TIPE2,在透明细胞肾细胞癌中的表达和意义
时间：2023-06-26 13:00:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
齐建军，杨麦青，张林，汪钊，王艳峰
（1.昌邑市人民医院肾内科，山东 昌邑 261300；
2.昌邑市人民医院病理科，山东 昌邑 261300；
3.潍坊市人民医院/潍坊医学院第一附属医院病理科，山东 潍坊 261041；
4.北大荒集团总医院病理科，黑龙江 哈尔滨 150088）
肾细胞癌（renal cell carcinoma）是指肾脏上皮细胞发生的恶性肿瘤，是全世界最常见的肿瘤之一。据报道[1]，2021 年美国有76 080 例新病例和13 780例死亡病例，近几年肾细胞癌的发病率呈现逐年增加的趋势。透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常见的肾细胞癌亚型，约占肾细胞癌的70%[2]。目前，手术治疗对局限性ccRCC患者是最有效的治疗方式[3]。CcRCC 常伴有von Hippel-Lindau（VHL）基因缺失或突变，随着个体化靶向治疗的发展，多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI）和雷帕霉素哺乳动物靶点（mTOR）抑制剂的应用已成为ccRCC 治疗的重大突破[4]。尽管在癌症研究和药物研发方面取得了重大进展，但对于复发和转移的ccRCC 患者目前尚无有效的治疗手段，ccRCC 伴有远处转移的患者生存率仍然很低[4，5]。因此，寻找该病早期诊断、治疗和评估预后的有效分子靶标意义重大。肿瘤坏死因子α 诱导蛋白8（TNFAIP8）样蛋白家族由4 个成员组成，即结构高度相似的TNFAIP8、TIPE1、TIPE2 和TIPE3。它们在不同的生物学行为中发挥不同的作用，并参与癌症发生发展的过程[6，7]。TIPE2 位于染色体1q21.2-1q21.3，TIPE2 主要在淋巴组织和骨髓组织中表达[7，8]，参与机体细胞免疫调节。并与炎症、自身免疫病、肿瘤等疾病的进展密切相关[9，10]。研究表明[11-13]，TIPE2 在结肠癌、肺癌、肾癌组织中呈高表达。另外，在胃癌、肺癌中TIPE2 的表达却明显降低[14，15]。本文主要探讨TIPE2对ccRCC 增殖和侵袭过程中的作用，分析TIPE2 对Wnt 信号通路关键蛋白的影响，以期为ccRCC 的诊断和治疗提供参考。
1.1 资料来源 数据库：利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）在线数据库获取和分析TIPE2 在ccRCC 和正常肾组织中的表达差异和患者预后评估。细胞：本研究所用ccRCC 细胞786-O 细胞系购自中国科学院上海细胞库，按照细胞库官方网站提供的标准培养条件培养。
1.2 方法
1.2.1 TIPE2 的数据库资料分析 TIPE2 在ccRCC 和正常肾组织中表达情况和临床病理资料等数据来源于在线数据库UALCAN。在预后分析中，将获取样本分为高表达组（TPM 值高于上四分位数）和低/中表达组（TPM 值低于上四分位数）。具体操作步骤：进入主页后输入TNFAIP8，在TCGA datase 对话框内找到透明细胞肾细胞癌；
在新打开的页面点击expression，然后在对话框内选择Sample types，将图保存；
在expression 界面再次选择Nodal Metastasis status，保存图片；
返回上一页面，点击survival，图片保存。
1.2.2 细胞转染 将786-O 细胞放入六孔板并置于37 ℃含5.0%CO2孵箱培养24 h，使细胞密度达80%～90%。pCMV6-TIPE2 质粒、对照空载体pCMV6质粒、TIPE2 ShRNA 序列和对照shRNA 购自GENECHEM（中国上海）。取2.5 μg 质粒根据Lipofectamine3000（Thermo Fisher Scientific，Inc.）说明书进行转染。
