中老年高同型半胱氨酸血症基因多态性与叶酸治疗效果的关联性研究
时间：2023-06-23 10:00:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
李 丽，李 浩，陈雪梅 ，吉 林，郑修银
(四川省宜宾市第一人民医院 a.神经内科，b.健康管理中心，c.心内科，四川 宜宾 644000)
同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是蛋氨酸的中间代谢产物，血液中Hcy水平与心脑血管疾病、慢性肾病、糖尿病、阿尔兹海默症甚至复发性流产等多种疾病密切相关[1]，高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)已成为高血压、动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中的独立危险因素，有研究认为，Hcy水平每上升5 μmol/L，卒中发生概率会升高59%[2]。HHcy与基因多态性有一定相关性，其中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)和甲硫氨酸合成还原酶 (methionine synthase reductase, MTRR) 是Hcy代谢过程中的关键酶，其基因多态性与HHcy密切相关[3]。补充叶酸能有效降低Hcy，对预防心脑血管疾病有一定作用，但研究发现并非所有HHcy患者经过足够剂量和长期补充叶酸都能将Hcy降至正常水平[4]，这可能是个体的相关基因多态性决定了对叶酸补充的敏感性不同有关[5]。HHcy是遗传和环境共同作用的结果，基因多态性也与地域、民族等因素有关[6]，本文通过观察中老年HHcy患者的相关基因多态性分布特征及其叶酸治疗效果，探讨HHcy叶酸治疗失败分子层面的原因。
1.1 一般资料2020年1～12月于宜宾市第一人民医院健康管理中心确诊为HHcy的患者400例，纳入标准：①Hcy≥15 μmol/L[7]；
②年龄50～75岁；
③本地区居住时间≥5年；
④自愿参与本研究且同意规律叶酸补充90 d以上者。排除标准：①近1月内有补充叶酸或B族维生素者；
②有心脑血管疾病史；
③合并严重感染、肝肾功能不全、恶性肿瘤及自身免疫性疾病。剔除叶酸补充期间依从性差的患者，最终纳入334例，其中男181例，女153例，249例来自城市，85例来自农村；
年龄(56.6±5.9)岁，<60岁者174例，60～70岁101例，70岁以上59例；
汉族304例，少数民族30例；
体质指数(BMI)<24 kg/m2261例，≥24 kg/m273例；
已婚273例，其他61例；
108例有吸烟史，122例有饮酒史，共有吸烟饮酒史者89例。研究经宜宾市第一人民医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1血浆Hcy检测 抽取清晨空腹血约5 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝试管中，4000 r/min离心10分钟分离血浆立即检测或存于4 ℃冰箱冷藏待检，血浆Hcy浓度检测采用荧光定量法，检测仪器为山东博迈达生产的同型半胱氨酸POCT检测仪，试剂盒也由山东博迈达提供。
1.2.2MTHFR及MTRR基因多态性检测 样本收集后送到金域医学检验成都公司进行检测，生化检测剩余血液提取DNA，采用PCR荧光探针法检测外周血基因组DNA中MTHFR基因C677T(rs1801133)多态性位点，试剂盒由武汉明德生物科技股份有限公司提供。采用RT-PCR技术检测 MTHFR基因A1298C(rs1801131)和MTRR基因A66G (rs1801394)多态性位点，每个样品反应体系为10 μl，内含 3.86 μl纯水、DNA模板(浓度5 ng/μl)1 μl，2×KASP Master Mix 5 μl，KASP引物Mix 0.14 μl。PCR反应条件：94℃预变性15 min，扩增10个循环(94 ℃变性20 s，61℃退火1 min，每个循环温度下降0.6 ℃)，接着再进行26个循环扩增(94 ℃变性20 s，55 ℃退火1 min)，反应结束后，实时荧光定量PCR(ABI 7500 fast)读取样品孔的终点荧光，然后利用分析软件判定基因位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分型。
1.2.3叶酸补充及结果判定 所有研究对象均在体检后遵医嘱外另补充叶酸5 mg/d[8]，补充周期90 d，院外期间每2周电话随访一次，叮嘱患者规律用药，90 d后调查患者依从性，将依从性差(每周漏服药物2次及以上)或未复查血浆Hcy者剔除出本研究，干预周期结束后复查血浆Hcy水平，根据Hcy水平(Hcy≥15 μmol/L或<15 μmol/L)将疗效分为无效组和有效组[9]。
1.3 统计学方法所有数据采用SPSS 23.0进行统计分析。遗传平衡分析采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验，基因各位点分型及等位基因频率用频数或率描述，其组间比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 不同一般情况HHcy患者各基因SNP分布特点MTHFR基因C677T位点CC型、CT型和TT型占比分别为20.1%、33.2%和46.7%，A1298C位点AA型、AC型和CC型占比分别为58.1%、25.7%和16.2%，MTRR基因A66G位点AA型、AG型和GG型占比分别为55.4%、31.1%和13.5%，将不同一般情况HHcy患者的各基因SNP分布进行比较，不同居住地、民族及吸烟饮酒史的rs 1801131基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)；
