不同能量密度低能量激光治疗对大鼠运动性跟腱病急性阶段促炎介质表达的影响
时间：2023-06-21 15:05:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
吴艳萍 申晋波 王武年
(1苏州大学体育学院，江苏 苏州 215021；
2江苏大学体育部；
3太原师范学院体育系)
跟腱是连接小腿后方肌群和跟骨之间的最粗大肌腱，在人体进行不同形式运动时将肌肉力量传递至骨骼，然而不适宜的运动方式和运动强度可能引发跟腱病。据统计，约有11%患者因各种运动不当引发跟腱病急性发作，尤其高水平运动员发病率可高达52%，严重影响运动人群的运动训练及生活质量，因而针对跟腱病治疗的研究日趋增多〔1，2〕。跟腱病早期主要病理表现为肌腱胶原纤维紊乱，部分断裂，产生炎症反应，导致跟腱局部疼痛、肿胀，伴随时间延长，微损伤不能修复从而诱发慢性跟腱病的发生。在跟腱病炎症反应过程中，尤其是急性阶段，多种促炎介质参与其中，如白细胞介素(IL)-1、IL-6和IL-10、环氧合酶Ⅱ(COX-2)及肿瘤坏死因子(TNF)-α均被激活或者表达水平上调〔3，4〕。另一方面，跟腱病发生发展过程中，腱组织中基质金属蛋白酶(MMPs)的合成可发生明显变化〔5〕。促炎介质，如IL-1和TNF-α等，可以刺激腱细胞中MMPs的合成，破坏肌腱基质的重构过程，促进腱组织胶原蛋白Ⅰ和Ⅱ的降解，负面影响腱组织的结构完整性，加重跟腱病的发展。
现阶段针对跟腱病急性阶段最常见的保守治疗方法是应用非甾体抗炎药物(NSAIDs)进行抗炎镇痛。然而，NSAIDs对跟腱病的治疗有一定的争议，学者认为NSAIDs药物仅是减轻了跟腱病炎症的症状表现，但对跟腱病的致病因素没有任何干预，而且有研究发现NSAIDs镇痛效果与浓度呈现明显依赖性，长期应用对运动人群有一定的副作用〔6,7〕。而且，某些NSAIDs药物的使用还会增加运动人群肌腱病变发展的风险，因此研究者将关注的目光投向物理治疗〔8〕。低能量激光治疗(LLLT)作为一种物理治疗方式已被证实与局部应用NSAIDs药物相比可获得更好地抑制炎症疗效，而且有学者提出660 nm波长的 LLLT干预对腱细胞增殖及迁移有着重要的作用〔9〕；
另一方面，LLLT还可促进损伤肌腱血管的再生，且对Ⅰ型和Ⅲ型胶原的比例有改善，这些对于肌腱损伤的愈合及生物力学性能恢复都具有重要意义〔10〕。然而，现阶段大多数研究关注LLLT对运动员及运动人群慢性跟腱病的治疗效果，对于运动员及运动人群跟腱病急性阶段LLLT的影响机制研究涉及较少。本研究通过胶原酶注射构建跟腱病急性炎症阶段大鼠模型，试图通过不同能量密度LLLT干预，探究其对跟腱病急性炎症过程中涉及的重要促炎介质基因表达及含量的影响，为LLLT在运动员及运动人群跟腱病早期阶段应用提供理论基础。
1.1实验动物及分组 40只雄性健康SD大鼠，体重(260±20)g(购自中国药科大学实验动物中心)，分笼饲养，自由饮水、活动。饲料为标准颗粒饲料(中国药科大学实验动物中心提供)。随机分为正常对照(FP；
n=4)组、未治疗(CN；
n=6)组、双氯芬酸钠注射治疗(DS；
n=10)组、10 s-LLLT(LR-1；
n=10)组、30 s-LLLT(LR-3；
n=10)组。实验期间保持动物房温度18～24℃，相对湿度45%～55%，同时保证充足的自然光照。
1.2跟腱病动物模型的建立 为更好地模拟跟腱病急性阶段，本实验采用经典的胶原酶注射建模〔11〕。10%水合氯醛(40 mg/kg)大鼠腹腔内注射麻醉，固定于手术台，双侧下肢跟腱区剃毛备皮后，常规消毒，铺无菌洞巾。CN、DS、LR-1及LR-3组动物右侧踝关节屈曲 90°触及跟腱后，注射浓度为0.015 g/mlⅠ型细菌胶原酶(Sigma公司，美国)与 0.9%生理盐水混合无菌溶液20 μl，注射位置距离跟腱结节跟腱止点2 mm处，对侧跟腱不给予任何处理，注射后大鼠放入笼中自由活动，FP组相同部位仅注射相同剂量的磷酸盐缓冲液(PBS)。
1.3治疗干预及动物取材 造模后30 min DS组大鼠肌肉注射双氯芬酸钠(注射剂量为2.5 mg/kg)，而LR-1及LR-3术后1 h应用铝镓铟磷激光治疗仪(Photon Lase Ⅲ，巴西)注射处照射治疗，其中治疗仪波长660 nm，输出功率100 mW。LR-1组接受照射的能量密度为35.7 J/cm2，照射时间为10 s；
