杜鹃兰化学成分及其生物活性研究
时间：2023-06-25 19:20:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
李玉鹏 ，陈兴龙 ，袁盛兴 ，陈亚娟 ，张荣平 1,
（1）昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500;2）云南中医药大学中药学院，云南省南药可持续利用重点实验室，云南 昆明 650500;3）曲靖市第一人民医院超声科，云南 昆明 655000;4）昆明医科大学康复学院，云南 昆明 650500）
杜鹃兰 [Cremastra appendiculata（D.Don）Makino] 为兰科杜鹃兰属植物，该属植物仅有2 种，另一种为斑叶杜鹃兰[Cremastra unguiculata（Finet）Finet in Bull ]。杜鹃兰生于林下湿地或沟边湿地上，海拔500～2900 m。分布于中国、尼泊尔、不丹、锡金、印度、越南、泰国和日本[1]。国内外学者从该药用植物分离得到菲类、二氢菲类、联苄类、二聚菲、菲醌等结构类型的化合物，药理研究表明所得化合物具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性[2]。为发现新的活性化合物，笔者对其进行了化合物的分离、结构鉴定和化合物生物活性筛选。
1.1 研究材料
核磁共振仪: Bruker ASENDAVIIIHD 600 MHz（TMS 为内标），N-1100 旋转蒸发仪，葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20（20～80 µm，Pharmacia Uppsala），柱层析硅胶（80～100 目，200～300 目，青岛海洋化工厂），高效薄层层析硅胶G 板，HPLC（RP-18）半制备柱（10 min×250 mm，YMCPack ODS），有机溶剂均为工业纯，重蒸后使用；
显色剂为10%硫酸乙醇溶液。三种肿瘤细胞株A549、MCF-7/S、SKOV-3 由昆明医科大学药学院提供，SKOV-3 培养于McCoy’s 5A Medium Modified 含10% Fetal Bovine Serum FBS（premium grade，USA），A549、MCF-7/S 均培养于ATCCformulated RPMI-1640 Medium 含10% Fetal Bovine Serum FBS（premium grade，USA）。
1.2 植物来源
杜鹃兰药材于2019 年5 月由昆明植分公司娄安瑞先生采自四川乐山，植物学名经昆明医科大学药学院陆露研究员鉴定。标本（编号：20190525）保存在昆明医科大学药学院。
1.3 研究方法
1.3.1 提取与分离方法杜鹃兰假鳞茎，切片、阴干（7.53 kg），经95%的乙醇提取3 次。将提取液在减压下浓缩，得到褐色浸膏，加水溶解，经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取部分为（165.71 g）。将该部分浸膏以80～100 目硅胶拌样，样品经硅胶柱层析，混合溶剂体系石油醚/ 乙酸乙酯（100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、0∶1）洗脱，薄层检测合并为7 个部分（Fr.1～7）。
Fr.2（5.90 g）经硅胶柱层析，石油醚/EtOAc（25∶1、15∶1、10∶1、5∶1、0∶1）梯度洗脱，薄层检测合并为5 个部分（Fr.2.1～2.5），Fr.2.1（1.1g）经凝胶柱层析（CHCl3/CH3OH 10:90）得到3个化合物2（15.0 mg），3（7.3 mg）；
Fr.2.2（0.5 g）经制备薄层层析得到化合物4（7.6 mg）；
Fr.2.3（0.7 g）经半制备HPLC 得到化合物5（11.5 mg），6（6.5 mg）；
Fr.2.5（0.3g）经凝胶柱层析（CH3OH/H2O，90∶10）得到化合物1（10.5 mg）。
Fr.3（16.52 g）经RP-18 柱色谱（CH3OH/H2O 7∶3），硅胶柱层析CHCl3/ EtOAc（25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1），薄层检测合并为3 个部分（Fr.3.1～3.3），Fr.3.1（2.3 g）经硅胶柱层析CHCl3/ 丙酮（15∶1）得到化合物7（25.7 mg）和化合物37（31.3 mg）；
Fr.3.2（0.52 g）经HPLC（CH3OH/H2O，65∶35），得到化合物8（39.8 mg）；
Fr.3.3（8.2 g）经硅胶柱层析（氯仿/丙酮10∶1）洗脱，经Sephadex LH-20（CH3OH/CHCl3，10∶1）进行纯化，得到化合物9（9.2 mg），10（8.5 mg），11（9.3 mg），12（30.1 mg）。
