一例番鸭呼肠孤病毒与鸭疫里默氏菌共感染的实验室诊断
时间：2023-06-22 20:30:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
谢碧林 林志敏 林彬彬 翁汉东 莆田市农业科学研究所 福建莆田 351100
随着番鸭养殖行业不断发展壮大，水禽疫病也呈现出日益复杂的态势。番鸭呼肠孤病毒病的主要特征是软脚，剖检见肝脏和脾脏出现小白点，肾脏肿大、出血，俗称番鸭“肝白点病”、“花肝病”[1-2]。鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的一种接触性传染性疾病，感染鸭有明显的纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎等病变[3]。
2021年11月，本所实验室接诊一例来自莆田市荔城区某雏番鸭养殖户的病例。该养殖户共有4个鸭舍，存栏6 000多羽雏番鸭，采用双层网上平养养殖模式。22日龄时，其中1个鸭舍开始发病，每日约有40羽死亡，患鸭精神萎靡，食欲不振，腿软不愿意走动，部分鸭出现站立不稳，头歪转圈等共济失调症状。鸭舍通风不良，氨味浓。剖检病死鸭，可见心脏布满白色纤维素渗出物，脾脏有大量白色点状坏死，胰腺表面散布白色坏死点，肾脏肿大。根据临床症状、剖检病变及实验室分离检测结果，确诊为番鸭呼肠孤病毒与鸭疫里默氏菌共感染病例。
1.1 材料
1.1.1 病料组织 病料无菌采自莆田市荔城区某雏番鸭养殖户疑似感染番鸭呼肠孤病毒与鸭疫里默氏菌的22日龄病死番鸭的肝脏、脾脏、胰腺、肾脏和脑等病变组织。
1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）、麦康凯琼脂、药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；
细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GeneRed核酸染料，购自天根生化科技有限公司；
第一链cDNA合成Master Mix、柱式病毒RNA抽提纯化试剂盒、Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程有限公司。
1.1.3 引物设计与合成 参照文献[4-10]合成鸭疫里默氏菌外膜蛋白A基因（OmpA）引物及番鸭呼肠孤病毒、鸭甲肝病毒、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒、鸭瘟病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鸭腺病毒2型、鸭腺病毒3型等病毒检测引物。鸭疫里默氏菌外膜蛋白A基因（OmpA）及番鸭呼肠孤病毒检测引物见表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表1 部分检测引物序列及相关参数
1.2 方法
1.2.1 细菌分离鉴定
1.2.1.1 细菌的分离纯化 无菌挑取病死番鸭脑组织，分别划线接种至麦康凯琼脂培养基及加入2%胎牛血清的TSA培养基，TSA培养基平板放入烛缸，与麦康凯培养基一起置于37℃温箱中培养24～48 h。
1.2.1.2 细菌PCR检测 挑取纯培养菌落于50 μL ddH2O中，吹打混匀，沸水浴5 min，自然冷却后5 000 r/min离心5 min，取上清作为模板进行PCR检测，同时以ddH2O作为空白对照。PCR反应体系20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR扩增程序：96℃预 变 性5 min，94℃变 性1 min，60℃退 火50 s，72℃延伸1 min，30个循环；
72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行Blast分析。
1.2.1.3 细菌药敏试验 根据抗微生物药物敏感性试验执行标准（CLSI）的要求，通过纸片扩散法对分离菌株进行抗菌药物的药敏试验。
1.2.2 常见病毒PCR检测 取适量病死番鸭病变组织，加入4倍量灭菌生理盐水研磨、匀浆，反复冻融3次，离心取上清，按照试剂盒说明书的要求提取病毒核酸，DNA存-20℃，RNA反转录后存-20℃备用。分别对上述样品按照文献[5-10]对疑似疫病病原（鸭甲肝病毒、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭腺病毒2型和3型）开展（RT-）PCR检测，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行Blast分析。
2.1 细菌的分离鉴定
2.1.1 细菌分离结果 病死番鸭脑组织病料经细菌纯化培养，在麦康凯琼脂平板上未见细菌生长；
在TSA平板上可见直径约1.5 mm、表面光滑、圆形稍隆起、边缘整齐的菌落，斜射光观察可见菌落呈淡蓝色，挑取典型单菌落进行纯培养。
2.1.2 细菌PCR检测结果PCR扩增得到的片段大小为809 bp，与预期结果一致（见图1）。将PCR产物送生物公司测序，测序结果在NCBI上Blast分析，结果显示，与鸭疫里默氏菌OmpA基因序列的同源性为100%。
图1 细菌、病毒PCR扩增检测情况
2.1.3 细菌药敏试验结果 药敏试验结果显示（见表2），该鸭疫里默氏菌分离株对氨苄西林、阿莫西林、头孢唑林、头孢曲松、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟、四环素、强力霉素、环丙沙星、氟苯尼考等药物高度敏感；
对青霉素G、恩诺沙星中度敏感；
对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素、红霉素、复方新诺明、多粘菌素等药物耐药。
表2 鸭疫里默氏菌药敏试验结果
2.2 病毒PCR检测结果 病毒PCR扩增显示，只有番鸭呼肠孤病毒扩增得到300 bp目的条带，其他病毒检测均未扩增出目的条带（见图1）。将以上PCR产物送生物公司测序后进行碱基序列比对，结果显示送检的PCR产物样品基因序列与GenBank中鸭呼肠孤病毒HP080421株的S2基因序列（登录号为JX852431.1）同源性为98%。
结合发病番鸭的临床症状、剖检情况和实验室病原检测结果，确定该病例为番鸭呼肠孤病毒与鸭疫里默氏菌共感染。
番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒引起的，国内胡奇林等[11]于2000年首次报道，随后吴宝成等[1]分离出该病毒，并鉴定为呼肠孤病毒。该病的主要病理表现为肝、脾表面分布有大量白点，肾脏出血、肿大。番鸭呼肠孤病毒感染通常有脾脏受损的现象，易引起其功能失常而致免疫抑制[12]，进而易继发大肠杆菌病[13]或鸭疫里默氏菌病[14]等细菌病。鸭疫里默氏菌是当前危害番鸭养殖的重要细菌病原之一，给番鸭养殖行业造成巨大的经济损失。
当前，番鸭养殖面临着复杂的生存环境，动物疫病对番鸭养殖业的危害越来越突出，诊疗的费用提升了番鸭的养殖成本。因此，减少诊疗的支出将是提高养殖利润的途径之一。在当前限抗和无抗养殖的背景下，动物疫病防控应当遵循“预防为主，防重于治”的方针，养殖户须积极主动做好疫苗防疫规划工作，化被动为主动，提高番鸭自身抵抗病原菌侵染的能力。
疫苗仍然是防控疫病的首选。据了解，莆田地区的孵化场，出雏当日均为其注射了番鸭呼肠孤病毒病疫苗，为该病的预防提供了一定的基础，现暂未发现该病大规模流行。
为提升动物疫病诊断准确性，对分离的细菌应进行血清分型和药物敏感性试验，做到有的放矢，避免因使用对病原不敏感的药物而造成浪费。在疫病防控过程中，生物安全措施发挥着重要的作用，而部分养殖业主特别是散养户观念相对落后，对番鸭养殖环境的生物安全措施重视程度不够，因此造成惨痛的经济损失。动物疫病诊疗从业者应积极引导，普及更新养殖业主的专业知识，提升动物福利。
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