LR-3组接受照射的能量密度为107.1 J/cm2，照射时间为30 s，CN组则不做任何治疗。造模后2 h处死所有动物并分离下肢，迅速去除腱围及相连肌肉后取跟腱组织，液氮-80℃冷冻保存进行后续检测分析。
1.4采用实时荧光定量聚合酶反应(RT-PCR)技术测定跟腱组织中TNF-α、COX-2、IL-6、IL-10、MMP-3、MMP-9及MMP-13的mRNA表达水平 用Trizol法分组提取跟腱组织总RNA，测纯度后进行逆转录，随后将逆转录的cDNA稀释，进行RT-PCR检测。基因引物序列根据Primer6.0进行设计，引物由上海生物工程公司合成提供：TNF-α上游引物序列(5′-3′)：AAGGAGGTGATCGGTCCCAAC，下游(5′-3′)：CCACTCACGCTGGCTCAG；
COX-2上游引物序列(5′-3′)：GCGAGGACCTGAGATCAGAA，下游(5′-3′)：TGATGTCACATGAACTCACAT；
IL-6上游引物序列(5′-3′)：GCCTGCTGGTACCCATATGATGG，下游(5′-3′)：ACATACCAAGCACATGGGCAG；
MMP-3上游引物序列(5′-3′)：CATCTCTCCCGTTTCCTCAA，下游(5′-3′)：CACGAGGACATCGTGGGTAC；
MMP-9上游引物序列(5′-3′)：TTGCAATGTGGATG CAATCC，下游(5′-3′)：GAACTTCCTCCGTGATTCGA；
MMP-13上游引物序列(5′-3′)：TGGTCTTCTGATGGGCCTTC，下游(5′-3′)：GTCCAGGGAGCTGCTTTTTC；
IL-10上游引物序列(5′-3′)：GAAGAGAACATGGGTGTTGG，下游(5′-3′)：GG GCTTTCGAGACTGGAAGT；
β-actin上游引物序列(5′-3′)：TGGCACCACACTTTCTACAAAGAT，下游(5′-3′)：AGCACAGGGTCGGTGAGC。反应条件：55℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃15 s，65℃ 1 min，75℃ 15 s，扩增30个循环。
1.5IL-1β及前列腺素(PG)E2酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 取冷冻标本室温消融后，将各组跟腱组织剪碎充分匀浆后，依照试剂盒说明书(依科生物，中国)进行检测。450 nm波长处测量各孔吸光度OD值，通过绘制标准曲线分别求出标本中IL-1β及PGE2含量。
1.6统计学分析 采用SPSS19.0软件进行方差分析、Turkey检验。
2.1一般情况 造模4组大鼠跟腱注射胶原酶后，局部红、肿胀、充血，无皮肤破溃，无糜烂等，所有大鼠进入结果分析，实验整个过程无动物脱失。
2.2造模后急性期各组跟腱组织促炎介质相关基因表达 与FP组相比，CN组跟腱组织中促炎因子TNF-α、COX-2及IL-6基因表达水平均显著增高(P<0.01，P<0.05)，且与组织基质降解有关的酶MMP-3、MMP-9及MMP-13基因表达水平也显著增高(P<0.01,P<0.05)。DS、LR-1、LR-3组TNF-α、COX-2及IL-6基因的表达水平均较CN组显著降低(P<0.05，P<0.01)，LR-3组TNF-α、COX-2及IL-6基因表达水平显著低于DS和LR-1组(P<0.05)。LR-3组MMP-3明显低于DS和CN组(P<0.05)。LR-1组和LR-3组MMP-9及MMP-13基因表达水平均较CN和DS组显著下降(P<0.05)。见表1。CN组及治疗干预各组的IL-10基因表达水平均显著高于FP组(P<0.01)，而且3组治疗干预组与CN组相比，均显著上调了IL-10的表达水平(P<0.01)。见表2。
2.3各组IL-1β及PGE2含量比较 CN组跟腱组织中IL-1β及PGE2含量均显著高于FP组(P<0.05)。DS、LR-1、LR-3组IL-1β及PGE2含量较CN组明显下降(P<0.05，P<0.01)。与DS组治疗相比，LR-3组IL-1β含量下降更为显著(P<0.05)。见表2。
表1 各组跟腱组织促炎介质相关基因表达水平
表2 各组IL-10基因水平及IL-1β和PGE2的 含量比较
