不同剂量电离辐射对人γδT细胞体外增殖与细胞毒活性的影响
时间：2023-06-22 08:55:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
王路路，周忠海，陈 玲，杨 阳，陈复兴，孙蕾清，吕小婷，冯守信
电离辐射（ionizingradiation）是指会引起物质电离、破坏原子或分子结构的辐射。一般认为，接受长时间或较高强度的电离辐射会危害机体健康，导致器官和系统发生病理改变，引起放射病，甚至具有诱导癌症发生的可能性。近年来，电离辐射诱导免疫激活的现象逐渐引起科研人员的兴趣，其潜在的控制肿瘤的作用及其机制已成为研究热点。研究表明，较低剂量辐射不仅不会损害机体的免疫功能，反而能够正向调节免疫系统，抑制和延缓原发或转移性肿瘤的进展[1，2]；
上调免疫系统的固有和适应性免疫能力是其重要机制之一[3]。
γδT细胞是外周血中一类独特的T淋巴细胞群，在防御多种病原体和清除转化细胞方面发挥着重要作用，在人外周血淋巴细胞中的比例约为1%～5%，并且以δ2细胞亚群为主，是机体具有非特异性免疫和适应性免疫双重效应的免疫细胞，可通过T细胞受体依赖性地识别磷酸化抗原来活化和扩增，发挥强大的抗肿瘤效应。文献调研表明，既往实验主要进行以整体动物或动物细胞为模型的不同剂量电离辐射作用的研究，而电离辐射能否对人γδT细胞产生影响未见报道。因此，笔者拟进行不同剂量电离辐射对人γδT细胞体外增殖及细胞毒活性的影响实验，探讨电离辐射应用于肿瘤生物治疗的可能性，为寻找增强细胞活性的合适剂量提供参考依据。
1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞
选择8例健康志愿者，其中男性5例，女性3例，年龄为（35±8）岁。抽取外周血并分离获得单个核细胞，采用无血清培养液加白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）细 胞 因 子 和 异 戊 烯 焦 磷 酸（isopentenyl diphosphate，IPP）的方法活化扩增人γδT细胞。人肝癌细胞株HepG2购自于中国科学院细胞库/干细胞库（上海）。
1.1.2 主要试剂
最小必需培养液 （minimum essential medium，MEM）（Invitrogen，美国）；
GT551 H3培养液（TaKaRa，日本）；
胎牛血清、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液（Gibco，美国）；
重组人白细胞介素2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2）（厦门特宝生物工程股份有限公司，中国）；
淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，中国）；
异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人γδT细胞受体（cell receptor，CR）单抗、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的穿孔素（perforin）单抗、PE标记的颗粒酶B（granzyme B）单抗、别藻青蛋白（allophycocyanin，APC）标记的溶酶体相关膜蛋白-1（lysosome-associated membrane protein 1）单抗（CD107a单抗）（eBioscience，美国）；
Fix＆Perm破膜和固定剂（英杰生命技术有限公司，美国）；
乳酸脱氢酶测定试剂盒（上海复星长征医学科学公司，中国）。IPP、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）（分析纯）（Sigma，美国）。
1.1.3 主要设备
直 线 加 速 器 治 疗 机 （精 度99.8 %；
2300C/D SN416型）（Varian，美国）；
酶标仪（KHB st-360型）（上海科华实验系统有限公司，中国）；
全自动生化分析仪（AU680型）（Beckman Coulter，美国）；
倒置相差显微镜 （TE-2000型）（Nikon，日本）；
CO2培养箱（HF90/HF240型）（上海力康公司，中国）；
流式细胞仪（flow cytometry，FCM Calibur型）（BD，美国）。采用Cell Quest软件分析细胞，每个标本分析细胞数大于104个细胞。
1.2 方法
1.2.1 人γδT细胞的培养及鉴定
在无菌条件下，抽取健康志愿者（健康志愿者均知情同意，签属知情同意书）20 mL上臂外周静脉血；
使用抗凝管抗凝处理，加入淋巴细胞分离液后离心，获取外周血单个核细胞。经PBS洗涤后加入至GT551 H3无血清培养液中，补加rhIL-2（浓度100 IU/mL）、IPP（质量浓度2μg/mL）溶液，形成初始细胞密度为1×106/mL的细胞溶液；
