贺兰山东麓4个免埋土品种葡萄酒香气成分比较分析
时间：2023-06-23 21:45:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
马军，刘成敏，单守明，雷昊，李亚川，邵洁玲
（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）
葡萄果实中存在大量通常不具有香气属性的前体物质（如糖苷、氨基酸等），在酿酒过程中经微生物、酶的作用发生一系列生化反应，进而转化为香气化合物[1]。葡萄酒香气主要来源于品种自身香气，是人们评价葡萄酒品质的重要指标[2]。香气化合物分为游离态和结合态两类，其中游离态香气对葡萄酒的香气构成有直接贡献，而结合态香气是在葡萄酒发酵和陈酿过程中，利用酵母分泌的糖苷酶对结合态的无味糖苷的糖苷键进行水解，释放具有香气特性的游离糖苷配体，进而转变为可挥发的和可感知的游离态香气成分，从而增强葡萄酒的香气感知度[1-3]。醇、酯、酸、醛酮以及萜烯类物质是组成葡萄酒香气的主要成分，其种类、含量、感官阈值、存在形式及其之间的相互作用因葡萄品种的不同而千差万别，进而决定着葡萄酒的风味和典型性[4]。在葡萄酒香气物质检测方面，HS-SPME与GC-MS技术被广泛运用于食品挥发性风味物质的分析检测，这两种方法的结合可以提高检测灵敏度，为快速准确地检测葡萄酒挥发性成分提供了有效工具[5]。研究不同品种葡萄酒香气特点，对葡萄种质资源、葡萄和葡萄酒产业可持续发展具有重要意义。
宁夏贺兰山东麓被认为是我国优质葡萄酒产区，但频繁发生的冻害严重制约着葡萄酒产业的发展[6-7]。近年，抗逆性强的“北”字系山欧杂种在贺兰山东麓产区栽培表现较好[8-9]，但对其酿酒品质及葡萄酒香气物质方面的研究还不够深入。为此，试验以‘北玺’‘新北醇’‘北全’‘北香’品种所酿葡萄酒为对象，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）、气相色谱-质谱联用结合化学计量学，检测其香气成分，以期为贺兰山东麓产区品种推广提供参考。
1.1 材料与试剂
供试品种：宁夏银川市平吉“宁夏现代农业综合开发工程技术研究中心”试验园4个免埋土的红色酿酒葡萄品种（北玺、新北醇、北全和北香）。沙质土壤，植株为7年生，均为“厂”形架式，管理方式基本一致。
1.2 主要仪器和设备
GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪和HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），日本岛津公司；
75 μm聚二甲基硅氧烷/碳分子筛/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取头，美国Supelco公司。
1.3 试验方法
1.3.1 酿造工艺
在果实可溶性固形物22%左右开始采摘，参考李华[13]干红葡萄酒小容器酿酒方法。葡萄采收分选、除梗破碎、入罐，加50 mg·L-1SO2、果胶酶35 mg·L-1、酵母150 mg·L-1，发酵温度26 ℃。发酵期间监测其密度变化情况，待密度降至1.00以下且不再发生变化视为发酵结束，装瓶低温冷藏待测。
1.3.2 葡萄酒基本理化指标检测
依据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》检测酒精发酵结束后酒样的酒精度、可滴定酸以及挥发酸[11]。采用福林-肖卡法测定单宁[11]、福林酚法测定总酚[12]。
1.3.3 HS-SPME法提取香气
取葡萄酒样5 mL，置于15 mL顶空瓶，并加入1 g NaCl，添加5 μL 2-辛醇（用无水乙醇稀释200倍）作为内标物，密封顶空瓶，用已活化的75 μm聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取头插入顶空瓶距离液面1 cm处，置于磁力搅拌加热台上，60 ℃萃取30 min，使顶空瓶中的挥发性物质达到平衡状态，然后从样品瓶中取出萃取头插入GC进样口，解析温度250 ℃，解析时间5 min。
1.3.4 GC-MS条件
GC条件：汽化室温度为250 ℃；
载气为高纯氦气（纯度≥99.999 %）；
流速1.5 mL·min-1，采用手动进样，不分流模式；
