镉胁迫对黄鳝醛酮还原酶基因表达的影响
时间：2023-06-23 21:20:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
孔 丹，李 伟
( 长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025 )
醛酮还原酶(AKR)超家族是一类动力学相似的结构相关蛋白，醛酮还原酶家族成员多数以37 ku的单体形式存在，广泛分布于细菌、真菌、植物、原生动物、动物中，是一类在醛和酮还原中具有多种功能的依赖还原型辅酶Ⅱ的氧化还原酶[1]。所有已知的醛酮还原酶家族成员都有一个保守的(β/α)8或丙糖磷酸异构酶(TIM)桶基序，以及一些决定底物特异性的可变环和螺旋[2]。醛酮还原酶成员在生物体中对醛酮类化合物起到很重要的解毒作用，可分为醛糖还原酶、醛酮还原酶、乙醛还原酶、强化类固醇脱氢酶和二氢二醇脱氢酶，与癌症侵袭、转移和耐药性等问题的发生密切相关[3]。醛酮还原酶基因作为应激调节基因，参与氧化胁迫下的解毒调节机制，影响生物体内氧化应激与免疫调节[4]。目前，对于鱼类这些低等脊椎动物的醛酮还原酶基因及其功能报道非常匮乏，亟需深入研究。
重金属胁迫对鱼类免疫调控以及氧化应激过程有重要作用，即使低剂量的重金属也对水生动物有巨大伤害。镉严重影响了生物的生长性能、组织学、行为、发育以及生产生理学[5]。镉的暴露可以改变酶的活性和基因的表达[6]，诱导肝细胞活性氧的产生以及发挥其毒性[7]；
能够造成线粒体功能障碍，对免疫系统产生毒性作用，导致许多疾病发生[8]。
黄鳝(Monopterusalbus)广泛分布于东亚和南亚多个国家的泥塘、沼泽、稻田中，环境中的重金属污染会影响其氧化还原代谢和机体的生理功能。有报道指出，鱼类在养殖过程中会因水环境中药物滥用和有毒化合物暴露发生“肝胆综合征”[9]，其实质就是鱼类会因脂质过氧化和氧化应激而产生严重的肝损伤[10]。由于底栖生活的习性，黄鳝受到水环境中重金属的影响程度更深，但其具体机制尚不完全清楚。虽然王全禾等[11]制备了黄鳝醛酮还原酶的多克隆抗体并检测了其特异性和效价，阚延泽等[12]发现，黄鳝醛酮还原酶可以提高细胞抗逆境胁迫的能力，但对该基因结构及其表达谱的研究尚未见相关报道，其在重金属诱导下的氧化应激作用亟需深入了解。因此，笔者拟探究重金属镉处理对黄鳝醛酮还原酶(Eakr)基因表达的影响，旨在为进一步分析鱼类醛酮还原酶基因在抗氧化应激中的作用提供参考资料。
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株
原核表达载体pET-28a购自Novagen公司，大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态DH5α、BL21(DE3)等购自北京全式金生物技术有限公司，pET-28a-Eakr的BL21(DE3)菌株由本实验室构建并保存于长江大学生物医药研究所。
1.1.2 主要试剂盒
DNA凝胶回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；
Trizol柱纯化总RNA提取试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)；
2×SYBR Green PCR MIX试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)；
cDNA第一链合成试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)；
SMARTer®RACE 5′/3′ Kit试剂盒(TaKaRa公司)。
1.2 方法
1.2.1 试验样品采集
试验用黄鳝购自荆州水产市场，平均体质量(50±10) g。在正式开展试验前，使用经过曝气的自来水将黄鳝饲养于实验室水箱中，饲养过程中连续曝气并定期更换水。饲养驯化1周后用于后期的试验。