1.3.2 抗肿瘤活性筛选方法A549、MCF-7/S 细胞接种于含10%FBS 的RPMI-1640 培养液中，SKOV-3 细胞接种于含10%FBS 的McCoy’s 5A 培养液中，均在37 ℃，95%湿度，5%CO2培养箱中培养，1～2 d 传代1 次，调整细胞浓度不超过6×104/mL，取指数生长期细胞进行实验。用MTT 法检测化合物对A549、MCF-7/S、SKOV-3细胞增殖的抑制作用。取对数生长期的A549、MCF-7/S、SKOV-3 细胞，调整细胞浓度为6×104/mL，加入96 孔培养板（使其终浓度为6×103/100 µL），接种细胞之后静置1 h 再放入细胞培养箱（避免96 孔板的边缘效应）。24 h 细胞贴壁之后再加化合物7～12 使其终浓度为200，100，50，25，12.5，6.25 µmol/L，每个浓度设5个平行孔，并设阳性、阴性、空白及DMSO 对照孔，在37 ℃，95%湿度，5%CO2培养箱中孵育48 h 后加入MTT 20 µL，继续孵育4 h 后，以570 nm、630 nm 双波长检测OD 值。按公式计算不同浓度的OD 值均数及标准差，再计算细胞增殖抑制率，实验重复3 次，减少误差。
2.1 化合物波谱数据
化合物1 bisbenzopyran：白色晶体，MF:C14H10O2，MW：210;1HNMR（CD3OD，600 MHz）:δ4.23（2H，dd，J=9.0，6.8 Hz，H-2a，H-2a′），3.84（2H，dd，J=9.0，6.5 Hz，H-2e，H-2e′），3.04（2H，m，H-3，H-3′），4.70（2H，d，J=4.2 Hz，H-4，H-4′），6.95（2H，d，J=1.8Hz，H-5，H-5′），6.80（2H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-7，H-7′），6.82（2H，dd，J=8.0 Hz，H-8，H-8′），3.86（6H，s，-OCH3）.13C NMR（CD3OD，150 MHz）：δC71.2（t，C-2，C-2′），53.9（d，C-3，C-3′），86.1（d，C-4，C-4′），114.4（d，C-5，C-5′），147.7（s，C-6，C-6′），118.6（d，C-7，C-7′），109.6（d，C-8，C-8′），145.9（s，C-9，C-9′），132.4（s，C-10，C-10′），55.0（q，6，6′-OCH3），其波谱数据与文献报道基本一致。
化合物2（22E）-ergosta-6，22-dien-3β，5α，8α-triol：黄色固体，MF：C28H46O3，ESI-MS m/z：431 [M+H]+.1HNMR（CDCl3）：δ6.61（1H，d，J=8.3 Hz，H-7），6.25（1H，d，J=8.3 Hz，H-6），5.20（1H，m，H-23），5.18（1H，m，H-22），2.10 and 1.91（2H，m，CH2-4），2.04（1H，m，H-24），2.03（1H，m，H-2β），1.94（1H，m，H-2α），1.86（1H，m，H-20），1.76 and 1.58（2H，m，CH2-12），1.68（1H，m，H-1β），1.61（2H，m，CH2-11），1.58（1H，m，H-9），1.48（1H，m，H-25），1.34（1H，m，CH2-16），1.25（1H，m，H-2α），1.22（2H，m，CH2-15），1.21（1H，m，H-14），1.09（3H，d，J=6.3 Hz，CH3-28），0.92（3H，d，J=6.1 Hz，CH3-21），0.90（3H，s，CH3-19），0.84（3H，d，J=6.5 Hz，CH3-26），0.82（3H，s，CH3-18），0.81（3H，d，J=6.5 Hz，CH3-27）.13CNMR（CDCl3）：δ33.4（t，C-1），30.5（t，C-2），66.8（d，C-3），39.7（t，C-4），82.5（s，C-5），135.8（d，C-6），131.1（d，C-7），79.8（s，C-8），51.5（d，C-9），37.3（s，C-10），20.3（t，C-11），37.3（t，C-12），44.9（s，C-13），51.5（d，C-14），23.8（t，C-15），29.0（t，C-16），56.7（d，C-17），13.2（q，C-18），18.5（q，C-19），40.0（d，C-20），20.3（q，C-21），135.6（d，C-22），131.1（d，C-23），43.2（d，C-24），33.4（d，C-25），20.0（q，C-26），21.0（q，C-27），17.9（q，C-28）。
