草田轮作模式下土壤微生物群落结构和多样性分析

荣梓玉，凌键，李惠霞，张莉，张园园，王乐

（1. 甘肃农业大学植物保护学院，甘肃 兰州 730070；
2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100089；
3. 中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010）

由于内蒙古地区海拔较高，夏季冷凉，已成为了我国最大的马铃薯主产区［1］，但随着特色农业的发展和产业结构的调整，连作现象也越来越普遍，连作后的土壤为病原菌提供了很好的寄生和繁殖的场所，使得病原菌数量递增，从而造成了土壤中有益菌数量大量的减少。且多年的连作，造成马铃薯多种病害特别是土传病害的发生日益严重，如马铃薯黄萎病、枯萎病、黑痣病、黑胫病、腐烂茎线虫病、疮痂病和粉痂病等在各马铃薯主产区发生严重，从而导致土壤有机质的含量有所降低，造成马铃薯的产量降低，影响了武川县农业生态系统的可持续发展，由于内蒙古武川地区海拔较高，夏季冷凉，已成为了我国最大的马铃薯主产区［2］。马铃薯属于浅根系植物对连作障碍十分敏感，多年连作后，马铃薯病害发生逐年加重［3］。草田轮作是提高农业产量以及土壤质量的栽培耕作方式之一［4］，世界上草田轮作主要分布于冷凉湿润、畜牧业比重大的地区，例如西北欧、北欧、苏联西北部、美国东北部的五大湖地区。随着畜牧业的发展，在英国曾长期实行的诺尔福克式轮作（又称四圃式轮作）逐步演变为包含有3～4 a 牧草的草田轮作，如牧草→牧草→牧草→麦类→马铃薯→马铃薯→麦类→麦类→麦类。不同轮作系统间群落的组成、丰度的变化和微生物多样性存在显著差异［5］。而细菌是土壤微生物中分布最广、数量最多的部分，占土壤微生物总数的70%～90%，是土壤养分变化的敏感指标之一。因此，了解内蒙古武川地区不同茬口牧草微生物多样性及其差异，对当地马铃薯等作物的安全生产具有重要意义。本试验拟观测不同月份细菌群落的优势种类的分布和变化，了解4 种牧草种植前后土壤微生物结构组成及其变化规律，为当地马铃薯轮作制度的建立提供理论依据。

黑燕麦（Avena strigosa）作为主要的牧草之一，其生物学特性与燕麦相似，我国主要以河北、内蒙古等地为主产地。现多地区开始采用种1 a 黑燕麦之后轮作其他农作物［6］，研究发现，这样不但可以有效的利用黑燕麦收获后充足的光热资源，并且可以有效的提高土地利用率，是一种充分利用光热资源、种养结合的新种植模式［7］。燕麦（Avena sativa）是一年生禾本科作物，是我国及世界上重要的农作物之一，广泛分布于东北、华北和西北等地区，由于燕麦的耐寒耐旱的生物学特性，在我国高海拔地区广泛种植，也解决了高寒地区农牧饲料短缺的问题［8］。箭筈豌豆（Vicia sativa）也叫“野豌豆”，一年生或越年生草本植物，是常见的饲草作物之一，耐寒、抗旱、适应性强，但不耐盐碱、不耐渍，同时也可以固氮并且丰富土壤营养、提高土壤肥力等优点受到广大农牧民的欢迎［9］。毛苕子（Vicia villosa）是一年生或越年生的豆科草本植物，耐寒性极强，可在-30 ℃的环境中生存［10］，所以很适合高寒地区的种植，也是高寒地区常见的饲草之一，一般用于秋播或在作物行间间作，可以有效的提高作物的产量和品质，且可以保护生态环境［11］。

1.1 采样点基本情况

武川县位于内蒙古自治区呼和浩特市北部，属于中温带大陆性季风气候，冬季严寒多雪，夏季雨量充沛，历年平均降水约为354.1 mm。昼夜温差及冬夏温差较大，年平均气温3.0 ℃，气候特点是日照充足。海拔1 800～2 200 m，三面环山构成了武川盆地，由于这样的气候环境所以武川县适合黑燕麦、燕麦、箭筈豌豆和毛苕子这4种牧草的生长，以及当地主要的农作物为马铃薯。

