miR-21-5p,靶向,TNFAIP3,对大鼠骨关节炎软骨细胞损伤的影响
时间：2023-06-21 08:10:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
唐超 魏伟生 蒋永颂 陆健
骨关节炎 (osteoarthritis，OA) 是世界上导致残疾的主要原因之一，其特征是炎症引起的关节软骨损伤和软骨细胞病死率升高[1-2]。目前，OA 的治疗药物主要是镇痛药和非甾体抗炎药，它们只能缓解疼痛，但对 OA 疾病的预防或改善没有明显的作 用[3-4]。因此，需要开发更好的靶向治疗剂。
MicroRNA (miRNA) 是 OA 的重要调节因子[5]。据报道，miR-21-5p 在 OA 患者的软骨组织中显著上调并影响软骨细胞增殖和凋亡，敲除 miR-21-5p 可显著减轻小鼠的关节软骨降解，减轻 OA 病理，可作为 OA 的新治疗靶点[6]。然而，miR-21-5p 在 OA 软骨细胞中的作用机制尚未完全明确。肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 3 (tumor necrosis factor alpha inducible protein 3，TNFAIP3)，也称 A20，是一种预防炎症的负调节因子，也是 OA 诊断的潜在标志物[7-8]。研究显示 TNFAIP3 是 miR-21-5p 的直接靶点，miR-21-5p 可与 TNFAIP3 的 3’-非翻译区结合抑制 TNFAIP3 的表达[9-10]。但 TNFAIP3 是否介导了 miR-21-5p 对 OA 的调控机制尚不清楚。因此，本研究旨在探索 miR-21-5p 对 OA 大鼠软骨细胞损伤的作用以及潜在机制。
一、主要试剂与仪器
改良 Eagle 培养基 (dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM)、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶均购自美国 Gibco 公司；
重组大鼠白介素 (interleukin，IL) -1β (ab9788) 购自英国 Abcam 公司，大鼠肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) (ml002859)、IL-6 (ml102828) ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；
二辛可宁酸 (bicinchoninincacid，BCA) 检测试剂盒 (P0012S)、放射免疫沉淀 (radio-immunoprecipitation assay，RIPA) 裂解液 (P0013B)、Cell Counting Kit-8 (CCK-8 试剂盒，C0038) 和末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记 (terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL) 细胞凋亡检测试剂盒 (C1091) 购自上海碧云天生物技术研究所；
膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素/ 碘化丙啶 (Annexin V-FITC/ PI) 细胞凋亡检测试剂盒 (abs50001) 购自爱必信 (上海) 生物科技有限公司；
番红 O/ 固绿 (safranin O/ fast green) 软骨染色液 (G1371) 购自北京 Solarbio 公司；
兔源一抗 TNFAIP3 (#5630)、核因子 κB p65 (nuclear factor κB p65，NF-κB p65) (#4764S)、p-NF-κB p65 (Ser536，#3031)、核因子 κB 抑制因子 α (nuclear factor κB inhibitor α，IκBα) (#4812)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) (#5174) 和 Alexa Fluor 555 标记的山羊抗兔 IgG (H+L) (#4413)、山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗 (#14708) 购自美国 Cell Signaling Technology 公司。iMark680 多功能酶标仪 (美国 Bio-Rad 公司)；
ABI Prism®7500 型荧光定量 PCR 仪 (美国应用生物系统公司)；
NanoDrop-2000 分光光度计 (美国 Thermo Scientific 公司)；
DM2500 荧光显微镜 (德国 Leica 公司)。
二、细胞实验
1.软骨细胞的分离、培养：从 5 只 4 周龄雄性 SD 大鼠 [ 中国科学院上海药物研究所，生产许可证 SCXK (沪) 2020-0005，体重 (140±10) g，在室温 23 ℃～25 ℃、相对湿度 50%～60%、12 h 光/ 暗循环下饲养 ] 的髋关节中分离软骨细胞。处死大鼠，并根据无菌要求分离关节软骨并使用 0.25% 胰酶消化 30 min；
然后使用含有 0.2% 胶原酶的 DMEM 培养基在 37 ℃ 下将组织再消化 4 h。消化后用 200 μm 过滤器去除组织碎片，并将细胞悬液以 1000 g 离心 5 min 以收获软骨细胞，随后将其在 DMEM 培养基 (10% 胎牛血清和 1% 青霉素 -链霉素) 中于 37 ℃、5% CO2环境下培养直至融合，培养基每 24 h 更换 1 次。
