苦柏颗粒洗剂对大鼠肛肠术后创面愈合的促进作用及对炎症的抑制作用研究*
时间：2023-06-22 21:35:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
常树勋,王宝婷,孙艳军
(焦作市人民医院肛肠科，河南 焦作454000)
肛肠疾病是影响人类健康的主要慢性病之一，我国成年人的肛肠病患病率达50%以上[1]，主要症状有肛内肿物脱出、肛门坠胀感、肛门周围疼痛、便血等。长期便血可导致失血性贫血、感染等并发症，且痔易脱垂、嵌顿[2]，影响患者健康。手术是治疗肛肠疾病的常用方式，但肛肠手术多为开放式，且位置特殊，易造成术后感染，影响术后恢复[3]。因此，肛肠术后用药物促进创面愈合尤为必要。临床研究显示，在肛肠术后采用中药治疗可镇痛，消肿，减少炎性分泌物，促进伤口愈合，提高患者生活质量[4-5]。对于肛肠疾病术后患者，使用中药洗剂可收到杀菌抗炎、消肿止痛的效果，可促进创面愈合。苦柏颗粒洗剂以苦参、黄柏为主要原料，有清热凉血、燥湿解毒、活血止血、止痒止痛的功效。研究[6]表明，苦柏颗粒具有抑制炎症、改善皮肤屏障功能的作用。目前虽有苦柏颗粒用于皮肤创面的相关研究，但用于肛肠术后者较少。本研究通过建立大鼠肛肠术后模型，观察苦柏颗粒洗剂对大鼠肛肠术后创面的愈合作用和对炎症反应的影响。
1.1 动 物
无特定病原体(SPF)级SD大鼠50只，雌雄各半，7周龄，体质量180～220 g，购自河南省实验动物中心，生产许可证编号为SCXK(豫)2017-0001，饲养于焦作福瑞堂制药有限公司，使用许可证编号为SYXK(豫)2020-0005。饲养环境是12 h/12 h光照黑暗循环，温度18～26 ℃，湿度40%～70%，适应性饲喂7 d。实验过程遵循3R原则。
1.2 药品、试剂与仪器
苦柏颗粒洗剂药物组成：苦参10 g，黄柏6 g，蒲公英5 g，紫花地丁5 g，马齿苋5 g，明矾2 g，艾叶2 g，防风3 g，芒硝3 g，三棱5 g，甘草片3 g，莪术5 g，红花6 g。苦柏颗粒洗剂由焦作市人民医院制剂室自制，使用前将上述60 g药物倒入100 mL沸水中制成苦柏颗粒洗剂，用温度计测量，冷却至38～42 ℃时进行涂抹。马应龙麝香痔疮膏，武汉马应龙药业集团股份有限公司产品，产品批号170209，20 g/支。大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,均为北京索莱宝科技有限公司产品，批号依次为SEKR-0009、SEKR-0005、SEKR-0006；
兔抗大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抗体、核因子κB(NF-κB)抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，均为英国艾博抗公司产品，批号依次为ab207483、ab220803、ab150077。EM UC7切片机，德国徕卡公司产品；
CX43显微镜，日本奥林巴斯公司产品；
PHomo酶标仪，奥地利安图斯公司产品等。
1.3 动物分组、模型的建立与给药
适应性饲养1周后，随机选取10只为正常组，剩余40只根据参考文献[7]建立肛肠术后模型。造模前1 d禁食，当日禁水，每只大鼠按照2.5 μL/g腹腔注射质量分数20 g/L戊巴比妥钠麻醉，将其仰卧固定于实验台；
用质量分数80 g/L硫化钠在大鼠肛周及鼠尾近端脱毛，消毒；
待肛门松弛后，以肛缘为界，将皮肤切至黏膜下层，切口修剪为三角形(底宽约1 cm，高约2 cm)，深至皮下深筋膜层。手术1 d，出现肛周急性炎症并伴有充血、肿胀、渗液即为造模成功。本实验中，40只大鼠均造模成功。将40只模型大鼠随机分为模型组、马应龙痔疮膏组、苦柏颗粒洗剂隔日1次组、苦柏颗粒洗剂1 d 2次组，每组10只。造模成功后24 h开始治疗，马应龙痔疮膏组使用马应龙痔疮膏于肛门创面均匀涂抹薄薄一层，1 d 2次；
苦柏颗粒洗剂隔日1次组使用苦柏颗粒洗剂连续3次涂抹肛门创面，自然晾干，隔日涂抹1次；
苦柏颗粒洗剂1 d 2次组使用苦柏颗粒洗剂连续3次涂抹肛门创面，自然晾干，1 d 2次。治疗时间为10 d。
1.4 检测指标
于给药第1、5、10天对大鼠术后创面进行症状评分，并于末次评分后采用颈椎脱臼法处死大鼠，取肛周组织。
1.4.1 创面局部症状评分
创面局部症状评分标准：肛周表面无创伤，计0分；
创面完全愈合，无红肿，计1分；
创面基本愈合，创面红肿不明显，计2分；
创面未愈合，有红肿，偶有渗液，计3分；
创面未愈合，红肿较为严重，渗液较多，计4分。分值越高表示创面愈合程度越低。
1.4.2 创面黏膜的组织病理学形态