1.2 土壤采样及土壤样品处理

试验地位于内蒙古呼和浩特市武川县境内，N 41°10′37″，E 111°22′31″。由于草田轮作通常选取豆科牧草或者禾本科牧草进行单播或混播，所以选取这4种牧草为试验对象。采样地前2 a都种植的是马铃薯，由于连作2 a马铃薯，所以今年种植以上4种牧草。采样地是由24 块3 m×3 m 的小区组成的一块土地，小区间距为1 m，坡度相同以及土壤类型也相同，每种牧草都在同一块土地并有6个重复，采用三点取样法采集土样，用取样器采取作物根周0～30 cm 土壤，三点小样组成一个混合样，每种牧草共采取6个混合样。分别于2021年5～9月进行采样并对每个月进行时期编号（表1），每个月的采样步骤相同，样品混成一点后先进行编号（表2），例如：黑燕麦A1～A6，然后用镊子挑出石粒、杂草、根系以及凋落物碎屑，放入无菌塑封袋，记录采集信息，带回实验室，于-80 ℃冰箱保存备用。

表1 采样时间基本情况Table 1 Basic information of sampling time

表2 牧草土土壤样品名称及编号Table 2 Names and numbers of soil samples

1.3 数据处理与分析

选用土壤DNA试剂盒（MagPure Soil DNA LQ Kit）提取牧草根周土壤细菌DNA，采用Nanodrop对DNA 进行定量后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量。牧草根周土壤细菌使用前引物序列（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和后引物序列（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）对16S rRNA在V3～V4 可变区进行PCR 扩增测序，扩增条件为98 ℃预变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环，72 ℃延伸5 min。由上海派森诺生物科技有限公司采用Illumina平台测序。

测序后，按照下列程序分析土壤细菌生物学信息。第一步将双端16S rRNA 扩增子序列reads 拼接，把质滤后的数据除去正向和反向引物序列，使用Vsearch［12］的fastq_mergepairs 模块拼接序列以及使用fastq_filter 模块对拼接序列进行质控，接着将reads去冗余并保留拷贝数大于2的reads，然后在相似度为97%的条件下进行聚类［13］，16S rRNA 在除去嵌合体后基于greengenes 数据库进行物种分类，除去不符合的OTU（operational taxonomic units，即操作分类单元），最后在相似度为97%的条件下构建OTU 表格，并在各水平（门、纲、目、科、属、种）统计每一个样品的群落组成。使用Qiime 软件（ver⁃sion1.9.1）生成不同分类水平上的丰度表，并进行Al⁃pha多样性指数（Chao1、Shannan、Simpson、ACE）的计算。基于 Wilcoxon秩和检验分析组间差异指数，以P<0.05 作为差异显著性筛选阈值［14］。使用R（version4.0.5）的edgeR［15］包、ggplot2［16］包及vegan［17］等包对微生物的差异富集、绘制图表或散点图及非度量多维尺度进行分析。

2.1 不同牧草根周土壤的测序结果分析

测序结果显示，5个时间点黑燕麦、燕麦、箭筈豌豆和毛苕子的有效序列数见表3如下显示，土样中总共得到细菌总有效序列依次为黑燕麦1 672 976条、燕麦1 526 841 条、箭筈豌豆1 299 510 条和毛苕子1 514 492 条，其中，黑燕麦的有效序列数最多，比箭筈豌豆增多了22.32%，比毛苕子增多了9.47%，比燕麦多了8.73%。

表3 不同牧草5个时期土壤的有效序列数Table 3 The effective sequence number of soil in 5 periods of different forages

2.2 不同牧草根周土壤细菌群落结构

2.2.1 不同牧草根周土壤OTU数 如图1，在5个时间点中黑燕麦（A）的细菌OTU总数为13 176条、燕麦（B）的细菌OTU 总数为12 114 条、箭筈豌豆（C）的细菌OTU总数为11 587条以及毛苕子（D）的细菌OTU 总数为12 153 条。其中4 个样品中共同拥有的OTU总数为5 827条。其中黑燕麦特有的细菌OTU总数最多，比箭筈豌豆多12.05%，比燕麦多8.06%，比毛苕子多7.76%，也说明了黑燕麦中含有特有微生物种类较多。

