伴肌层浸润33例，无58例；
伴淋巴结转移20例，无71例。本研究符合《赫尔辛基宣言》，我院伦理委员会审核批准通过。
1.2 免疫组化检测MEF2D蛋白表达 将组织放入甲醛固定液中过夜。石蜡包埋后进行切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡两遍；
梯度酒精水化；
柠檬酸缓冲液中微波炉加热10 min进行抗原热修复；
3%双氧水去除内源性过氧化物酶；
一抗4度过夜 (MEF2D稀释比1∶200，购自Abcam公司，货号ab282731)；
二抗室温2 h；
DAB显色20 s；
苏木素染核20 s；
梯度脱水封片。染色评分根据镜下阳性表达部位的染色强度(0：无染色，1：染色浅，2：染色深)及染色面积(0：≤25%，1：25%～50%，2：≥50%)对蛋白表达进行评估。染色评分<2分为阴性表达，≥2分为阳性表达。
1.3 荧光定量PCR检测组织中NEAT1、MEF2D mRNA的表达 取约100 mg组织，液氮研磨组织后，Trizol提取总RNA，分光光度计测RNA浓度介于500～1 000 ng/μL时，然后进行反转录为cDNA。荧光定量PCR引物见表1。PCR引物由华大公司设计合成。条件为：程序一：94℃预变性4 min；
程序二：94℃变性20 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸34 s，程序二共40个循环。体系为20 μL，cDNA 2 μL，正向和反向引物各1 μL，SYBR GREEN premix 10 μL，DEPC水6 μL。独立重复实验3次，结果取平均值，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算NEAT1、MEF2D mRNA相对表达量。以NEAT1、MEF2D mRNA相对表达量的平均数1.752,1.514为界，分别分为NEAT1高表达组(n=46)、低表达组(n=45)，MEF2D高表达组(n=44)、低表达组(n=47)。
表1 引物序列
1.4 随访 所有患者自出院后开始随访，以门诊或电话方式进行随访，内容为患者生存情况，随访3年，随访截止日期2021年3月31日，随访终点为患者出现死亡或随访时间结束。
1.5 统计学方法 用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计数资料用率(%)表示，组间分析采用2检验。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。相关性采用Pearson相关分析。Kaplan-Meier生存分析不同NEAT1、MEF2D mRNA表达与患者预后的关系。单因素及多因素COX回归分析影响EC患者预后的因素。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 组织NEAT1、MEF2D mRNA表达 NEAT1、MEF2D mRNA在EC癌组织中的相对表达量分别是(1.752±0.312)、(1.514±0.308)，NEAT1 mRNA、MEF2D mRNA在EC癌旁组织中的相对表达量分别是(0.437±0.056)、(0.556±0.078)。EC癌组织中NEAT1 mRNA、MEF2D mRNA的表达明显高于癌旁组织(t=39.574、28.763，P=0.000、0.000)，见图1。
图1 NEAT1、MEF2D mRNA在癌和癌旁组织中的表达比较
2.2 组织MEF2D蛋白表达 EC癌组织中MEF2D蛋白棕褐色阳性表达主要定位于细胞核。EC癌组织中MEF2D蛋白阳性表达率为73.6%(67/91)，明显高于癌旁组织21.98%(20/91)(2=48.643，P=0.000)。见图2。
图2 EC癌及癌旁组织中MEF2D蛋白表达(苏木素×20)
2.3 NEAT1、MEF2D mRNA表达与EC患者临床病理参数的关系 不同肿瘤FIGO分期的EC患者NEAT1、MEF2D mRNA的表达差异有统计学意义(均P<0.05)，而EC患者不同年龄、不同肿瘤直径、不同肌层浸润深度、不同分化程度及不同淋巴结转移状态之间差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。