取大鼠肛周创面组织，以体积分数为100 mL/L甲醛固定，石蜡包埋后切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脱蜡5 min，梯度浓度乙醇脱水，苏木精-伊红(HE)染色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，于显微镜下观察组织病理学形态。
1.4.3 肛周组织中TNF-α、IL-6和IL-10水平
采用ELISA法按照试剂盒说明书进行操作。取大鼠肛周组织剪碎，研磨，酶标板上加入预包被特异性抗体，37 ℃温育30 min，弃去上层液体，加入酶标制剂50 μL，37 ℃温育30 min，洗涤，加入50 μL显色剂A，后加入50 μL显色剂B，震荡混匀后，37 ℃避光显色15 min，加入终止液50 μL，于450 nm波长处酶标仪读数吸光度值(A)，根据标准曲线，计算TNF-α、IL-6及IL-10水平。
1.4.4 肛周组织p38MAPK、NF-κB蛋白表达情况
采用Western blot检测。取-80 ℃保存的大鼠肛周组织，加入RIPA裂解液裂解细胞，收集到离心管，离心后取上层清液，用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量。取适量裂解产物，上样，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束之后，转移至聚偏二氟乙烯膜中，50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，加入I抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜，洗涤，加入相应的II抗(1∶3 000)室温孵育1 h，洗涤，加入电化学发光反应液孵育3 min，于暗盒中曝光，显影冲洗，测定蛋白条带的积分光密度值。以GAPDH为内参，p38MAPK、NF-κB与内参蛋白条带灰度比值为目的蛋白相对表达量。
1.5 统计学分析
2.1 各组大鼠术后创面局部症状评分对比
术后第5、10天，创面局部症状评分组间对比，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组对比，3个药物组第5、10天术后创面局部症状评分均降低(P<0.05)。与马应龙痔疮膏组对比，2个苦柏颗粒洗剂组第5、10天术后创面局部症状评分均升高(P<0.05)。与苦柏颗粒洗剂隔日1次组对比，苦柏颗粒洗剂1 d 2次组第5、10天术后创面局部症状评分降低(P<0.05)。4组的术后创面局部症状评分均随时间延长而降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
表1 各组大鼠术后创面局部症状评分对比 分，
2.2 各组大鼠肛周创面组织病理学形态对比
正常组：黏膜上皮组织排列整齐，无任何病理变化。模型组：黏膜上皮组织缺失严重，有明显腺体缺失现象，水肿和充血严重，大量炎性细胞浸润。马应龙痔疮膏组：肛周黏膜上皮组织排列整齐紧密，结构较为完整，有轻度红肿，无明显充血。苦柏颗粒洗剂隔日1次组：黏膜上皮组织和腺体缺失，水肿、充血，有少量炎性细胞浸润。苦柏颗粒洗剂1 d 2次组：病理变化较苦柏颗粒洗剂隔日1次组病变减轻，黏膜上皮较为完整，偶有腺体缺失，黏膜下层水肿和充血程度较轻。见图1。
A.正常组:肛周创面组织未见病理改变。B.模型组：肛周黏膜上皮组织缺失严重，发生明显水肿和充血，大量炎性细胞浸润。C.马应龙痔疮膏组:肛周黏膜上皮组织轻度红肿，无明显充血。D.苦柏颗粒洗剂隔日1次组：组肛周黏膜上皮组织少量缺失，存在水肿和充血，少量炎性细胞浸润。E.苦柏颗粒洗剂1 d 2次组：肛周黏膜上皮较完整，偶有腺体缺失，水肿、充血及炎性细胞浸润较少。图1 各组大鼠术后创面病理图(HE染色，×200)
2.3 各组大鼠肛周组织中TNF-α、IL-6和IL-10水平对比
大鼠肛周组织中TNF-α、IL-6和IL-10水平组间对比，差异均有统计学意义(P<0.01)。与正常组对比，模型组和3个药物组肛周组织中TNF-α、IL-6水平均升高，IL-10水平均降低(P<0.05)。与模型组对比，3个药物组肛周组织中TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。与马应龙痔疮膏组对比，2个苦柏颗粒洗剂组肛周组织中TNF-α、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。与苦柏颗粒洗剂隔日1次组对比，苦柏颗粒洗剂1 d 2次组肛周组织中TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。见表2。