置于温度为37°C、体积分数5%CO2细胞培养箱中培育，每2 d补完全培养液1次。10 d后，收集培养增殖的少量细胞，经PBS洗涤后，再将细胞配成1×107/mL，取100μL与20μL FITC标记的抗人γδT CR单抗在室温下避光孵育15 min，再次使用PBS洗涤后经上机检测人γδT细胞的百分含量，评估γδT细胞是否有效扩增。
1.2.2 人γδT细胞的纯度分析
收集扩增效率达80%以上的人γδT细胞，经PBS洗涤2遍后悬浮于含0.5%牛血清白蛋白、2 mmol/L EDTA的PBS中，采用抗人γδT CR单抗包被的磁珠阳性分选γδT细胞，使用流式细胞术分析细胞纯度。
1.2.3 不同剂量辐射人γδT细胞进行分组
将分选纯化后的人γδT细胞按1×107/mL的细胞密度转移至6孔细胞培养板中，每孔3 mL，采用直线加速器治疗机，于室温条件下以6 MV X射线分别给 予0.08、0.50、2.00、4.00、6.00 Gy进 行 辐 射。其 中0.08 Gy剂 量 组 辐 射 时 机 架 （gantry angle，GA）为270°，源皮距（source skin distance，SSD）=500 cm，辐射野10 cm×10 cm，剂量率为0.08 Gy/min，输出量为2 Gy/min，培养皿前覆盖1.5 cm等效填充物（补偿膜）；
其余各组均采用垂直辐射，GA为180°，SSD=100 cm，辐射野15 cm×15 cm，剂量率为2.00 Gy/min，分别给予0.50 Gy、2.00 Gy、4.00 Gy、6.00 Gy辐射，培养皿底部垫1.5 cm等效填充物。相应设置0.00 Gy未辐射对照组（简称未辐射对照组）。辐射结束后置于温度为37°C、体积分数为5%CO2环境下的培养箱内继续培养。
1.2.4 不同剂量辐射后人γδT细胞的增殖分析
人γδT细胞辐射后继续培养24、48 h，收集各剂量辐射组细胞，经PBS洗涤后采用台盼兰染色法计数活细胞数，分析人γδT细胞增殖情况。
1.2.5 HepG2细胞的培养
从液氮中取出HepG2细胞株，温水快速复苏，接种于MEM（含10%胎牛血清）中，置于温度为37°C、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中培育，每2 d补完全培养液1次。使用倒置相差显微镜观察HepG2细胞形态，查看细胞生长情况，及时换液传代，收集处于对数生长期HepG2细胞诱导培养，待实验。
1.2.6 乳酸脱氢酶 释放法检测 人γδT细胞对肝 癌HepG2细胞的杀伤活性
以辐射后继续培养24 h和48 h的人γδT细胞作为效应细胞，以处于对数生长期HepG2细胞作为靶细胞，按照效靶比20∶1的比例置于温度37°C、体积分数5%CO2环境下的细胞培养箱中共孵育6 h，置于1 500 r/min下离心10 min，收集各组上清液，在全自动生化分析仪上于340 nm波长下检测光密度（optical density，OD）值。每组设置3个复孔，以单独效应细胞和靶细胞作为对照组，计算各组细胞杀伤活性。计算公式为：杀伤活性（%）=[（OD实验组-OD效应细胞自然释放组-OD靶细胞自然释放组）/（OD靶细胞最大释放组-OD靶细胞自然释放组）]×100%[4]，实验重复3次。
1.2.7 流式细胞术 检测人γδT细胞 胞内抗原穿 孔素、颗粒酶B的表达
取辐射后继续培养48 h的各组人γδT细胞，离心弃去上清液，经洗涤后，再加入PBS调整细胞密度为1×107/mL。取各组细胞悬液100μL，加入FITCanti-TCR-γδ、PerCP-Cy5.5标记的抗人CD3单抗各20μL，室温下避光孵育20 min，然后加入Fix＆Perm破膜剂继续孵育15 min，再加入PE标记的抗人穿孔素单抗5μL，避光孵育20 min后用PBS洗涤，弃去上清液；
再以400μL PBS重悬细胞，待机检测。
与检测穿孔素步骤相同，在加入Fix＆Perm破膜剂继续孵育15 min后，加入PE标记的抗人颗粒酶B单抗，避光孵育20 min后，重悬于0.5 mL的PBS中，待机检测。
1.2.8 流式细胞术检测人γδT细胞表面抗原CD107a的表达
取辐射后继续培养48 h的各组人γδT细胞，离心弃去上清液，经洗涤后，再加入PBS调整细胞密度为1×107/mL。取各组细胞悬液100μL，加入FITCanti-TCR-γδ、PerCP-Cy5.5标 记 的 抗 人CD3单 抗、APC标记的抗人CD107a单抗各20μL，室温避光孵育20 min，重悬于0.5 mL的PBS中，使用流式细胞术检测人γδT细胞表面抗原CD107a的表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0软件进行数据处理和统计学分析。实验数据以均数±标准差表示，运用单因素方差分析比较组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 人γδT细胞的鉴定