2.4 NEAT1、MEF2D mRNA表达相关性 利用Pearson相关分析发现，EC癌组织NEAT1和MEF2D mRNA表达呈显著正相关(r=0.591，P=0.000)。见图3。
2.5 NEAT1、MEF2D mRNA表达与EC患者预后的关系 EC患者随访过程中无失访，死亡18例，3年生存率为80.2%(73/91)。NEAT1高表达组和低表达组的3年总体生存率(OS)分别为71.74%(33/46)、88.89%(40/45)；
MEF2D高表达组和低表达组的3年总体生存率(OS)分别为70.5%(31/44)、89.36%(42/47)，Kaplan-Meier分析(log-rank 检验)表明：高NEAT1、MEF2D mRNA表达组生存率均明显低于低NEAT1、MEF2D mRNA表达组患者(2=5.318、5.420，P=0.021、0.018)。见图4。
2.6 单因素及多因素COX回归分析影响EC患者预后的因素 以EC患者的生存为因变量(1=死亡，0=存活，t=时间)，以年龄(赋值：1=≥60岁，0=<60岁)、肿瘤直径(赋值：1=≥5 cm，0=<5 cm)、肌层浸润(赋值：1=有，0=无)、淋巴结转移(赋值：1=有，0=无)、分化程度(赋值：0=高中分化，1=低分化)、肿瘤分期(赋值：赋值1=Ⅱ期，0=Ⅰ期)、NEAT1 mRNA(赋值1=高表达，0=低表达)、MEF2D mRNA(赋值1=高表达，0=低表达)为自变量，进行单因素及多因素COX回归分析。结果，肿瘤FIGO分期Ⅱ期、NEAT1高表达、MEF2D mRNA高表达是影响EC患者不良预后的独立危险因素。
见表3、4。
表2 NEAT1、MEF2D mRNA表达与EC患者临床病理参数的关系
图3 NEAT1、MEF2D mRNA表达相关性分析
EC是常见的妇科恶性肿瘤。多种危险因素参与EC的发生发展，包括过度雌激素使用、绝经期延迟、不育、多囊卵巢综合征等。虽然多数早期EC患者可进行外科手术治疗，对于无法切除的EC或合并症严重的患者，多采用激素疗法、放疗或化疗等，但治疗疗效较差，患者长期生存预后不佳[10]。研究EC的疾病发生机制，对于探索新的EC治疗方案，具有重要意义。
图4 Kaplan-Meier生存分析NEAT1、MEF2D mRNA表达与EC患者预后的关系
表3 影响EC患者预后的单因素COX比例风险回归模型
表4 影响EC患者预后的多因素COX比例风险回归模型
近年来全基因组研究表明，大约70%的人类基因组被转录为RNA，而只有不到2%的人类基因组编码蛋白质。现在已经知道非编码RNA包括短的和长的lncRNA。LncRNA是长度超过200个核苷酸的非编码RNA。越来越多的证据表明，lncRNA在癌症中异常表达并在肿瘤发生中起关键作用，包括影响细胞周期进程，凋亡和转移[11- 12]。NEAT1是一种新型的lncRNA，定位于核染色质间具有不规则形状的核旁斑。NEAT1在包括前列腺癌、结直肠癌和胃癌等许多人类恶性肿瘤中上调，通过激活下游癌基因的表达，促进肿瘤的进展[5, 13-14]。本研究中，EC中NEAT1表达升高，其调控机制尚不明确。Zhang 等[15]研究表明，NEAT1的表达受到甲基转移酶烷基化修复同源蛋白5(ALKBH5)的表达调控，ALKBH5能够抑制NEAT1启动子的甲基化程度，促进NEAT1的表达，导致肿瘤浸润转移。此外，NEAT1作为一种长链非编码RNA，受到N6-甲基腺苷(m6A)的修饰调节，有学者发现，肿瘤中NEAT1存在4个m6A修饰位点，m6A修饰的NEAT1其RNA稳定性显著升高，进而促进肿瘤的过度增殖[4]。NEAT1的表达升高与较高的肿瘤分期相关，提示EC中NEAT1的高表达能够促进EC的疾病进展。Ma等[16]研究表明，NEAT1与DNA甲基转移酶1相互作用，通过抑制cGAS/STING途径来抑制肿瘤微环境中细胞毒性T细胞的活化和浸润，抑制其肿瘤杀伤能力及抗肿瘤免疫能量，导致肿瘤免疫逃逸。此外，尚有学者报道，肿瘤细胞中NEAT1作为分子支架，促进PGK1/PGAM1/ENO1 复合物的组装，抑制葡萄糖的有氧氧化，促进糖酵解，导致肿瘤代谢重编程，进而促进肿瘤的恶性增殖及转移[5]。本研究生存分析发现，EC组织中 NEAT1 mRNA高表达患者的生存预后较差，并且是患者不良预后的独立危险因素，提示NEAT1是一种新的预后相关肿瘤标志物，临床医生可根据NEAT1的表达情况，对不良预后的高危EC患者进行积极治疗和随访，延长患者的生存时间和生活质量。