化合物3 3β-hydroxy-cholesta-5-ene:白色晶体，MF：C27H46O，ESI-MS m/z：389 [M+H]+.1HNMR（CDCl3）：δ5.35（1H，s，H-6），3.54（1H，m，H-3），1.01（3H，s，H-19），0.81～0.92（9H，m，3×CH3），0.68（3H，s，18-CH3）.13CNMR（CDCl3）：δ37.3（t，C-1），31.7（t，C-2），71.8（d，C-3），42.3（t，C-4），140.8（s，C-5），121.7（d，C-6），31.9（t，C-7），31.9（s，C-8），50.2（d，C-9），36.5（s，C-10），21.1（t，C-11），39.8（t，C-12），42.3（s，C-13），56.8（d，C-14），24.3（t，C-15），28.2（t，C-16），56.1（d，C-17），12.0（q，C-18），19.1（q，C-19），36.2（d，C-20），18.8（q，C-21），29.2（t，C-22），23.1（t，C-23），39.8（t，C-24），28.2（d，C-25），23.1（q，C-26），23.1（q，C-27）。
化合物4：β-sistosterol 白色针状晶体，易溶于氯仿。与标准品β-sistosterol 共薄层层析，在三种溶剂系统均显一个点，Rf与β-谷甾醇基本一致。
化合物5 Pinoresinol :白色固体，C20H22O6，1HNMR（CD3OD，600 MHz）:δ6.95（2H，s，H-2′，H-2′′），6.81（2H，d，J=8.0 Hz，H-6′，H-6′′），6.77（2H，d，J=8.0 Hz，H-5′，H-H-5′′），4.70（2H，d，J=4.2 Hz，H-2，H-6），4.22（2H，dd，J=9.0，6.8 Hz，Hb-4，H-8），3.87（6H，s，-OCH3），3.86（2H，dd，J=9.3，3.7 Hz，Ha-4，H-8），3.03（2H，m，H-1，H-5）.13CNMR（CD3OD，150 MHz）:δ147.7（s，C-3′，C-3′′），145.9（s，C-4′，C-4′′），132.4（s，C-1′，C-1′′），118.6（d，C-6′，C-6′′），114.4（d，C-5′，C-5′′），109.6（d，C-2′，C-2′′），86.1（d，C-2，C-6），71.2（t，C-4，C-8），55.0（d，C-3′，C-3′′）。
化合物6 5，4′-dihydroxy-7-（4-hydroxybenzoyl）-3′ -methoxyflavone：黄色粉末，MF：C23H16O8，MW：420；
EI-MS，420 [M]+；
1HNMR[CD3OD，500 MHz]：δ6.90（2H，d，J=8.6，H-3′′，5′′），7.82（2H，d，J=8.6，H-2′′，6′′），6.57（1H，s，H-3），6.19（1H，s，H-6），6.44（1H，s，H-8），7.45（1H，s，H-2′），6.92（2H，d，J=8.0，H-5′），7.47（1H，d，J=8.0，H-6′），3.95（3H，s，3′-OCH3）;13CNMR [CD3OD，125 MHz]:δ166.3（s，C-2），103.8（s，C-3），183.9（s，C-4），100.1（d，C-4a），163.2（s，C-5），100.1（s，C-6），166.6（s，C-7），95.0（d，C-8），159.4（s，C-8a），123.2（s，C-1′），107.0（d，C-2′），149.1（s，C-3′），152.5（s，C-4′），117.0（d，C-5′），121.7（d，C-6′），117.5（s，C-1′′），129.4（d，C-2′′，6′′），117.0（d，C-3′′，5′′），162.8（s，C-4′′），166.3（s，C-7′′），64.1（q，3′-OCH3），其波谱数据与文献报道基本一致。
化合物7 4-methoxy-2，3，7-trihydroxyphenanthrene：白色粉末，MF：C15H12O4，MW：256；
ESI-MS：m/z 257[M+H]+，1HNMR [（CD3）2CO，600 MHz]：δ7.12（1H，s，H-1），9.38（1H，d，J=9.3，H-5），7.20（1H，d，J=9.3，2.8，H-6），7.29（1H，d，J=2.8，H-8），7.98（1H，d，J=8.7，H-9），7.29（1H，d，J=8.7，H-10），4.07（3H，s，4-OCH3）；
13CNMR [（CD3）2CO，125MHz]：δ107.9（d，C-1），155.2（s，C-2），153.2（s，C-3），156.7（s，C-4），121.0（s，C-4a），124.4（s，C-4b），129.1（d，C-5），115.8（d，C-6），159.2（s，C-7），115.9（d，C-8），133.2（s，C-8a），127.3（d，C-9），125.1（d，C-10），125.1（s，C-10a），54.2（q，3-OCH3）。