rhIL-2、IPP扩增培养的第10天，在倒置相差显微镜下可见细胞呈梭形、圆形、纺锤形等不同形态及大小不等的细胞集落（图1）。流式细胞术检测结果显示，γδT细胞百分含量为81.22%±3.51%，与扩增前分离的单个核细胞中的γδT细胞比例比较，γδT细胞得到了有效扩增；
经磁珠阳性分选纯化后的γδT细胞百分含量为96.76%±1.37%（图2）。
图1 人γδT细胞的形态学特征图（倒置相差显微镜，×400）Fig.1 Image of morphological characteristics of humanγδT cells(inverted phase contrast microscope,×400)
图2 人γδT细胞的流式细胞纯度鉴定图Fig.2 Image of purity identification of humanγδT cells by flow cytometry
2.2 人γδT细胞增殖能力
辐射后培养24、48 h的各组人γδT细胞中，0.08 Gy剂量组增殖最为显著，其辐射后培养24 h的扩增倍数为1.32±0.07，增殖能力较未辐射对照组增强（P＜0.05）；
辐射后培养48 h的扩增倍数为2.22±0.11，增殖能力较未辐射对照组显著增强（P＜0.01）。0.50 Gy剂量组较未辐射对照组略有增强，但差异无统计学意义（P＞0.05）；
其余各组人γδT细胞随辐射剂量增加呈增殖抑制趋势。见图3。
图3 不同剂量电离辐射后人γδT细胞的扩增比较柱状图Fig.3 The amplification comparison histogram of humanγδT cells after different doses of ionizing radiation
2.3 人γδT细胞对肝癌HepG2细胞的杀伤效应
按照效靶比20∶1比例共孵育6 h后，辐射后培养24 h的2.00 Gy剂量组、4.00 Gy剂量组人γδT细胞的杀伤活性分别为45.33%±3.22%、42.42%±3.54%，显著高于未辐射对照组（分别P＜0.01、P＜0.05）。辐射后培养48 h的2.00 Gy剂量组、4.00 Gy剂量组人γδT细胞的杀伤活性分别为47.33%±3.81%、43.85%±3.39%，显著高于未辐射对照组（分别P＜0.01、P＜0.05）。见图4。
图4 不同剂量电离辐射后人γδT细胞对HepG2细胞的杀伤活性柱状图Fig.4 Comparison histogram of cytotoxic activity of humanγδT cells against HepG2 cells after different doses of ionizing radiation
2.4 人γδT细胞穿孔素、颗粒酶B及CD107a的表达
流式细胞术检测显示，辐射后培养48 h的2.00 Gy剂量组、4.00 Gy剂量组人γδT细胞胞内穿孔素、颗粒酶B表达均显著高于未辐射对照组，2.00 Gy剂量组人γδT细胞表面CD107a表达显著高于未辐射对照组。见表1、图5。
表1 不同剂量电离辐射48 h后人γδT细胞穿孔素、颗粒酶B及CD107a的表达比较Tab.1 The expression comparison of perforin,granzyme B and CD107a in humanγδT cell after 48-hours ionizing radiation with different doses
图5 不同剂量电离辐射48 h后人γδT细胞穿孔素、颗粒酶B及CD107a表达的流式细胞图Fig.5 The expression of perforin,granzyme B,and CD107a in humanγδT cell after 48 hours of different doses of ionizing radiation by flow cytometry
T淋巴细胞（T lymphocyte）简称T细胞，来源于骨髓多能干细胞，通过淋巴和血液循环分布到全身的免疫器官和组织中，发挥免疫调节功能[5]。
人γδT细胞在外周血循环T淋巴细胞中的比例约占5%，在肿瘤监视和抗肿瘤免疫中发挥了主要作用[6]。与αβT细胞不同，γδT细胞占T细胞总数比例较低，但是功能独特，γδT细胞不需要经过抗原递呈，而是以主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）非限制的方式识别和杀伤靶细胞[7]；
通过膜表面分子和分泌多种细胞因子诱导和调节特应性免疫应答，是固有免疫和适应性免疫的桥梁[8]。