随机选取驯化后的黄鳝4尾，解剖后取脑、血细胞、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肌肉、性腺、皮肤、脾脏、胃11个组织，将组织转移到1.5 mL Eppendorf管中，并在液氮中冷冻。冰箱-80 ℃保存，并用于后续试验分析。
随机选取36尾饲养驯化后的黄鳝[平均体质量(50±10) g]，随机分为对照组与处理组，每组各18尾。处理组的黄鳝暴露于Cd2+终质量浓度为15 mg/L[13]的曝气自来水中，对照组的黄鳝置于相同条件未添加Cd2+的曝气自来水中。暴露0、3、6、9、12、24 h后，两组分别随机选取3尾黄鳝进行解剖，用Microcontrifuge Tube收集黄鳝肝脏，保存于-80 ℃并用于后续试验分析。
使用DNA分离试剂盒从黄鳝组织中分离基因组DNA，使用RNA提取试剂盒从黄鳝组织中提取RNA。提取的RNA使用紫外分光光度计测定浓度和质量之后，由HiScript®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链。
1.2.2 黄鳝Eakr基因cDNA克隆及基因结构的获得
根据GenBank 公布的其他物种基因cDNA序列，设计简并引物AKR-F和oligod(T)-R引物(表1)，用于黄鳝Eakr基因 cDNA片段扩增。PCR反应体系：10 μL 2×Taq Mix，0.5 μL F上游引物，0.5 μL R下游引物，8 μL ddH2O，1 μL cDNA模板。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环。PCR产物进行凝胶电泳验证，送交生工生物工程(上海)股份有限公司武汉分公司进行测序。为了研究黄鳝Eakr的基因组结构，笔者用表1中的引物对Eakr基因的内含子进行了扩增，引物对I1F/R、I2F/R、I3F/R、I4F/R、I5F/R、I6F/R分别用于扩增内含子。
表1 引物序列及用途
利用DNAMAN 6.0软件，根据所得cDNA片段设计基因特异性RACE引物AKRGSP5和AKRGSP3，分别用于基因的5′和3′RACE扩增；
RACE反转录按照SMARTer©RACE 5′/3′ Kit User Manual(TaKaRa公司)说明书进行；
Touchdown扩增反应程序如下：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，70 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，5个循环；
94 ℃预变性1 min，64 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，32循环；
72 ℃延伸10 min。所得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测经切胶回收纯化后，与pEASY-T1载体连接，转化至DH5α感受态细胞中，挑取3个阳性克隆进行序列测定。
利用DNAMAN 6.0软件，将所得cDNA序列与5′和3′末端所得cDNA序列进行拼接，得到黄鳝Eakr基因全长cDNA序列；
采用基因特异性引物PCR扩增各内含子序列，克隆测序后，运用DNAMAN 6.0软件将获得序列结果与cDNA序列进行拼接与分析，获得黄鳝基因组DNA。
1.2.3 荧光定量PCR