MEF2D属于MEF2家族转录因子，在肌肉和心脏的发育中发挥重要的功能[17]。随后发现MEF2D与人类癌症的发生和发展有关。研究表明，急性淋巴细胞白血病中由染色体易位产生的MEF2D/DAZAP1和DAZAP1/MEF2D融合蛋白可以促进急性淋巴细胞白血病细胞的恶性增殖[18]。此外，细胞实验中亦证实，MEF2D的过表达可通过促进血管内皮生长因子的表达，促进肿瘤血管新生，进而促进肝癌细胞的增殖，并通过促进转化生长因子-β自调节途径促进肝癌细胞的侵袭和转移[8]。然而，MEF2D在EC的发生和发展中的确切作用仍不清楚。本研究发现，MEF2D在EC中mRNA和蛋白表达均明显增加，可能与MEF2D的转录后调控异常有关。有学者在EC肿瘤细胞系HEC-50中发现，微小RNA-361能够结合MEF2D mRNA，降低MEF2D mRNA的稳定性，但肿瘤发生时微小RNA-361表达下调，导致MEF2D显著升高[19]。此外，EC癌组织中MEF2D的表达与肿瘤分期有关，表明MEF2D的高表达促进EC的肿瘤进展。Xu 等[20]学者报道，MEF2D的高表达，促进肿瘤细胞中Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活，进而促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，增强肿瘤细胞的恶性侵袭及转移能力，导致肿瘤进展。此外，尚有学者发现，肿瘤中MEF2D的表达上调能够促进程序性死亡配体1的表达，进而抑制肿瘤杀伤性T淋巴细胞的激活及肿瘤杀伤效应，导致肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤的进展及转移[9]。本研究进一步分析发现，MEF2D mRNA高表达的EC患者生存预后较差，并且是患者不良预后的独立危险因素，表明检测MEF2D有助于判断EC患者的临床预后，MEF2D可作为新的EC预后相关肿瘤标志物。本研究通过相关性分析发现，EC癌组织中NEAT1与MEF2D的表达呈正相关。目前两者之间的直接相互作用尚不清楚，但有研究发现，NEAT1能够作为分子海绵结合并抑制微小RNA-361，微小RNA-361的表达下调导致其下游靶基因MEF2D mRNA稳定性增强，导致MEF2D蛋白表达显著增高，进而促进肿瘤进展[19]。
综上所述，子宫内膜癌中NEAT1与MEF2D表达上调，NEAT1与MEF2D之间表达呈正相关，两者与肿瘤分期相关。EC中NEAT1与MEF2D的高表达提示患者不良生存预后。本研究尚存在一定的不足之处，由于样本量有限，难以对不同EC患者进行分层分析，有待今后扩大样本量进一步研究。
利益相关声明：所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献说明：白雪负责实验设计、数据分析、论文撰写;任雪慧，常颖负责数据分析、修改;李爱明负责文字校对、全文检查; 赵婧负责指导。
猜你喜欢赋值因素蛋白L-代数上的赋值榆林学院学报(2022年4期)2022-08-02解石三大因素中国宝玉石(2019年5期)2019-11-16强赋值幺半群上的加权Mealy机与加权Moore机的关系*计算机与生活(2018年8期)2018-08-15猪胎盘蛋白的分离鉴定中成药(2017年8期)2017-11-22利用赋值法解决抽象函数相关问题オ理科考试研究·高中(2016年9期)2016-05-14短道速滑运动员非智力因素的培养冰雪运动(2016年4期)2016-04-16自噬蛋白Beclin-1在胆囊癌中的表达及临床意义中国现代医学杂志(2015年26期)2015-12-23SAK －HV 蛋白通过上调 ABCG5／ABCG8的表达降低胆固醇的吸收医学研究杂志(2015年7期)2015-06-22C-Met蛋白与HGF蛋白在舌鳞癌细胞中的表达及临床意义西安交通大学学报（医学版）(2015年2期)2015-02-28P2×Cn的友好标号集绍兴文理学院学报(自然科学版)(2013年2期)2013-12-19