图1 细菌OTUs分布Venn图Figure 1 Venn graph of bacteria OTUs distribution

2.2.2 不同牧草根周土壤细菌的门水平群落结构 由图2 可知，在门的水平，4 种牧草土壤微生物占优势的细菌差异不显著，其中放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）及芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等为优势菌门。细菌的各门之间相对丰度差异较小，如放线菌门在燕麦（B）中的相对丰度最高，为57.25%，箭筈豌豆（C）的相对丰度最低，为53.62%，从高到低依次排序为：燕麦（B）>黑燕麦（A）>毛苕子（D）>箭筈豌豆（C）。在变形菌门中，细菌相对丰度从高到低依次排序为，箭筈豌豆（C）>黑燕麦（A）>毛苕子（D）>燕麦（B），但其他门细菌在4种牧草间相对丰度差异不显著。软壁菌门（Tenericutes）是黑燕麦中特有，GN04是燕麦中特有的细菌门，箭筈豌豆和毛苕子中无特有的细菌门。

图2 4种牧草土壤的细菌群落在门水平上的相对丰度Figure 2 Relative abundance of bacterial communities at phylum level in four pasture soils

2.2.3 不同牧草根周土壤细菌属水平群落结构黑燕麦（A）、燕麦（B）、箭筈豌豆（C）和毛苕子（D）土壤微生物分别包含了485、472、459和463个细菌属，由图3可知，鞘氨醇单胞菌属（Kaistobacter）、科氏游动 菌 属（Couchioplanes）、假 诺 卡 氏 菌 属（Pseudonocardia）、盐单胞菌属（Halomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、红色杆菌属（Rubrobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、气微菌属（Aeromicrobium）及分枝杆菌属（Mycobacterium）的相对丰度较高，其中鞘氨醇单胞菌属为相对丰度最高的菌属，分别占2.35%、2.73%、2.25%和2.39%，总体而言，4种牧草的土壤微生物在属的水平上差异不明显，相似度较高。

图3 4种牧草土壤的细菌群落在属水平上的相对丰度Figure 3 Relative abundance of bacterial communities at genus level in four pasture soils

2.3 不同牧草根周土壤细菌多样性分析

2.3.1 Alpha 多样性分析 Alpha多样性是用于测量微生物群落之间的种类数量，可以反映微生物群落之间通过竞争资源或者利用同种生境而产生的共存结果。稀释曲线一般用于样品测序量是否达到饱和的评估，如果样品测序深度增大但曲线斜率平滑，证明测序量已达到饱和，如果再增加，Alpha 多样性指数也不会有显著变化以及各个指数都达到稳定的程度。如图4为每种牧草在不同时期的稀疏曲线，可以发现样品在3 000 OTU左右达到饱和。图5为每种牧草在同一时期的稀疏曲线。由于t1时期是种植牧草前的时期，所以只能用种植牧草后的4个时期来表示。可以发现，样品在2 000～3 000 OTU 时达到饱和，这也说明作物的Alpha多样性趋于稳定。

图4 四种牧草在不同时期的Alpha多样性稀释曲线图Figure 4 Rarefaction curves of Alpha diversity of four forages species at different times

图5 四种牧草在相同时期的Alpha多样性稀释曲线图Figure 5 Rarefaction curves of Alpha diversity of four forages species at the same times

Chao1指数和ACE指数是用来估计微生物群落含OTU 数目的指数，Simpson 指数和Shannon 指数是反映微生物多样性的指数之一，Simpson 指数越大，说明群落多样性就越低，而Shannon 指数越大，说明群落多样性越高。Coverage是指样品文库的覆盖率，其指数越高，样品中没有被测出的概率就越低。由表4可知，相比于黑燕麦，燕麦、箭筈豌豆和毛苕子的微生物多样性指数（Shannon指数和Simpson指数）均比黑燕麦少，其中黑燕麦的Chao1 指数和ACE 指数也均高于其他3 种牧草，可以说明黑燕麦的土壤微生物丰富度最高，Coverage 值都在0.98 以上，说明结果比较真实以及可以更好的反应出4种牧草土壤微生物多样性。

表4 不同牧草根周土壤微生物alpha多样性指数Table 4 Alpha diversity index of soil microorganisms around root of different crops

