N-myc下游调节基因2对巨噬细胞极化及乳腺癌增殖、侵袭和迁移的影响
时间：2023-06-25 12:50:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
皮美辰 陈文馨 柳周 汪长华 孙圣荣
乳腺癌是世界范围内最常见的女性原发恶性肿瘤之一[1]，在20～59岁女性中的发病率居于首位，并且呈现出年轻化的趋势[2]。寻找乳腺癌发生和进展的新机制，为乳腺癌治疗探索方向显得尤为重要。N-myc下游调节基因2(NDRG2)蛋白是N-myc下游调节基因家族的成员，在恶性肿瘤的增殖、分化和转移中发挥重要作用[3]。巨噬细胞由于其巨大的可塑性，在肿瘤发生和进展中发挥重要作用[4]。乳腺微环境中，巨噬细胞可在不同刺激下极化为抑瘤型M1或促瘤型M2。M2型巨噬细胞被认为与乳腺癌进展相关[5]。探究巨噬细胞极化导致乳腺癌进展的机制或许能为乳腺癌治疗带来新的方向。
一、材料与方法
1.病人样本：本研究获得了武汉大学人民医院伦理委员会批准(批件号2018K-C09)。实验使用的所有乳腺癌及癌旁组织标本均来自武汉大学人民医院。
2.细胞共培养：在孔径为0.4 μm的Transwell培养板(Millipore)中进行小鼠RAW264.7巨噬细胞和小鼠乳腺癌细胞4T-1共培养，上室为RAW264.7细胞，下室为4T-1细胞。共培养48小时后，对乳腺癌细胞4T-1进行细胞迁移和侵袭实验。
3.生物信息学分析：乳腺癌病人的mRNA数据谱和临床病理特征来自癌症基因组图谱(TCGA)数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)。
4.细胞转染：含有小鼠NDRG2野生型(WT)或NDRG2突变型(MUT)的质粒购自GeneChem Biotechnology公司。靶向小鼠NDRG2的小干扰RNA(siRNA)由QIAGEN公司合成。根据生产商的方案，使用Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂对巨噬细胞进行转染。实验中使用的siRNA及其配对对照最有效的序列如下：5′-CCGUGGUGGAAUGUAACUCAATT-3′， 5′-CAGGAAGAGCUUUCUGGAAAUTT-3′。
5.细胞增殖：经过前期处理后，按每孔2 000个将4T-1细胞铺于96孔板中，培养3天。每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育细胞2小时，然后在450 nm处测定样品的吸光度。
6.划痕实验检测细胞迁移：将共培养完成的乳腺癌细胞接种到6孔板中，待细胞生长至100%汇合度时，用200 μl移液器吸头划破细胞层，细胞表面可见一直线划痕，在0小时、24小时和48小时分别用显微镜观察划痕并拍照，使用Image J软件测量划痕面积，计算划痕愈合率。
7.Transwell检测细胞侵袭：方法如前所示[6]。Western blot方法如前所示[6]。
二、统计学分析
1.NDRG2在乳腺癌组织中的表达及其与不良预后的关系：从TCGA数据库挖掘NDRG2 mRNA表达数据发现，NDRG2在乳腺癌组织中的表达远低于正常乳腺组织(图1A)。用Western blot法检测乳腺癌病人癌组织和癌旁组织样本发现，与生物分析结果一致，NDRG2在乳腺癌组织中的表达显著低于癌旁组织。(图1B～C)。生存分析显示，无论是总生存期(overall survival，OS)，还是无复发生存期(relapse-free survival，RFS)，NDRG2低水平组都比NDRG2高水平组的预后差(图1D)。
2.NDRG2与乳腺癌病人临床病理特征的关系：依据TCGA数据库数据分析显示，NDRG2的表达与乳腺癌病人的性别、转移、分期和分子分型有关。男性乳腺癌病人和出现远处转移的乳腺癌病人表现出更低的NDRG2水平(图2A～B)。与其他分型比较，HER2阳性型的乳腺癌病人表现出最低的NDRG2水平(图2C)，并且随着肿瘤进展，NDRG2的水平持续下降(图2D)。
3.NDRG2敲低促进巨噬细胞向M2型极化：为了探究NDRG2对巨噬细胞极化的影响，用NDRG2 siRNA和其配对对照(scramble siRNA)转染了Raw264.7巨噬细胞。结果显示，与scramble siRNA组相比，NDRG2 siRNA组M2型巨噬细胞分子标志物CD206的表达显著增加，M1型巨噬细胞分子标志物CD80的表达显著降低(图3A～B),这表明巨噬细胞内NDRG2敲低会促进巨噬细胞向M2型分化。