柱温箱程序升温：起始柱温35 ℃，保持3 min，然后以4 ℃·min-1的速度升温至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1升温至230 ℃，保持8 min。MS条件：离子源温度为200 ℃，离子能量70 eV，电离方式EI，检测器电源350 eV。
1.3.5 定性与定量分析
将未知物图谱与NIST 17标准谱库进行比对并初步鉴定，再结合保留时间、参考文献、质谱离子图对香气物质进行定性分析；
以2-辛醇为内标物，采用内标法进行相对定量计算。
1.4 数据处理
用IBM SPSS Statistics 23进行数据处理分析，用OriginPro 2021、Microsoft Word 2016进行绘图，制表。
2.1 酒精发酵结束后的葡萄酒基本理化指标
由表1可知，供试葡萄酒各理化指标除总酚外均存在显著差异，酒精度在8.8%～12.5%（Vol，下同），‘北玺’‘新北醇’的酒精度显著高于‘北全’和‘北香’。4个品种葡萄酒挥发酸在0.06～0.09 g·L-1，其中‘北玺’葡萄酒挥发酸最高，‘北香’最低。‘新北醇’可滴定酸含量显著高于其他品种，为11.06 g·L-1；
‘北全’单宁含量最低为0.03 g·L-1。发酵结束后各酒样总酚含量从高到低依次为新北醇＞北香＞北玺＞北全。
表1 供试样品葡萄酒理化指标Table 1 Physical and chemical indexes of wine samples
2.2 不同葡萄酒游离态香气成分定性与定量分析
对4个免埋土品种的葡萄酒样香气成分定性与定量分析，共检出79种挥发性物质，包括酯类27种、醇类22种、酸类5种、醛酮类6种、萜烯类6种和其他类13种。‘北玺’‘新北醇’‘北全’‘北香’分别检测出香气物质种类依次为52种、33种、34种、32种，香气物质总量分别为7155.17、6812.43、5230.03、5105.23 μg·L-1。
2.2.1 各品种葡萄酒酯类挥发性化合物比较
由表2所示，‘北玺’‘新北醇’‘北全’和‘北香’酒样酯类挥发性化合物种类依次为17种、14种、13种和12种，分别占各品种香气种类的32.69%、42.42%、38.24%和37.5%，其中酯类总量分别占各品种香气总含量48.05%、47.06%、46.73%和37.25%。各品种酯类含量差异显著，由高到低依次为北玺＞新北醇＞北全＞北香。辛酸乙酯在4个品种酒样中含量最高，且在‘北全’中最高，‘北香’中最低。
表2 4个葡萄酒样品酯类香气成分定性定量结果Table 2 Qualitative and quantitative results of ester aroma components in wine samples
‘北玺’葡萄酒特有的酯类化合物有7种，分别为柳酸甲酯、甲酸香茅酯、3-甲基戊酸异戊酯、戊酸5-羟基-2,4-二叔丁基苯基酯、环丙烷羧酸2-苯乙酯、4-(乙氧基)-2-氧代丁基-3-烯酸乙酯、乳酸乙酯。‘新北醇’葡萄酒特有的酯类化合物有3种，乙酸己酯、顺式-3-己烯醇苯乙酸酯、癸酸乙酯。‘北全’葡萄酒特有的酯类化合物有3种，分别为壬酸乙酯、庚酸乙酯、戊酸甲酯。‘北香’葡萄酒特有的酯类化合物有两种，分别为甲酸辛酯、己-2-烯酸乙酯。
2.2.2 各品种葡萄酒醇类挥发性化合物比较
由表3所示，‘北玺’‘新北醇’‘北全’‘北香’酒样醇类化合物种类为17种、8种、9种、9种，分别占各品种香气种类的32.69%、24.24%、26.47%、28.13%，其中醇类总量分别占各品种香气总量的38.91%、42.39%、35.11%、64.01%。各品种醇类含量差异显著，由高到低依次为北香＞新北醇＞北玺＞北全，4个葡萄酒中异戊醇和苯乙醇含量较高，且差异显著。
表3 葡萄酒样品醇类香气成分定性定量结果Table 3 Qualitative and quantitative results of alcohol aroma components in wine samples
‘北玺’葡萄酒特有的醇类香气化合物有8种，分别为(S)-3,7-二甲基-7-辛烯-1-醇、α-松油醇、芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇、1-(4-甲基苯基)-1-乙醇、3,4-二羟基苯乙醇、三氟乙酰薰衣草醇、(-)-4-萜品醇。‘新北醇’特有的醇类化合物有1种，为4-甲基-1-戊醇。‘北全’特有的醇类化合物有两种，分别为4-甲基-1-己醇、3-乙基-4-甲基戊烷-1-醇。3-乙基-3-戊醇化合物只有在‘北香’中被测到。