近年来，许多学者就如何提高γδT细胞体外增殖能力和增强肿瘤杀伤活性进行了深入的研究。研究表明，除了无翅型小鼠乳腺癌病毒整合位点（wingless-type MMTV integration site，Wnt）通路外，4，6-二取代吡咯并嘧啶（4，6-disubstituted pyrrolopyrimidine，TWS119）可通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路、上调抗凋亡蛋白Bcl-2（B cell lymphoma-2）的表达并抑制裂解的caspase-3蛋白显著增强γδT细胞的增殖和存活；
TWS119增强γδT细胞对人结肠癌细胞的细胞毒活性主要与体外及体内穿孔素和颗粒酶B表达的上调有关[9]。与通过IPP或唑来膦酸扩增的γδT细胞相比，IPP加雷西莫德扩增的γδT细胞对程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death 1，PD-1）表达较低的肿瘤细胞的细胞毒活性显著增强；
其机制为共刺激增强了磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）-哺乳动物mTOR通路和Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）7/8-MyD88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）通路的哺乳动物靶标的激活，雷西莫特以抗原呈递细胞依赖性和非依赖性方式刺激γδT细胞扩增[10]。
当前，放射治疗作为肿瘤治疗的重要手段广泛应用于临床，电离辐射可通过直接诱导肿瘤细胞死亡和调节表型等机制发挥其增强抗肿瘤免疫效能。研究表明，电离辐射可导致调节性T细胞牛叉头型基因P3（forkhead box protein 3 gene，Foxp3）表达下调从而减弱其对CD8+T细胞增殖的抑制效果[11]。低剂量辐射体内可增加抗氧化基因的表达，下调促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6的表达[12]，增加伤口愈合能力，还可以刺激机体正常细胞增殖，激活其防御系统，减少对正常组织的损伤，诱导适应性反应发生，从而减少高剂量放射治疗对机体免疫系统的损伤，增加对微小肿瘤的清除，降低癌症发生率[13]；
同时还具有增强癌症治疗效果和减少抗癌治疗毒副作用的潜力等[14]。低剂量辐射体外可激活自然杀伤（natural killer，NK）细胞功能，显著增强NK细胞的扩增和细胞毒活性[3，15]。为进一步验证电离辐射能否对人γδT细胞产生类似的作用，笔者尝试采用不同剂量电离辐射作为影响人γδT细胞生物学功能的干预手段，观察不同剂量电离辐射对人γδT细胞体外增殖与细胞毒活性作用，探讨其相关分子机制，为以人γδT细胞为基础的电离辐射联合细胞免疫治疗恶性肿瘤的可能性及合适剂量提供实验依据及参考。
为排除其他免疫细胞的干扰，笔者首先对培养扩增的人γδT细胞进行了磁珠阳性分选纯化，得到百分含量95 %以上的人γδT细胞，然后将纯化后的γδT细胞分组以相同的细胞密度分别接受了0.08、0.50、2.00、4.00、6.00 Gy的6MV X-ray电离辐射，再与HepG2细胞共孵育。结果表明，0.08 Gy电离辐射能够显著促进了人γδT细胞的增殖。该低剂量的免疫兴奋效应，有望为提高人γδT细胞体外扩增效率进而应用于肿瘤细胞免疫治疗提供一个低成本策略。
穿孔素/颗粒酶B途径是包括γδT细胞、NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）等在内的细胞毒淋巴细胞清除肿瘤的重要机制之一，细胞发挥抗肿瘤效应的分子机制与其活化后释放穿孔素和颗粒酶B等细胞毒效应分子密切相关[9，16]。笔者研究结果表明，2.00 Gy或4.00 Gy电离辐射虽然对人γδT细胞的增殖无明显的促进作用，但其能够显著上调γδT细胞穿孔素和颗粒酶B的表达。提示2.00 Gy或4.00 Gy电离辐射能够增强γδT细胞的细胞毒功能，从而提升其对肿瘤细胞的杀伤活性。溶酶体相关膜蛋白-1（CD107a）是CD8+T细胞激活后脱颗粒的标志物，与NK细胞、CD8+T细胞等免疫细胞的细胞毒功能密切相关[17，18]。笔者研究结果表明，2.00 Gy或4.00 Gy电离辐射后的人γδT细胞对HepG2细胞的杀伤效应显著增强，而2.00 Gy更为显著，这可能与电离辐射触发γδT细胞穿孔素、颗粒酶B表达增强导致的脱颗粒有关，该结果与Diegeler S等[19]对NK细胞暴露于不同辐射剂量后细胞毒活性增强的机制类似。CD107a为细胞毒效应功能的一个重要标志，其表达明显提高也间接地证明了2.00 Gy电离辐射对γδT细胞杀伤功能的免疫增强效应。
综上所述，单次0.08 Gy电离辐射能够显著促进体外人γδT细胞增殖能力，单次2.00 Gy或4.00 Gy电离辐射可显著增强人γδT细胞对肝癌HepG2细胞的肿瘤杀伤活性；
其机制可能与电离辐射促进人γδT细胞穿孔素、颗粒酶B及CD107a的表达相关。