4.NDRG2G过表达抑制巨噬细胞向M2型极化：为了加强结论，我们还利用含有NDRG2 cDNA的质粒过表达这个基因观察巨噬细胞极化状态的改变。见图4A～B。结果表明，与对照组比较，NDRG2过表达组CD206的表达被显著抑制，CD80的表达却增加。表明NDRG2过表达会抑制巨噬细胞向M2型极化。
5.巨噬细胞内NDRG2缺失促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移：为了探究NDRG2是否能通过影响微环境免疫状态的改变而影响乳腺癌进展，我们模拟乳腺微环境将巨噬细胞与乳腺癌细胞4T-1共培养以观察巨噬细胞内NDRG2的缺失对4T-1细胞增殖、侵袭及迁移的影响，结果显示，巨噬细胞内NDRG2的缺失显著增加了乳腺癌细胞4T-1的增殖、迁移和侵袭(图5A～C)。
6.巨噬细胞内NDRG2过表达抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移：为了加强结论，用含有NDRG2 cDNA的质粒转染RAW264.7巨噬细胞以过表达NDRG2，随后再与4T-1细胞共培养。结果显示，与对照组比较，NDRG2过表达组乳腺癌细胞4T-1的增殖、迁移和侵袭能力受到明显抑制(图6A～C)。总之，这些结果表明乳腺肿瘤微环境中巨噬细胞NDRG2的减少促进了乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
A.TCGA数据库中乳腺癌病人与正常人中NDRG2 mRNA的表达。B、C.Western blotting检测乳腺癌组织及配对癌旁组织中NDRG2蛋白表达。D.NDRG2表达对乳腺癌OS及RFS的影响。aP<0.01，bP<0.0001
图2 NDRG2表达水平与转移、性别、肿瘤分期和分子亚型的关系。aP<0.05，bP<0.001，cP<0.000 1
A、B.Raw264.7细胞系中NDRG2的敲低效率，NDRG2敲低对巨噬细胞生物标志物CD80和CD206蛋白水平的影响。aP<0.01，bP<0.001
A、B.Raw264.7细胞系中NDRG2的敲低效率，NDRG2敲低对巨噬细胞生物标志物CD80和CD206蛋白水平的影响。aP<0.05，bP<0.01图4 过表达NDRG2抑制巨噬细胞向M2型极化
A.通过CCK-8实验测定细胞增殖。B.通过划痕实验测定迁移(×40)。C.通过Transwell实验测定侵袭(×200)。aP<0.05，bP<0.001
A.通过CCK-8实验测定细胞增殖。B.通过划痕实验测定迁移(×40)。C.通过Transwell实验测定侵袭(×200)。aP<0.01，bP<0.000 1。图6 过表达巨噬细胞内NDRG2抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭
目前，乳腺癌已经成为全球女性中最常见的癌症[7-8]。
巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞类型之一。因为极好的清除和修复作用，巨噬细胞对于先天性免疫应答至关重要。然而，当巨噬细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞时，这些作用反而会促进肿瘤进展[9-10]。巨噬细胞能在不同的刺激条件下极化为经典的M1抗肿瘤表型或替代激活的M2促肿瘤表型，M2巨噬细胞的聚集往往代表着不良临床预后[11]。因此，阐明巨噬细胞极化的机制及对乳腺癌的影响对乳腺癌预后改善具有积极意义。
生信分析的结果表明，NDRG2可能在乳腺癌中发挥抑癌作用。乳腺癌组织中存在大量的巨噬细胞，组织中NDRG2 mRNA的变化可能也包括巨噬细胞中NDRG2 mRNA的变化，由于NDRG2水平改变会影响巨噬细胞极化状态的改变，而巨噬细胞的极化状态又会直接影响乳腺微环境的免疫状态。所以本研究进行体外实验以探究巨噬细胞内NDRG2下调对乳腺癌进展的影响。结果表明，NDRG2缺失不仅促进巨噬细胞向M2型极化还促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
乳腺癌中NDRG2表达下调，NDRG2缺失促进微环境中巨噬细胞向M2型极化随后促进乳腺癌的增殖、迁移和侵袭。
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