根据黄鳝Eakr基因cDNA全长序列，设计荧光定量引物(表1)。以β-actin基因的表达作为内参。测定保存的脑、血细胞、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肌肉、性腺、皮肤、脾脏、胃11个组织中Eakr基因mRNA相对表达量，以此分析Eakr基因在黄鳝各组织中的特异性表达。测定15 mg/L Cd2+处理后，肝脏中Eakr基因与Nrf2基因mRNA相对表达量的变化趋势。提取黄鳝各组织总RNA并合成cDNA，以黄鳝各组织cDNA为模板，使用2×SYBR Green PCR Mix试剂(simgen公司)检测Eakr基因mRNA表达水平，反应在CFX96TM Real-Time PCR Detection System扩增仪(Bio-Rad公司)上进行。PCR反应体系(25 μL)：2×SYBR Green PCR Mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性5 s，57 ℃退火45 s， 40个循环。采用2-△△Ct法分析Eakr基因的相对表达量。
1.2.4 斑点法测定重组菌株的生长活力
使用斑点法分析在不同浓度Cd2+的胁迫下，pET-28a-Eakr重组质粒菌株与pET-28a空质粒菌株生长活力与存活率的区别。将pET-28a-Eakr重组质粒菌株用LB培养基37 ℃、220 r/min振荡培养至600 mn 光密度约0.6时，加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min诱导培养4 h。取5个Eppendorf管，各加入1 mL诱导后菌液，同时加入CdCl2，使其终浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L，37 ℃、150 r/min培养1 h。离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体后，使用1 mL新鲜LB重悬。取5 μL处理后的菌液点在LB平板(含50 μg/mL卡那霉素) 上于37 ℃培养箱中培养，12 h后将平板放入菌落分析仪中拍照并保存。将含pET-28a空质粒菌株做以上相同处理，每个处理重复3次。将上述菌液进行100倍的稀释后，取50 μL均匀涂在含CdCl2(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)的LB平板(含50 μg/mL卡那霉素)上，置于37 ℃培养箱中培养12 h后，使用菌落分析仪计算菌落数目。将pET-28a空质粒菌株在不含CdCl2的平板上生长的菌落数计为100%，以此为基准计算不同处理下的菌落数。
1.2.5 数据处理与分析
基因测序结果用美国国家生物技术中心上的BLAST进行比对(http: //www．ncbi．nlm．nih．gov．BLAST/)，试验结果均记录为平均值±标准误，采用SPSS 20软件中的单因素方差分析进行统计分析，使用Origin 7.5 软件绘制柱状图，当P<0.05时为差异显著。
2.1 Eakr基因序列
Eakr基因cDNA全长为4468 bp，包含1026 bp的开放阅读框(ORF)，编码341个氨基酸，5′端非编码区长度为74 bp，3′端非编码区长度为195 bp。通过比较黄鳝AKR基因的cDNA序列(GenBank序列号KF819395.1)克隆测序后，运用DNAMAN 6.0软件将获得序列结果与cDNA序列进行拼接与分析，获得黄鳝基因组DNA。Eakr基因由7个外显子和6个内含子组成，内含子分别为373、841、540、514、112、766 bp(图1)。
图1 Eakr基因的cDNA序列和推导的氨基酸序列
2.2 Eakr基因组织表达分析
荧光定量PCR分析Eakr基因在不同组织中的表达情况。结果显示，Eakr基因在黄鳝各个组织中均有表达，在肠道、肾脏、肝脏、性腺和胃组织中表达量相对较高，其中肝脏组织中表达最高，肌肉中表达量最低(图2)。
图2 Eakr mRNA在黄鳝不同组织中的相对表达量
2.3 Cd2+胁迫下黄鳝肝脏中Eakr与Nrf2基因的表达差异分析
使用15 mg/L的CdCl2处理黄鳝，随后通过荧光定量PCR检测黄鳝肝脏组织中Eakr与Nrf2基因的相对表达水平。结果显示：CdCl2处理后，Eakr mRNA在各个时间点均有显著升高(P<0.001)(图3a)；