2.2.3 各品种葡萄酒酸类挥发性化合物比较
由表4所示，‘北玺’‘新北醇’‘北全’‘北香’酒样酸类挥发性化合物种类为4种、3种、4种、3种，分别占各品种香气种类的7.69%、9.09%、11.76%、9.38%，其中酸类总量分别占各品种香气总量的2.33%、4.40%、8.16%、3.24%。各品种酸类含量差异显著，由高到低依次为北全＞新北醇＞北玺＞北香。4个品种当中辛酸含量较高且差异显著，顺序为北全＞新北醇＞北玺＞北香。香叶酸只在‘北玺’中检到，同样(S)-2-羟基丙酸肌乳酸只在‘北全’中检到。
表4 葡萄酒样品酸类香气成分定性定量结果Table 4 Qualitative and quantitative results of acid aroma components in wine samples
2.2.4 各品种葡萄酒醛酮、萜烯类挥发性化合物比较
由表5所示，‘北玺’‘新北醇’‘北全’‘北香’酒样醛酮、萜烯类挥发性化合物种类为7种、2种、3种、2种，分别占各品种香气种类的13.46%、6.06%、8.82%、6.25%，其中醛酮、萜烯类总量分别占各品种香气总含量的1.84%、0.24%、0.91%、0.69%。各品种葡萄酒醛酮、萜烯类总含量差异显著，由高到低依次为北玺＞北全＞北香＞新北醇。
表5 葡萄酒样品醛酮、萜烯类香气成分定性定量结果Table 5 Qualitative and quantitative results of aldehyde, ketone and terpene aroma components in wine samples
‘北玺’特有的醛酮、萜烯类化合物有6种，分别为4-甲基苯戊酮、4-(正丁氧基)苯乙酮、六氟乙酰丙酮、2-甲基戊醛、松油烯、3-甲基-6-(1-甲基乙亚基)环己烯。‘新北醇’只有2种此类化合物，分别为夫洛丙酮、辛酸异戊酯。2,4-二甲基苯甲醛、3,7-二甲基辛基-6-烯基碳酸乙酯化合物只在‘北全’中检出。‘北香’特有化合物有2种，分别为β-紫罗兰酮、(4E)-3,3,6-三甲基-1,4-庚二烯。
2.2.5 各品种葡萄酒其他类挥发性化合物比较
由表6所示，‘北玺’‘新北醇’‘北全’‘北香’酒样其他类挥发性化合物种类为7种、6种、5种、6种，分别占各品种香气总种类的13.46%、18.19%、14.71%、18.75%，其中其他类物质总量分别占各品种香气总含量的8.87%、5.90%、9.09%、10.43%。各品种其他类总量差异显著，由高到低依次为北玺＞北香＞北全＞新北醇。氨基甲酰肼、十二甲基环六硅氧烷化合物为4个品种共有化合物且差异显著，其中氨基甲酰肼化合物含量北香＞北全＞新北醇＞北玺；
十二甲基环六硅氧烷化合物含量‘北玺’最高，‘北香’‘北全’次之，‘新北醇’最低。
表6 葡萄酒样品其他类香气成分定性定量结果Table 6 qualitative and quantitative results of other aroma components in wine samples
‘北玺’特有的其他类化合物有4种，分别为3-乙酰基-2,5-二甲基呋喃、甲基肼、氨基甲酸铵、苄基氯。环五聚二甲基硅氧烷、丙基环丙烷只在‘新北醇’中被检出；
2,2,5,5-四甲基己烷在‘北全’被检出；
乙丙醚只在‘北香’中被检出。
2.2.6 不同品种葡萄酒香气成分分析
通过香气成分定性定量结果对各品种酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜烯类和其他类香气化合物含量和种类进行比较分析。由图1可知，贺兰山东麓产区4个免埋土品种的葡萄酒香气成分酯类、醇类化合物含量和种类数量占比为主，各个品种其余类别香气成分含量以及种类数量占比基本相似，体现了葡萄酒香气特性，但在不同杂交改良、芽变育种过程中葡萄酒香气化合物存在一定差异。为了进一步分析4个品种葡萄酒的特征香气成分，需要通过统计学分析加以判定[14-15]。
图1 各类化合物含量占比（左）和各类化合物数量占比（右）Figure 1 Proportion of various compounds (Left) and proportion of quantity compounds (Right)
2.3 四个品种葡萄酒挥发性香气含量主成分分析