化合物8 2-hydroxy-4，7-dimethoxyphenanthrene：紫色固体，MF：C16H14O3，MW：254；
ESI-MS：m/z 255[M+H]+，1HNMR [（CD3）2CO，600 MHz]：δ9.44（1H，d，J=9.4，H-5），7.64（1H，d，J=8.7，H-9），7.57（1H，d，J=8.7，H-10），7.32（1H，d，J=2.8，H-8），7.19（1H，d，J=9.4，2.8，H-6），6.94（1H，d，J=1.9，H-1），6.85（1H，d，J=1.9，H-3），4.11（3H，s，4-OCH3），3.95（3H，s，7-OCH3）；
13CNMR [（CD3）2CO，125MHz]：δ159.5（s，C-4），156.7（s，C-2），155.5（s，C-7），134.8（s，C-10a），133.1（s，C-8a），129.0（d，C-5），127.7（d，C-9），127.1（d，C-10），125.0（s，C-4b），116.2（d，C-6），114.7（s，C-4a），108.7（d，C-8），104.6（d，C-1），99.5（d，C-3），55.1（q，4-OCH3），54.6（q，7-OCH3），其波谱数据与文献报道基本一致。
化合物9 4，4′-dimethoxy-[1，1′-biphenanthrene] 2，2′，7，7′-tetrol：红色油状物，MF：C30H22O6，MW: 478;ESI-MS：m/z 479 [M+H]+，1HNMR [CD3OD，600 MHz]:δ9.49（2H，d，J=9.30，H-5，5′），7.14（2H，dd，J=9.30，2.7，H-6，6′），7.33（2H，d，J=9.2，H-9，9′），7.03（1H，d，J=9.2，H-10，10′），7.01（2H，s，H-3，3′），7.09（2H，d，J=2.7，H-8，8′），4.18（6H，s，4，4′-OCH3）;13CNMR [（CD3）2CO，125MHz]:δ110.1（d，C-1，1′），159.2（s，C-2，2′），99.0（d，C-3，3′），153.2（s，C-4，4′），115.6（s，C-4a，4a′），124.4（s，C-4b，4b′），129.1（d，C-5，5′），110.7（d，C-6，6′），154.0（s，C-7，7′），115.9（d，C-8，8′），133.2（s，C-8a，8a′），127.1（d，C-9，9′），124.6（d，C-10，10′），134.1（s，C-10a，10a′），54.7（q，4，4′-OCH3），其波谱数据与文献报道基本一致。
化合物10 4，7，4′，9′-tetramethoxy-[1，1′-biphenanthrene]2，2′，7，7′-tetrol :红色油状物，MF: C32H26O8，ESI-MS: m/z 537[M-H]+;1HNMR[（CD3）2CO，600 MHz]:δ6.95（1H，s，H-3），9.32（1H，d，J=9.4，H-5），7.20（1H，dd，J=9.4，2.4，H-6），7.76（1H，d，J=2.4，H-8），6.94（1H，s，H-10），4.15（3H，s，4-OCH3），3.84（3H，s，9-OCH3），7.03（1H，s，H-3′），9.25（1H，s，H-5′），7.24（1H，s，H-8′），7.39（1H，d，J=8.6，H-9′），7.01（1H，d，J=8.6，H-10′），4.24（3H，s，4′-OCH3），4.07（3H，s，6′-OCH3）;13CNMR [（CD3）2CO，150 MHz]:δ109.3（s，C-1），159.4（s，C-2），99.2（d，C-3），159.5（s，C-4），115.5（s，C-4a），125.4（s，C-4b），127.2（d，C-5），122.4（d，C-6），159.4（s，C-7），109.0（d，C-8），127.1（s，C-8a），154.2（s，C-9），101.0（d，C-10），134.6（s，C-10a），55.2（q，4-OCH3），55.1（q，9-OCH3），111.3（s，C-1′），150.0（s，C-2′），99.7（d，C-3′），159.4（s，C-4′），120.7（s，C-4a′），124.9（s，C-4b′），109.3（d，C-5′），147.7（s，C-6′），145.2（s，C-7′），111.3（d，C-8′），127.1（s，C-8a′），126.7（d，C-9′），124.5（d，C-10′），134.2（s，C-10a′），60.5（q，4′-OCH3），55.3（q，6′-OCH3）。