CdCl2处理后，Nrf2 mRNA表达水平呈波动趋势，相比对照组，Nrf2在3 h和24 h表达量显著升高(P<0.05)，而在处理后3、6 h和12 h Nrf2 mRNA表达量达到极显著水平(P<0.001)(图3b)。结果表明，Cd2+处理会诱导Nrf2基因和其下游Eakr基因的表达。
图3 氯化镉暴露后黄鳝肝脏Eakr基因(a)和Nrf2基因(b)的相对表达
2.4 Eakr基因对Cd2+胁迫下大肠杆菌生物活力的影响
使用CdCl2处理Eakr基因重组菌株与pET-28a空质粒菌株，用LB平板培养12 h后，分析菌株的生长情况与存活率，以此鉴定Eakr基因在体外是否具有耐胁迫性。结果显示，不同浓度Cd2+胁迫下，Eakr基因重组菌株均比空白质粒菌株生长旺盛，当Cd2+浓度升至2.0 mmol/L时，空白质粒菌株已无明显菌落，但是Eakr基因表达菌株仍有部分存活(图4a)。随着Cd2+浓度的不断升高，Eakr基因重组菌株和空白质粒菌株的存活率均有下降，但是空白质粒菌株下降更显著，且Eakr基因重组菌株存活率均高于空白质粒菌株，当Cd2+浓度升至1.5 mmol/L和2.0 mmol/L时，Eakr基因重组菌株的存活率显著高于含空白质粒菌株(P<0.001)(图4b)。结果表明，Eakr基因的表达可以在一定程度上提高大肠杆菌的生长活力与存活率。
图4 Cd2+胁迫下重组黄鳝Eakr对大肠杆菌生长活力与存活率的影响
醛酮还原酶是在醛和酮还原中具有多种功能的依赖还原型辅酶Ⅱ的氧化还原酶，通过还原型辅酶Ⅱ提供还原力，可以将醛酮类化合物通过加氢的方式还原成相对应的醇类化合物，从而降低其毒害作用。醛酮还原酶AKR基因作为应激反应基因，受氧化、亲电、渗透胁迫和热激调节[14]，不仅参加机体防御工作还作为防御酶存在[8]，与机体抗氧化应激相关。
3.1 Eakr结构分析
目前国内外对鱼类醛酮还原酶鲜见报道，仅有Hassanin等[15]对尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)醛酮还原酶AKR1A1的报道，发现苯并芘可以诱导罗非鱼肝脏中AKR1A1基因的表达，醛酮还原酶AKR1A1可能对水生生态系统中广泛存在的苯并芘具有解毒作用。黄鳝醛酮还原酶拥有(α/β)8桶状结构、底物结合域、辅酶结合域和保守的催化中心。大多数醛酮还原酶共有催化四分体，由(Asp-Tyr-Lys-His)组成，而黄鳝醛酮还原酶催化四分体由(Asp-Tyr-Ala-His)组成。
3.2 Eakr转录本表达特征
醛酮还原酶基因表达具有组织广泛性。Macleod等[16]利用Western blot技术和免疫组织化学技术发现，AKR基因在小鼠的脾脏、肝脏、肾脏和肺部等组织中均有表达；
Ge等[17]发现，AKR1B7基因在人精管、肾上腺、眼睛、肠道、肝脏、肾脏和睾丸等组织中均有表达。在水生动物中，醛酮还原酶基因也在多个组织中表达。Mochizuki等[18]从皱纹盘鲍(Haliotisdisushannai)肝胰脏中检测出AKR基因的表达；
在尼罗罗非鱼的各个组织中均能检测到该基因的表达，并且肝脏中的表达量最高[15]。笔者采用荧光定量PCR检测了Eakr基因在黄鳝脑、血细胞、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肌肉、性腺、皮肤、脾脏、胃等11个组织中的相对表达量，结果显示，Eakr基因在黄鳝各个组织中都有表达，且在肝组织中表达量最高。由此可见，水产动物中醛酮还原酶基因的表达规律为：在各个组织均有表达，且在肝脏(肝胰脏)中表达量最高。组织表达差异性与组织的生物学功能有关，肝脏(肝胰脏)是鱼类脂肪合成、氧化应激反应的主要发生场所，所以笔者推测，该基因可能参与了肝脏细胞的发育过程与解毒抗氧化过程。
3.3 镉暴露下黄鳝Eakr基因和Nrf2基因的表达分析