对4个品种挥发性成分提取2个主成分（PC）。由图2可知，酒精发酵后葡萄酒中挥发性化合物的PC1和PC2分别为50.13%和26.96%，累计方差贡献率为77.09%。4个品种的葡萄酒有较好的分布，且从挥发性成分的变量因子和葡萄酒品种的分布来看，不同挥发性成分对不同品种葡萄酒的贡献有所差异。
图2 不同品种葡萄酒香气成分主成分分析Figure 2 Principal component analysis of aroma components of different varieties of wine
‘北玺’葡萄酒分布于第一象限，位于该象限的独有香气化合物明显高于其他品种，共有化合物中辛酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸甲酯、苯乙醇、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇挥发性化合物对该品种葡萄酒香气的贡献较其他品种显著。‘北全’葡萄酒分布于第二象限，对于该象限的辛酸、正癸酸、(S)-2-羟基丙酸肌乳酸、夫洛丙酮、3,7-二甲基辛基-6-烯基碳酸乙酯、1-癸醇、庚酸乙酯、戊酸甲酯挥发性物质对‘北全’葡萄酒香气贡献较其他品种显著。‘新北醇’葡萄酒分布于负半轴贴近中轴线位置，对于该位置的环五聚二甲基硅氧烷、丙基环丙烷、乙酸己酯、顺式-3-己烯醇苯乙酸酯、癸酸乙酯挥发性化合物对‘新北醇’葡萄酒香气的贡献较其他品种显著。‘北香’葡萄酒分布于第三象限，位于该象限的乙酸苯乙酯、甲酸辛酯、β-紫罗兰酮、正己醇、3-乙基-3-戊醇、辛酸异戊酯、(4E)-3,3,6-三甲基-1,4-庚二烯挥发性化合物对该品种葡萄酒香气的贡献较其他品种显著。
葡萄酒中的挥发性香气成分主要由C6化合物、酸类、醇类、酯类、萜烯类等组成[16]，含量差异很大，这些香气之间相互作用，进行复杂的转化，构成了葡萄酒的特色风味。葡萄酒的香气取决于葡萄原料的香气，而葡萄的香气会受到外界因素的影响，如土壤、气候条件、管理模式、采摘成熟度等[17-18]。Schreier[19]在1974年从葡萄中检测出220多种挥发性化合物，其中有81种烃类、30种醇类、47种酸类、22种醛类、17种酮类、10种酯类和12种杂环化合物。Sefton等[20]在‘霞多丽’葡萄汁中检测出181种成分，其中13-碳去甲基异戊二烯占70%左右，苯衍生物占20%左右，单萜占5%，大马酮、γ-内酯及一些小分子物质占比不到6%。本研究通过贺兰山东麓产区4个免埋土品种的葡萄酒香气进行了分析比较，共检测出79种挥发性物质，包括酯类27种，醇类22种，酸类5种，醛酮类6种，萜烯类6种和其他类13种。酯类含量占比37.25%～48.05%、醇类含量占比38.91%～64.01%，其余类别香气化合物含量占比均在11%以下，其中4种葡萄酒中醇类和酯类香气物质占比较高，同产区的不同品种葡萄酒香气成分具有一定差异，这与前人研究一致[21]。
此外，吡嗪类物质主要由美拉德反应微生物代谢，加热分解蛋白质和氨基酸等途径产生，该物质特殊的药理作用又赋予其在酒中的保健功能[22]。本研究中在‘北玺’葡萄酒中检测到呋喃类物质，这可能与该品种在不同地区的表现有关。
‘北玺’‘新北醇’‘北全’‘北香’品种分别检测到香气化合物依次为52种、33种、34种、32种，独有的香气化合物依次为30种、9种、10种、6种。所鉴定的挥发性物质酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜烯类、其他类香气成分含量以及种类数量占比以‘北玺’表现突出，‘北全’醇类和酸类含量占比较高，‘新北醇’和‘北香’含量占比相似，4个品种以酯类和醇类为主。
对79种挥发性化合物利用主成分分析，提取两个主成分因子分离度将个体品种进行区分。辛酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸甲酯、苯乙醇、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇为‘北玺’主要贡献特征化合物；
辛酸、正癸酸、(S)-2-羟基丙酸肌乳酸、夫洛丙酮、3,7-二甲基辛基-6-烯基碳酸乙酯、1-癸醇、庚酸乙酯、戊酸甲酯为‘北全’主要贡献特征化合物；
环五聚二甲基硅氧烷、丙基环丙烷、乙酸己酯、顺式-3-己烯醇苯乙酸酯、癸酸乙酯为‘新北醇’主要贡献特征化合物；
乙酸苯乙酯、甲酸辛酯、β-紫罗兰酮、正己醇、3-乙基-3-戊醇、辛酸异戊酯、(4E)-3,3,6-三甲基-1,4-庚二烯为‘北香’主要贡献特征化合物。