表2 各组大鼠肛周组织中TNF-α、IL-6和 IL-10水平对比
2.4 各组大鼠肛周组织中p38MAPK和 NF-κB蛋白表达水平对比
大鼠肛周组织p38MAPK和NF-κB蛋白相对表达水平组间对比，差异有统计学意义(P<0.01)。与正常组对比，模型组和3个药物组肛周组织p38MAPK和NF-κB蛋白相对表达水平均升高(P<0.05)；
与模型组对比，3个药物组肛周组织p38MAPK和NF-κB蛋白相对表达水平均降低(P<0.05)。与马应龙痔疮膏组对比，2个苦柏颗粒洗剂组肛周组织p38MAPK和NF-κB蛋白相对表达水平均升高(P<0.05)。与苦柏颗粒洗剂隔日1次组对比，苦柏颗粒洗剂1 d 2次组肛周组织p38MAPK和NF-κB蛋白相对表达水平降低(P<0.05)。见表3和图2。
表3 各组大鼠肛周组织中p38MAPK和 NF-κB蛋白表达水平对比
A.正常组;B.模型组;C.马应龙痔疮膏组；
D.苦柏颗粒洗剂隔日1次组；
E.苦柏颗粒洗剂1 d 2次组图2 各组大鼠肛周组织p38MAPK和NF-κB蛋白相对表达水平对比(Western blot法)
肛肠疾病的发病部位为大肠和肛门，临床上以痔疮、肛裂、肛瘘、肛周脓肿最为常见。手术治疗后，肛周术后创面可刺激炎性因子产生，提高机体疼痛敏感性，导致肛肠疾病患者术后出现急慢性疼痛[8]。排便，手术对肛门、直肠及邻近组织的牵拉、挤压和损伤，以及肠道内细菌感染易造成创面炎症而影响术后恢复。外用药物是临床常见的促进肛肠术后创面愈合的方法，可以阻隔创面与肠道细菌的接触，降低肛周创面的敏感性，缩短愈合时间。
中医学认为，饮食不节、风湿燥热、情志失调、气血不和、腹脏虚弱、气血亏虚等是引起肛肠疾病的因素，其中以风、湿、燥、热四邪尤为突出，故肛肠疾病术后应配合清热解毒、燥湿凉血的药物进行治疗。苦柏颗粒洗剂中，苦参可祛湿泻热，止痒，杀虫[9]；
黄柏可泻火解毒[10]；
蒲公英清热解毒，利尿散结；
地丁可抗菌消炎、消肿止痛[11]；
马齿苋可散血消瘀[12]；
明矾可收湿敛疮[13]；
艾叶可祛湿止血[14]；
防风可解毒消肿；
芒硝可泻下通便[15]；
三棱和莪术可清除瘀滞，清利湿热；
红花可活血化瘀，理气止痛；
甘草片可调和药物，缓和泻下作用。诸药共用，发挥祛湿消肿、活血行气、清热止痛等作用。李舜等[16]研究表明，苦参和黄柏提取物有一定的消炎、抑菌作用。本研究中，局部症状评分结果显示：模型组和各药物组的症状评分随时间延长而降低，苦柏颗粒洗剂两个组症状评分低于模型组。HE染色显示：模型组黏膜上皮缺失严重，有明显腺体缺失现象，伴随严重的水肿和充血；
苦柏颗粒洗剂2个药物组较模型组组织病理学变化轻，且苦柏颗粒洗剂1 d 2次组优于苦柏颗粒洗剂隔日1次组。此外，各药物组肛周组织中的促炎因子TNF-α、IL-6水平较模型组下降，抑炎因子IL-10水平明显升高。以上结果均提示，苦柏颗粒洗剂可减轻肛肠术后炎症反应，改善肛周创面组织病理学形态。肛肠术后造成的创面病理基础是血瘀和湿热，使用苦柏颗粒洗剂在充分清洁创面的同时，还可发挥消炎、促愈等功效，促进肛周局部毛细血管扩张，使药物有效成分通过创面表面作用于患处，从而减少炎性渗出物分泌，缓解水肿，促进创面愈合。
肛周术后炎症机制与复杂的网络转导有着不可分割的联系，其中NF-κB和p38MAPK与炎症反应密切相关[17]。p38MAPK通路在炎症反应中起着调控作用。当炎症发生时，促炎细胞因子可以激活p38MAPK，并延长其活化时间；
当p38MAPK过度抑制或激活时，可致伤口的瘢痕形成或愈合延迟[18]。NF-κB信号通路在TNF-α等促炎因子作用下，可参与IL相关基因的表达，阻断细胞凋亡，调控炎症反应的消退。炎症发生时，细胞质内的NF-κB复合物进入细胞核，诱导炎症相关基因的转录和表达[19-20]。NF-κB可刺激TNF-α等细胞因子的表达，而这些细胞因子又可以刺激NF-κB，进一步活化NF-κB，造成持续或放大炎症反应[21]。研究[22-23]证实，p38MAPK和NF-κB的活化可介导炎症反应的发生。本研究中，肛肠术后，3个药物组和模型组的TNF-α和IL-6的水平逐渐上升，IL-10的水平下降，p38MAPK和NF-κB的表达逐渐上升，提示苦柏颗粒洗剂能改善肛肠术后症状和病理变化，减轻炎症反应，其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB通路的激活有关。
综上所述，苦柏颗粒洗剂可以改善肛肠术后创面肛周局部症状和组织病理变化，减轻炎症因子水平，其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB通路有关。
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