镉是自然界中主要的应激源之一，Cd2+诱导会导致鱼类活性氧的产生促使细胞死亡，为了保护细胞和组织免受氧化损伤，细胞会上调抗氧化的能力。淡水鱼通过鳃和皮肤摄入Cd2+，在血浆中利用蛋白与金属离子结合，完成对金属离子的利用，储存和排泄后，多余的Cd2+在以肝脏和肾脏为主的器官中聚集，导致脂质沉积、氧化应激和线粒体功能障碍等产生。在鲤(Cyprinuscarpio)抗氧化应激过程的研究中发现，Cd2+暴露会导致鲤脾脏免疫受到抑制，产生氧化应激[19]，诱导肝脏和肝细胞中活性氧的产生。为了应对非生物胁迫诱导的氧化损伤，生物机体通常会提高细胞体内醛酮还原酶的活性，以减轻氧化损伤。曾有研究表明，AKR7A在对乙酰氨基酚/对苯二酚亚胺暴露后显著上调，从而显著提高抵御乙酰氨基酚/对苯二酚亚胺诱导的肝毒性的能力[20]。目前，Cd2+暴露下对AKR基因表达影响的研究较少，但是在其他非生物因子胁迫下，AKR相关基因的表达情况有相应的报道。如：在厌氧胁迫下诱发AKR11B基因表达；
在高渗透压、过氧化氢胁迫下诱发AKR2B6基因表达等[21]。有学者自注射苯并芘的尼罗罗非鱼中检测到了AKR1A1基因的cDNA，并发现胆汁和肝脏中AKR1A1基因的mRNA表达量最高，这表明暴露于苯并芘中会诱导罗非鱼中醛酮还原酶相关基因的表达[15]；
Agrawal等[22]研究发现，镉胁迫导致鱼腥藻(Anabaenasp．)的AKR17A1基因表达量升高，分析发现，醛酮还原酶可以对镉胁迫产生的活性羰基物质进行解毒来提供耐应力性。
越来越多的研究显示，当细胞处于氧化应激条件下，Keap-1-Nrf2-ARE信号通路被激活，来调节多种抗氧化蛋白的表达，进而减轻细胞所受损害[23]。Matsunaga等[24]研究证实，AKR1C1和AKR1C3通过Keap-1-Nrf2-ARE信号通路进行表达调控，核因子E2相关因子2(Nrf2)是调节氧化应激反应的核转录因子，醛酮还原酶作为Nrf2的下游信号因子，受到Nrf2的调控。结合上述荧光定量PCR结果推测，Eakr基因参与黄鳝应对Cd2+胁迫导致的活性氧代谢过程，也表明Keap-1-Nrf2-ARE信号通路可能参与黄鳝醛酮还原酶表达调控过程。本试验中荧光定量PCR检测结果显示，暴露于Cd2+的黄鳝各组织中的Eakr基因与Nrf2基因的表达量显著高于对照组，表明Nrf2和醛酮还原酶等被Cd2+诱导产生，Cd2+处理会诱导Eakr基因和Nrf2基因的表达，可能是由于Cd2+诱导机体产生氧化应激反应，从而开启Nrf2-Keap1抗氧化信号通路，导致Nrf2基因及其下游Eakr基因的表达。
3.4 Cd2+胁迫下Eakr基因对大肠杆菌生物活力的影响分析
阚延泽等[12]发现，Eakr基因重组菌株生长活力明显高于阴性对照菌株；
AKR17A1基因在大肠杆菌中的异源表达会使菌体在非生物因子如高温、紫外线B和镉的胁迫下表现出更好的生长态势[25]；
野生大麦表达外源基因拟南芥AKR4C9的过程中，显著提高了对铬和盐胁迫的耐受性[26]；
醛酮还原酶ALDRXV4基因的表达同样增强了大肠杆菌对盐和重金属等的耐受性。笔者用斑点法测定pET-28a-Eakr重组质粒菌株(Eakr基因重组菌株)与pET-28a空质粒菌株(空白质粒菌株)的存活率，结果显示，随着Cd2+浓度的提高，Eakr基因重组菌株与空白质粒菌株的存活率均有降低，但同等条件下Eakr基因重组菌株的存活率始终高于空白质粒菌株。试验结果表明，黄鳝醛酮还原酶可以在体外对细胞起到保护作用，以减少重金属对细胞的毒害作用，增强在非生物胁迫下的耐受性。
综上所述，笔者克隆了黄鳝醛酮还原酶(Eakr)基因并阐明了其结构，荧光定量PCR技术检测到Eakr基因在黄鳝的脑、血细胞、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肌肉、性腺、皮肤、脾脏、胃中表达，且肝脏表达水平最高；
Cd2+诱导下Eakr基因表达水平上升，且Nrf2基因表达水平也显著提高。研究结果显示，重组大肠杆菌生长活力在同等生长环境下明显高于对照组，表明Eakr基因可对抗因Cd2+诱导而产生的氧化应激。研究结果可为黄鳝应对环境胁迫及重金属毒理学研究提供重要参考。