1.2.3 Western Blot 实验 收集细胞加入RIPA 裂解液，提取蛋白并测定蛋白含量，取40 μg 蛋白样品，加入SDS-PAGE 电泳，转至PVDF 膜后在5%脱脂牛奶中常温封闭1 h，加入抗体TIPE2（1:1000，Pro teintech）、GSK3β（1:500，Proteintech）、cyclinD1（1∶500，Proteintech），β-catenin，active-β-catenin，c-Myc 和GAPDH（1∶1000，Proteintech）4 ℃冰箱过夜。第2天，与辣根过氧化物酶结合的小鼠/兔IgG（1:2000，Proteintech）在37 ℃下孵育2 h。最后用ECL（Thermo Fisher Scientific，Inc.）观察各蛋白条带，并拍照留存。以GAPDH 作为细胞内蛋白对照，使用Image J1.47 软件分析各条带相对蛋白质的表达水平。
1.2.4 集落形成试验 转染48 h 后，将细胞消化到6 cm的细胞培养皿（1000 个细胞/皿）中并培养14 d。PBS冲洗3 次，加预冷的甲醇固定15 min，室温下用苏木素染液处理10 min，利用成像仪取图，计数超过50 个细胞的集落（直径＞0.2 cm），使用GraphPad Prism 6.0 软件对数据进行统计分析。
1.2.5 细胞增殖试验 转染24 h 后，将细胞消化到96孔板（3000 个细胞/孔，100μl 细胞悬浮液）中培养。24 h 后，将20 μl 的CCK-8（Dojindo Molecular Technologies，Inc.）溶液添加到每个孔中，用锡纸包裹，培养2 h。用分光光度法450 nm 测定细胞增殖结果。接下来的4 d 每天都在同一时间进行CCK8加药处理，在37 ℃恒温箱中避光孵育2 h，利用GraphPad Prism 6.0 软件进行数据统计分析，并按时间-吸光度（X-Y）值绘制增殖曲线。
1.2.6 基质凝胶TM侵袭试验 使用24 孔小室，小室底部有8 μm 孔（Costar，美国）。根据说明，在4 ℃的冰箱中提前融化基质凝胶。以1∶7 的比例混合基质凝胶（1∶7 稀释，BD Biosciences，美国），放于上室中。转染24 h 后，将1×105个细胞接种到上室（无血清培养基），并在下室中加600 μl 含有10%胎牛血清的培养基作为引诱剂。20 h 后，在室温下用甲醇固定小室20 min，苏木素染色10 min。随机选择5 个高倍视野，在显微镜下计数侵袭细胞的数量（×20）。
1.3 统计学方法 使用统计学软件SPSS 19.0、GraphPad Prism 6.0 进行数据分析。计量资料以（）表示，行t检验、Kaplan-Meier 进行分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
2.1 TIPE2 mRNA 和蛋白水平在ccRCC 和正常组织中的表达差异及TIPE2 与ccRCC 预后的关系ccRCC 组织中TIPE2 mRNA 水平和蛋白质表达高于正常肾组织（P＜0.05），见图1A、图1B；
另外，与无淋巴结转移（N0）的ccRCC 相比，伴有区域淋巴结转移（N1）的ccRCC 中TIPE2 的表达升高（P＜0.05），见图1C。根据在线数据库UALCAN 的Kaplan-Meier分析，TIPE2 高表达患者总生存期短于低表达患者（P＜0.05），见图1D。
图1 TIPE2 在ccRCC 中的表达及其与患者预后的关系
2.2 TIPE2 对ccRCC 细胞增殖和侵袭能力的影响与对照细胞相比，TIPE2 过表达增强了786-OTIPE2 细胞的增殖率和集落形成能力（P＜0.05），见图2；
相反，与对照细胞相比，ShRNA 降低TIPE2 表达并抑制了786-O-TIPE2 的细胞增殖率和细胞集落形成能力（P＜0.05），见图3；
此外，与对照细胞相比，TIPE2 表达增强促进了786-O-TIPE2 细胞的侵袭能力（P＜0.05），相反，TIPE2 表达下调抑制了786-O-ShTIPE2 细胞的侵袭能力（P＜0.05）。
图2 TIPE2 对ccRCC 细胞增殖和集落形成的影响
图3 TIPE2 对ccRCC 细胞侵袭的影响
2.3 TIPE2 对Wnt 信号通路active-β-catenin 和靶基因的影响 在786-O 细胞（786-O-TIPE2）中通过TIPE2 基因转染增强TIPE2 的表达，增加了activeβ-catenin 的表达并抑制Gsk-3β 的表达（P＜0.05）。Wnt 信号通路的靶基因cyclin D1、MMP7 和c-Myc在786-O-TIPE2 细胞中的表达也增加（P＜0.05）。然而，总β-catenin 水平在TIPE2 过度表达后没有改变（P＞0.05），见图4A、图4B；