不同居住地、BMI及吸烟饮酒史的rs1801394 基因型分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 不同一般情况HHcy患者MTHFR及MTRR各等位基因频率比较MTHFR基因rs1801133的C、T等位基因占比分别为36.7%和63.3%，rs1801131的A、C等位基因占比分别为71.0%和29.0%，MTRR基因rs1801394的A、G等位基因占比分别为71.0%和29.0%。将不同一般情况HHcy患者各等位基因分布占比进行比较，rs1801131 C等位基因不同居住地和吸烟饮酒史差异有统计学意义(P<0.05)，rs1801394 G等位基因不同居住地和民族分布频率差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.3 不同叶酸治疗效果患者各基因SNP分型分布比较叶酸治疗3个月后，有效组271例，无效组63例，两组患者MTHFR基因rs1801133和rs1801131的SNP分型差异有统计学意义(P<0.05)，无效组MTHFR基因T677T型及C1298C基因型构成比高于有效组(P<0.05)，而MTRR基因 rs1801394基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
2.4 不同叶酸治疗效果患者各基因等位基因分布比较叶酸治疗3个月后，治疗后无效组rs1801133 T等位基因、rs1801131 C等位基因及MTRR基因G等位基因频率高于有效组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。
表1 不同一般情况HHcy患者MTHFR基因C677T、A1298C及MTRR基因A66G分布情况 [n(%)]
表2 不同一般情况HHcy患者MTHFR基因及MTRR基因各等位基因分布比较 [n(%)]
表3 不同叶酸治疗效果两组患者的基因SNP分型分布比较 (n)
表4 不同叶酸治疗效果两组患者的等位基因分布比较(n)
高同型半胱氨酸血症是心脑血管病的重要诱因，相关代谢酶关键基因的多态性可能导致HHcy，其中MTHFR和MTRR基因多个位点突变可能诱发HHcy，研究表明：MTHFR基因C677T及A1298C单核苷酸多态性影响Hcy相关代谢酶活性，从而增加心血管疾病发病风险[10]。MTHFR位于细胞质中，结构不稳定，C677T 和A1298C分别位于α螺旋结构与β折叠结构的转角处和α螺旋结构中，不同基因型对MTHFR结构有一定影响[11]，进而影响MTHFR酶活性。研究表明，MTHFR基因C677T 基因型为TT时，其酶活性仅为CC型时的一半[12]，A1298C位点CC型时酶活性仅为AA型的63.0%左右[13]。MTHFR和MTRR的基因型分布有一定人种、民族和地域分布差异[14,15]，但不论哪种人群，其C677T位点为TT型时，其高同型半胱氨酸血症、代谢综合征、心血管疾病发病率均显著升高[16]。本研究发现，不同居住地、民族和吸烟饮酒史的rs 1801131基因型分布差异有统计学意义，不同居住地、BMI及吸烟饮酒史的rs1801394 基因型分布差异有统计学意义，不同民族存在基因型分布差异。渠巍等对贵州省汉族和布依族人群MTHFR基因和MTRR基因多态性分析，认为两个基因位点存在民族和地域差异[17]。喻艳琴等也分析了贵州苗族、布依族和汉族人群MTHFR基因rs1801133多态性，发现也存在不同民族间的差异，并认为其与原发性高血压有相关性，T677T是原发性高血压的危险因素[18]。有研究指出，饮酒会影响水溶性维生素吸收，加之尿液排出增加，直接导致叶酸缺乏[19]，吸烟者也可能因饮食结构改变，水果蔬菜摄入量减少，从而减少叶酸的摄入量，导致HHcy的发生。
叶酸是一种水溶性维生素，通过参与Hcy的再甲基化途径起到降低Hcy的作用，从而降低患者心脑血管疾病的发生风险[20]。有研究表明，高同型半胱氨酸血症患者容易发生叶酸缺乏，其原因与相关基因多态性密不可分[21]。补充叶酸对HHcy患者的效果可能受较多因素影响：①同型半胱氨酸代谢需要其他B族维生素(B6、B12)的参与，单独补充叶酸是否能达到临床治疗效果尚证据不足[22]；
②MTHFR和MTRR基因多态性影响同型半胱氨酸代谢，可能导致叶酸治疗失败的风险[23]；
③对HHcy者建议的叶酸补充量目前尚无统一标准，临床上叶酸使用剂量从0.4～45 mg，大部分研究认为5 mg左右能达到比较好的疗效[24]。2016年《H型高血压诊断与治疗专家共识》指出，MTHFR T677T基因型是冠心病的独立危险因素，建议H型高血压患者应进行MTHFR C677T基因型检测，判断H型高血压危险分层，精准治疗和预防并发症[25]。本研究发现：MTHFR基因T677T型和C1298C型或者MTHFR 677 T等位基因和1298 C等位基因是5 mg叶酸治疗HHcy失败的重要影响因素，但同一患者同时存在多种HHcy高危基因型会不会导致更严重的高同型半胱氨酸血症或对叶酸治疗更不敏感尚不得而知。MTHFR C677T 位点多态性可能通过改变蛋白质局部空间结构，降低MTHFR与其配体的结合能力，影响酶的催化活性，从而导致HHcy和心脑血管疾病的发生[26]。有研究显示，当高血压病史、冠心病病史和MTHFR T677T等3种因素同时存在时，叶酸治疗HHcy失败的风险是非此组合人群的8.84倍[23]。
综上，高同型半胱氨酸血症患者rs1801133的TT型、rs1801131的CC型及rs1801394的GG基因型构成有一定居住地、民族、BMI和吸烟饮酒史差异，rs1801133 T等位基因、rs1801131的C等位基因及rs1801394的G等位基因构成比也有类似分布趋势，5 mg叶酸治疗效果与rs1801133和rs1801131的基因型有关，MTHFR的T677T和C1298C基因型患者叶酸治疗效果差。
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