2.细胞分组与处理：取对数生长期的大鼠软骨细胞，以 5×105个细胞/ 孔的密度接种在 6 孔培养板中，分为对照组 (control 组)、IL-1β 组 (10 ng/ ml)、IL-1β+antagomir-NC 组、IL-1β+miR-21-5p antagomir 组、IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 组、IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组；
当细胞融合率达到 70% 时，使用 Lipofectamine 2000 将 50 nmol/ L miR-21-5p 抑制剂 (miR-21-5p antagomir)、用于 TNFAIP3 沉默的小分子干扰 RNA (si-TNFAIP3) 及其阴性对照 (antagomir-NC、si-NC) 转染细胞，然后在含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中培养。转染后 24 h，细胞在有或没有重组 IL-1β (10 ng/ ml) 的培养基中再处理 24 h，然后收获细胞用于进一步研究。
3.实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 检测软骨细胞中 miR-21-5p 和 TNFAIP3、Ⅱ 型胶原纤维 α1 基因 (collagen type Ⅱ alpha 1，COL2A1)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶 5 (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5，ADAMTS5)、基质金属蛋白酶-13 (matrix metalloproteinase-13，MMP-13) 的 mRNA 表达水平 (表 1)：使用 TRIzol 试剂从软骨细胞中分离总 RNA。RNA 质量使用琼脂糖凝胶电泳测定，浓度使用 Nanodrop-2000 分光光度计检测。根据说明使用反转录试剂盒将 2 µg RNA 反转录为 cDNA。在 ABI Prism 7500 型荧光定量 PCR 仪上进行扩增。热循环条件如下：95 ℃ 初始变性 2 min；
然后在 95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s 和 72 ℃ 25 s 下进行 40 个循环。使用公式 2-ΔΔCT分析基因表达。每个实验独立重复 3 次，U6 作为 miR-21-5p 的内部对照，mRNA 表达水平使用 GAPDH 进行标准化。
表1 用于 RT-qPCR 的引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR
4.ELISA 法检测炎症细胞因子水平：从每组细胞中收集样品上清液，然后将样品上清液以 1200 g 离心 5 min 以去除细胞碎片并储存在 -80 ℃ 冰箱中备用。使用大鼠 ELISA 试剂盒检测软骨细胞培养上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平。
5.CCK-8 法检测软骨细胞增殖活性：将 5×103个转染的细胞接种在 96 孔板中，并在含有 10% 胎牛血清的培养基中培养。根据实验分组进行适当处理后，向每个孔中加入 10 μl CCK-8 溶液，在 37 ℃ 下孵育 2 h。然后使用酶标仪在 450 nm 处测定光密度 (optical density，OD)。
6.流式细胞术检测软骨细胞凋亡：在转染后 24 h，将细胞与 IL-1β 一起培养 24 h，然后通过胰蛋白酶消化收集细胞并用 PBS 洗涤 2 次。然后将细胞重新悬浮在结合缓冲液中，在室温下用 5 μl annexin V-FITC 和 5 μl PI 避光孵育 15 min。通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。
7.免疫荧光染色分析软骨细胞 p-NF-κB p65 的核易位：软骨细胞用 10 ng/ ml IL-1β 刺激 24 h 后，用冷甲醇固定 20 min，然后用 0.3% Triton X-100 透化 15 min。在室温下用 5% 牛血清白蛋白封闭 1 h 后，将细胞与抗 p-NF-κB p65 的一抗在 4 ℃ 下孵育过夜。洗涤后，将细胞与 Alexa Fluor 555 标记的山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗在黑暗中孵育 1 h，DAPI 染色 5 min。使用 Leica 荧光显微镜查看结果。
8.Western blot 检测软骨细胞 TNFAIP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和 IκBα 蛋白表达：将细胞在 RIPA 裂解液中裂解，4 ℃ 下以 12 000 g 离心 10 min，取上清。使用 BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白浓度，进行定量，调整至均匀浓度，并在 100 ℃ 下变性 5 min。然后用 10% SDS-PAGE 凝胶上分离等体积的蛋白质并电转移到 PVDF 膜。用 5% 脱脂牛奶封闭 1 h 后，用相应的一抗 GAPDH、TNFAIP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和 IκBα 在 4 ℃ 下孵育过夜，所有抗体均以 1∶1000 稀释度使用。然后用二抗 (1∶4000) 室温进一步孵育 2 h。最后使用 ECL 试剂盒观察蛋白质条带，并进行定量。GAPDH 为内源性对照。