相反，在shRNA 干扰（786-O-ShTIPE2）降低TIPE2 表达后，active-βcatenin、cyclin D1、MMP7 和c-Myc 的表达下降，而Gsk-3β 的表达增加（P＜0.05）；
降低TIPE2 后，总βcatenin 水平没有改变（P＞0.05），见图4C、图4D。
图4 TIPE2 对β-catenin 和Wnt 信号通路的影响
图4 TIPE2 对β-catenin 和Wnt 信号通路的影响（续）
TIPE 家族是一个参与免疫调节和肿瘤发生的蛋白质家族。TIPE 家族蛋白质由一个致死结构域组成，除此之外，与其他家族蛋白质没有显著的序列相似性。TIPE2 是该家族的第3 个成员，由184 个氨基酸组成，是先天性免疫和适应性免疫的新型调节因子，参与维持免疫稳态[7-9]。已有研究证实TIPE2 在某些癌症中出现异常表达，TIPE2 在不同肿瘤中所起的作用不同。TIPE2 可促进多种癌症的进展，如肺癌、肾细胞癌和皮肤鳞状细胞癌[13，17，18]；
相反，TIPE2在食管癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌中起到肿瘤抑制作用[19-22]。这些不同的实验结果说明TIPE2 在不同的癌症或者癌症的不同阶段起着不同的作用，可能也与实验者所选取的样本数量和实验条件有关。总之，TIPE2 在不同癌症中发挥不同作用的具体机制尚不清楚。
研究发现[13]，TIPE2 的mRNA 表达在肾癌组织中显著增加，并且与肾癌的TNM 分期呈正相关，这表明TIPE2 高表达与ccRCC 的进展相关。然而，TIPE2 在ccRCC 发生发展中的作用和机制需要进一步研究。本研究通过分析UALCAN 在线数据库资料，证实TIPE2 在ccRCC 中的mRNA 和蛋白水平的表达高于正常肾组织，在有淋巴结转移的ccRCC中TIPE2 表达量最高，并且TIPE2 高表达预示ccRCC 患者预后不良。以上结果提示TIPE2 的表达水平可能作为ccRCC 临床评估预后的指标，TIPE2表达高的患者需要更密切关注疾病发展动态。
已有研究报道[18]，敲除TIPE2 可显著降低人类肺癌细胞的增殖、迁移能力和存活周期。本研究结果表明，TIPE2 过表达促进了ccRCC 786-O 细胞的增殖、集落形成以及侵袭和迁移能力。目前关于TIPE2在ccRCC 增殖和侵袭机制方面的研究甚少，已有研究表明TIPE2 可以通过调节多种信号通路参与癌症进展。MicroRNA-21 作为NF-κB 的直接靶点，可参与调节TIPE2 的功能，因此MicroRNA-21 能成为TIPE2 的上游调节因子[23]。在TIPE2 下游影响因素的研究中，有研究发现TIPE2 明显上调促凋亡蛋白如Bcl-2 相关X、Caspase-9、Caspase-3 的表达，并下调抗凋亡蛋白如Bcl-2 相关X1、Akt 的表达[24]。并且先前研究已经证实TIPE2 可以调节Wnt/βcatenin 途径的β-catenin、c-Myc 和cyclinD1 的蛋白表达水平并参与疾病的发展[20，21，25]。TIPE2 还能通过调节Akt/mTOR/NF-κB 信号传导诱导肺癌细胞的增殖和迁移[18]。本研究结果表明，TIPE2 可上调activeβ-catenin 和Wnt 靶基因的表达，如cyclinD1 和c-Myc。沉默TIPE2 后active-β-catenin 和cyclinD1、c-Myc 后表达减少，但TIPE2 只影响active-βcatenin 的表达，未影响total-β-catenin 的表达，说明TIPE2 参与影响β-catenin 的代谢调控而并未影响β-catenin 的转录水平。因此，TIPE2 可能通过激活Wnt 信号通路促进ccRCC 的增殖和侵袭能力，这一结果提示TIPE2 参与了ccRCC 的发生发展过程，其有望成为ccRCC 生物靶向治疗的候选基因。
综上所述，TIPE2 在ccRCC 中过度表达，并且与ccRCC 患者的不良预后相关；
TIPE2 过表达能够促进ccRCC 体外增殖和侵袭；
TIPE2 是ccRCC 潜在的评估预后的生物学标志物，其可能作为癌基因促进ccRCC 的发展。然而，TIPE2 在ccRCC 中的具体作用机制还有待进一步研究。