2.3.2 Beta 多样性分析 Beta 多样性是衡量微生物群落之间的差别，可以更好的描述生境内的微生物种类的数量，可以将同一样品与不同样品不同条件下的比较，也可以反映不同样品的群落组成的相似性及差异性。如图6，4 种牧草在5 个时期的差异是比较显著的（P<0.05），可以看出，箭筈豌豆的差异不像其他3种牧草那么明显，但一般来说，每种牧草都是随时间变化的，反映了Beta 的多样性是不同的，而这种差异是由于时间的变化造成的。如图7，同一时期4种牧草的差异是非常显著的（P<0.05）。由于t1时期是种植牧草前的时期，所以只能用种植后的4 个时期来表示。从t2到t5的趋势是t2时期各组聚集在一起，t3～t4期逐渐开始分离，最后t5时期各组显著分散。不同牧草的土壤样品分布在相同地区，说明4 种作物土壤微生物在不同时期的变化存在显著差异，土壤细菌群落结构也存在显著差异。因此，不同牧草的栽培显著影响了土壤细菌群落的组成。

图6 四种牧草在不同时期Beta多样性的CCA分析图Figure 6 CCA diagram of Beta diversity of four forages in different periods

图7 四种牧草在相同时期Beta多样性的CCA分析图Figure 7 CCA diagram of Beta diversity of four forages in the same period

土壤微生物是微生态系统的重要组成部分，也是草田轮作模式的重要影响因子之一，每种牧草在不同时期的生长阶段中，土壤微生物的组成以数量也发生一定的变化。由于5月是未种植牧草的时期，所以微生物多样性以及丰富度相对较低，6～8 月是牧草的生长期，随着牧草迅速的生长，土壤中的养分转化比较快，土壤中的微生物的数量也迅速增多，其中8月是微生物数量最多的时期，9月是牧草收获后的时期，所以土壤微生物数量明显降低，土壤微生物数量从5 月到9 月呈现的是先增加后降低的变化规律。与连作相比，轮作改变了微生物的环境因子，更有利于作物根系生长以及对土壤的养分吸收，从而促进微生物的生长和繁殖，因此草田轮作的方式的土壤微生物数量高于作物的连作方式。4种牧草土壤细菌群落在门水平上的优势菌进行分析，结果发现放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门以及芽单胞菌门为门水平上优势菌门，而这些优势菌在很多植物的土壤中都有富集［18］，也可以说明该地土壤具有一般土壤微生物优势菌群组成的共性，只是它们的占比大有不同。据研究，放线菌类在土壤中可以促使动植物的残骸腐烂［19］，提高植物抗病性以及抑制病原菌的生长［20］，在氮素循环中起着至关重要的作用。变形菌门的微生物多为兼性或者专性厌氧及异养生活微生物［21］；
酸杆菌门在土壤中可降解植物残体、参与单碳化合物代谢［22］。以及大部分土壤优势菌都或多或少对土壤起着重要的作用。4种牧草土壤细菌群落在属水平上的优势菌属进行分析，结果发现鞘氨醇单胞菌属、科氏游动菌属、盐单胞菌属以及芽孢杆菌属等为优势菌属，据研究，鞘氨醇单胞菌属是一种新型的生物资源，其中最显著的一个特征为降解单环或者多环芳香族化合物［23］，可以利用鞘氨醇单胞菌属的这些芳香族化合物提供碳源进行生长，以及其他菌属之间互相影响互相制约，形成稳定的生态环境。

通过Alpha和Beta多样性的分析，4种牧草土壤微生物的细菌群落丰富度和多样性分析存在着较明显的差异，4 个时期的CCA 在随时期的变化而变得差异越来越显著，根据试验得出，土壤微生物多样性以及丰富度在季节上的变化很明显，大部分表现为夏季或者天气炎热的时候要明显显著于其他季节或时期。合理轮作是防止土壤连作障碍发生的有效途径，根据Alpha多样性结果分析，黑燕麦的土壤微生物多样性、丰富度和微生物数量要比其他3种牧草有显著差异，所以黑燕麦与马铃薯的轮作方式相比于其他3种轮作方式来说是最好选择。

本研究发现，4种牧草的土壤微生物群落组成相对稳定，细菌多样性与群落结构在不同时期或者不同季节中存在着很显著的差异。结果显示，黑燕麦的土壤微生物多样性及丰富度显著高于其他3种牧草，并且土壤生物活性显著提高，土壤微生物增多，从而维持或提高草田轮作的土壤质量，达到农田生态系统可持续经营的目的。因此，黑燕麦与燕麦、箭筈豌豆以及毛苕子相比，黑燕麦轮作马铃薯的模式细菌群落多样性显著高于其他模式，将有利于保持土壤微生物多样性及丰富度，也提高了土地的利用率和利用效率。

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