LLLT已被证实具有抗炎和缓解疼痛、促进慢性创面愈合等作用，且因便捷、有效、安全等诸多优点在运动医学领域广泛应用，特别是在肌肉骨骼系统和炎症性疾病方面。跟腱病致病因素首先造成跟腱组织纤维微损伤，随后腱组织发生一系列复杂反应，其中早期出现相关炎性因子增加的炎症反应，后期逐渐退变变性增加，损伤与修复并存，最终导致慢性跟腱病的发生〔12〕。因此研究者们试图通过对跟腱病急性阶段促炎介质的干预，即降低相关炎性因子的水平及抑制促进腱组织基质降解酶活性，如MMP-1、MMP-3等来达到治疗的目的〔13〕。因而本实验采用了胶原酶注射致大鼠跟腱炎急性阶段实验模型，其所导致的跟腱水肿和细胞外基质的急性破坏已被证实与自然跟腱急性损伤相似，被认为是研究跟腱病分子和组织学变化的典型模型。本研究结果提示，LLLT不仅抑制了跟腱病急性期腱组织中相关促炎介质的表达，而且抑制了促进腱组织基质退化发展的相关介质表达。
炎症对于组织损伤后的修复与再生是有益的，但是炎症的过度增加则会破坏组织恢复的稳态。IL-1β作为IL-1的一种亚型，是腱组织在炎症发生过程中最先被动员的细胞因子，研究发现肌腱急性损伤后早期促炎症因子IL-1β迅速上调并回落，且伴随着抑炎症因子IL-4与IL-10的后续性上调，反应炎症的激活与消退〔14〕。作为最先启动的炎性因子，IL-1β含量的增加也促进了损伤跟腱中炎性因子IL-6 及TNF-α基因的高水平表达。IL-6在损伤过程后的炎症反应中起重要作用，肌腱的急性炎症滑膜中升高的IL-6和IL-1刺激粒细胞和中性粒细胞显著增加，而且这些炎性因子的存在与运动人群肌腱断裂后疼痛过程中肌腱炎的进展直接相关。TNF-α则是炎症条件下由单核-巨噬细胞系产生，当肌腱创伤后它的表达增加，并且可能通过诱导炎症细胞增加在腱组织退化过程中起重要作用。腱组织中IL-10基因的表达明显上升，IL-10作为抑炎因子可抑制损伤部位IL-6和IL-8、TNF-α的表达及炎性细胞的迁移，包括巨噬细胞和单核细胞来抑制炎症。以上结果提示在跟腱病急性期炎症的发生发展与抑制是并存的，因此DS与LLLT照射均显著降低促炎性因子水平，包括IL-1β、IL-6及TNF-α，提高了抑炎因子IL-10的表达，有利于急性期炎症发生发展的控制。然而，LLLT不仅取得了与DS治疗相似的效果，而且对促炎因子表达下调及抑炎因子表达上调具有更积极的意义。本实验结果提示，较高能量照射的LLLT在降低炎性因子、提高抑炎水平方面可能效果更为明显。
跟腱病传统NSAIDs治疗方式主要是通过调节PGE2的合成，进而发挥抗炎镇痛作用。而PGE2是花生四烯酸通过COX-2代谢途径合成的细胞因子，因此在体内PGE2主要是由COX-2来进行调控。本研究中CN组COX-2基因表达上调，PGE2的含量明显增加。DS组治疗后，COX-2基因表达水平明显下降，PGE2的含量也随之明显下降。LLLT取得了与DS组相似的治疗效果，这一结果与以往研究者所观察结果相似〔15〕。提示LLLT抗炎镇痛作用机制有可能不同于NSAIDs。
Tsai等〔16〕发现NSAIDs药物布洛芬可导致MMP-1、MMP-8、MMP-9和MMP-13的表达上调从而对肌腱造成损害。本研究中也发现，尽管没有统计学意义，但是DS组MMP-9及MMP-13的基因表达高于CN组。MMPs在肌腱基质形态中起重要作用，通过它降解胶原和蛋白多糖维系腱组织基质代谢平衡。胶原酶如MMP-1、MMP-8、MMP-13 和MMP-18 降解肌腱基质中最重要的成分胶原；
明胶酶MMP-2和MMP-9裂解较小的胶原碎片和明胶；
基质蛋白酶 MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7、MMP-26和金属弹性酶MMP-12主要降解糖蛋白和蛋白聚糖，这些酶活性的增加可能对损伤中的肌腱胶原降解及其“愈合过程”产生重要影响〔17〕。本研究结果提示，相较于DS治疗，LLLT可以减少炎症条件下肌腱机械强度的损失，对肌腱组织起到良好保护作用，尤其是在高能量密度时可观察到较好的结果，这一结果提示LLLT对运动员及运动人群跟腱病的修复具有更好的促进作用。
综上，跟腱病急性炎症阶段应用660 nm、100 mW的LLLT可达到与NSAIDs相似的抗炎镇痛效果，尤其是能量密度107.1 J/cm2、照射时间30 s的LLLT可更为有效减轻胶原酶诱导的大鼠跟腱病急性炎症过程。而且与NSAIDs不同，LLLT还可以有效降低MMPs的表达，有助于肌腱机械性能的保护。LLLT可用于运动员及运动人群跟腱病早期炎症阶段的治疗，但相关组织学及力学性质等形态学还有待今后进一步实验进行验证。
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