化合物 11 Bavachinine: 黄色粉末，MF:C21H22O4，MW: 338; ESI-MS，361 [M+Na]+;1HNMR [CDCl3，500 MHz]:δ7.30（2H，d，J=8.0，H-3′，5′），6.91（2H，d，J=8.0，H-2′，6′），7.67（1H，s，H-5），6.43（1H，s，H-8），5.36（1H，dd，J=13.0，3.0，H-2），5.27（1H，m，H-12），3.23（2H，d，J=7.5，H-11），3.03（1H，dd，J=17.0，，13.5，H-3a），2.78（1H，d，J=17.0，3.0，H-3b），1.72（3H，s，H-14），1.68（1H，s，H-15），3.85（3H，s，7-OCH3）;13CNMR [CDCl3，125 MHz]:δ80.2（d，C-2），44.3（t，C-3），192.6（s，C-4），127.5（d，C-5），125.5（s，C-6），164.9（s，C-7），99.3（d，C-8），163.1（s，C-9），114.2（s，C-10），28.2（t，C-11），122.1（d，C-12），133.5（s，C-13），18.1（q，C-14），26.2（q，C-15），130.8（s，C-1′），128.3（d，C-2′，6′），116.2（d，C-3′，5′），157.2（s，C-4′），其波谱数据与文献报道基本一致。
化合物12 3-hydroxy-phenpropionic acid-（2′-methoxy-4′-carboxy-phenol）ester ：红色晶体，MF:C17H16O6，MW: 316;ESI-MS: m/z 317[M+H]+;1HNMR [（CD3）2CO，600 MHz]:δ6.69（1H，M，H-2），6.61（1H，dd，J=7.9，1.9，H-4），6.93（1H，t，J=7.9，H-5），6.91（2H，m，H-6），2.79（2H，t，J=8.0，H-7），2.06（2H，t，J=8.0，H-8），7.60（1H，s，H-3′），7.57（1H，d，J=8.0，H-5′），6.92（1H，d，J=8.0，H-6′），3.93（3H，s，2′-OCH3）;13CNMR [（CD3）2CO，125MHz]:δ143.2（s，C-1），115.1（d，C-2），161.7（s，C-3），112.6（d，C-4），130.0（d，C-5），119.5（d，C-6），29.3（t，C-7），37.7（t，C-8），170.0（s，C-9），151.2（s，C-1′），147.2（d，C-2′），114.6（d，C-3′），122.0（s，C-4′），124.0（d，C-5′），115.1（d，C-6′），54.4（q，2′-OCH3），166.7（s，-COOH）。
2.2 化合物7～12 抗肿瘤活性筛选结果
对化合物7～12 进行了人体肺癌细胞株（A549）、人体乳腺癌药物敏感细胞株（MCF-7/S）、人体卵巢癌细胞株（SKOV-3）抑制活性，见表1。
表1 化合物7～12 对3 种细胞株的细胞毒活性IC50（µmol/L）Tab.1 Cytotoxic activities of compounds 7～12 on three cell lines IC50（µmol/L）
研究结果如上表，研究发现化合物9 和10对MCF-7/S 细胞株显示了很好的抑制活性，其IC50分别为2.16，5.09 µmol/L，以上作用强于阳性对照品DDP。
药用植物杜鹃兰分离鉴定化合物结构类型为：化合物1 为吡喃酮类二聚体[3]，化合物3～4 为甾体化合物[4−8]，化合物5 为木脂素类化合物[9]，化合物6 为黄酮类化合物[10]，化合物7～10 为菲类化合物[7−15]，化合物11 为二氢黄酮类化合物[16−17]，化合物12 为酯类化合物[16−17]。抗肿瘤活性测试结果表明化合物9 和10 对MCF-7/S 细胞株显示了很好的抑制活性。该研究为杜鹃兰的开发和利用提供了基础研究。
近年来，国内学者Wang Y 等[18]从杜鹃兰中分离得到化合物Blestriarene A，Blestriarene B，使用 MTT 方法评估化合物对 A549 和 Bel7402 细胞系的细胞毒性，以bufalin 作为阳性对照。在检测的化合物中，两个化合物对A549 细胞株表现出较弱的细胞毒活性（IC50分别为47.5、48.2 l M）。刘量等[19]从杜鹃兰分离出5 种新的双菲cremaphenanthrenes A-E 以及6 个已知的双菲，对所获得的化合物都在体外测试了对结肠（HCT-116）、宫颈（Hela）和乳腺癌（MDA-MB-231）癌细胞系的细胞毒性活性，所得二聚菲化合物均对三种细胞株表现出中等或弱的细胞毒性。《中国药典》中收载的中药材山慈菇，为兰科植物杜鹃兰、独蒜兰或云南独蒜兰的干燥假鳞茎。随着对山慈菇及其提取物生物活性研究的不断深入，其抗肿瘤、抗氧化、神经保护、抗菌、抗痛风、降脂降糖、提高造血功能及增强免疫等药理作用受到广泛关注；
山慈菇还常与其他中药组成复方，在呼吸系统、消化系统、内分泌代谢系统等疾病的治疗方面疗效确切，具有很好的临床应用前景[20～22]。