三、动物实验
1.动物分组与处理：将 40 只雄性 SD 大鼠 (6 周龄；
180～240 g，食物和水、光/ 暗循环和饲养条件与上述相同) 分为 4 组：假手术组、模型组、antagomir-NC 组、miR-21-5p antagomir 组，每组 10 只。除假手术组外，其余组大鼠采用内侧半月板切除术以诱导 OA。用戊巴比妥钠 (40 mg/ kg) 腹腔注射麻醉大鼠，打开右膝关节，仔细切除内侧半月板，没有任何关节软骨或韧带损伤。假手术组进行没有内侧半月板横断的关节切开术。1 周后，800 pmol/ L antagomir-NC 或 miR-21-5p antagomir 注射到大鼠膝关节内，每周 1 次。
2.RT-qPCR 检测 miR-21-5p 和 TNFAIP3 mRNA 水平：4 周后，处死大鼠，将膝关节标本分为两部分，一部分固定在 4% 多聚甲醛溶液中，用 10% EDTA 脱钙 2 个月后，用乙醇梯度脱水，包埋在石蜡块中；
另一部分使用 Trizol 试剂从组织中提取总 RNA，RT-qPCR 检测 miR-21-5p 和 TNFAIP3 mRNA 水平。
3.组织病理学分析：使用切片机将膝关节石蜡块切成 5 μm 的切片，用二甲苯脱蜡，然后用分级乙醇再水化。然后将切片用 TUNEL 和番红 O/ 固绿 (safranin O/ fast green) 染色。光学显微镜下拍照并使用 Image J 软件计数 TUNEL 阳性细胞 (褐色或棕褐色) 数，并计算 TUNEL 阳性细胞百分比 (TUNEL 阳性细胞数/ 细胞总数×100%)；
番红 O/ 固绿染色切片用于检查 OA 评分，根据国际骨关节炎研究协会 (Osteoarthritis Research Society International，OARSI) 软骨评估系统进行半定量评估 OA 的严重程度[11]。每个切片随机选择 3 个视野，取平均值。
四、统计学处理
采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，数据表示为，通过单因素方差分析和组间多重比较的 SNK-q检验，来确定多个组之间的统计显著性，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。
一、各组软骨细胞中 miR-21-5p 和 TNFAIP3、COL2A1、ADAMTS5、MMP-13 的 mRNA 表达水平
与 control 组相比，IL-1β 组软骨细胞中 miR-21-5p 和 ADAMTS5 mRNA、MMP-13 mRNA 水平显著升高，TNFAIP3 mRNA 和 COL2A1 mRNA 水平显著降低 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 组软骨细胞中 miR-21-5p 和 ADAMTS5 mRNA、MMP-13 mRNA 水平显著降低，TNFAIP3 mRNA 和 COL2A1 mRNA 水平显著升高 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组细胞中 TNFAIP3 mRNA 和 COL2A1 mRNA 水平显著降低，ADAMTS5 mRNA、MMP-13 mRNA 水平显著升高 (P＜ 0.05) (表 2)。
表2 各组大鼠软骨细胞中 miR-21-5p 和 TNFAIP3、COL2A1、ADAMTS5、MMP-13 的 mRNA 水平比较 (，n=3) Tab.2 Comparison of mRNA levels of miR-21-5p and TNFAIP3,COL2A1,ADAMTS5,MMP-13 in rat chondrocytes in each group (,n=3)
表2 各组大鼠软骨细胞中 miR-21-5p 和 TNFAIP3、COL2A1、ADAMTS5、MMP-13 的 mRNA 水平比较 (，n=3) Tab.2 Comparison of mRNA levels of miR-21-5p and TNFAIP3,COL2A1,ADAMTS5,MMP-13 in rat chondrocytes in each group (,n=3)
注：与 control 组相比，aP ＜ 0.05；
与 IL-1β 组相比，bP ＜ 0.05；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，cP ＜ 0.05Notice: Compared with control group,aP ＜ 0.05; compared with IL-1β group, bP ＜ 0.05; compared with IL-1β + miR-21-5p antagomir group, cP ＜ 0.05
二、各组大鼠软骨细胞培养上清液中 TNF-α 和IL-6 水平
与 control 组相比，IL-1β 组软骨细胞培养上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平显著升高 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 组软骨细胞培养上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平显著降低 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组细胞培养上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平显著升高 (P＜ 0.05) (表 3)。
表3 各组大鼠软骨细胞培养上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平比较 (，pg/ ml，n=3)Tab.3 Comparison of the levels of TNF-α and IL-6 in the culture supernatant of rat chondrocytes in each group (,pg/ ml,n=3)
表3 各组大鼠软骨细胞培养上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平比较 (，pg/ ml，n=3)Tab.3 Comparison of the levels of TNF-α and IL-6 in the culture supernatant of rat chondrocytes in each group (,pg/ ml,n=3)
注：与 control 组相比，aP ＜ 0.05；
与 IL-1β 组相比，bP ＜ 0.05；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，cP ＜ 0.05Notice: Compared with control group,aP ＜ 0.05; compared with IL-1β group, bP ＜ 0.05; compared with IL-1β + miR-21-5p antagomir group, cP ＜ 0.05
三、各组大鼠软骨细胞增殖活性
与 control 组相比，IL-1β 组软骨细胞增殖活性显著降低 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 组软骨细胞增殖活性显著升高 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组细胞增殖活性显著降低 (P＜ 0.05) (表 4)。
表4 各组大鼠软骨细胞增殖活性比较 (，n=3) Tab.4 Comparison of proliferation activity of chondrocytes in each group of rats (,n=3)
表4 各组大鼠软骨细胞增殖活性比较 (，n=3) Tab.4 Comparison of proliferation activity of chondrocytes in each group of rats (,n=3)
注：与 control 组相比，aP ＜ 0.05；
与 IL-1β 组相比，bP ＜ 0.05；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，cP ＜ 0.05Notice: Compared with control group,aP ＜ 0.05; compared with IL-1β group, bP ＜ 0.05; compared with IL-1β + miR-21-5p antagomir group, cP ＜ 0.05
四、各组大鼠软骨细胞凋亡
与 control 组 (3.54±0.05) % 相比，IL-1β 组软骨细胞凋亡率 (24.86±2.63) % 显著升高 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β 组 (24.86±2.63) %、IL-1β+antagomir-NC (25.10±2.24) % 相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 组软骨细胞凋亡率 (9.23±1.35) % 显著降低 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组 (9.23± 1.35) %、IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 组 (9.65±1.71) % 相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组细胞凋亡率 (18.37±2.06) % 显著升高 (P＜ 0.05) (图 1)。
图1 各组大鼠软骨细胞凋亡 (流式细胞术) a：control 组；
b：IL-1β；
c：IL-1β+antagomir-NC组；
d：IL-1β+miR-21-5p antagomir 组；
e：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 组；
f：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组Fig.1 Apoptosis of rat chondrocytes in each group ( flow cytometry ) a: Control group; b: IL-1β group; c: IL-1β + antagomir-NC group; d: IL-1β + miR-21-5p antagomir group; e: IL-1β + miR-21-5p antagomir + si-NC group; f: IL-1β + miR-21-5p antagomir + si-TNFAIP3 group
五、各组大鼠软骨细胞 p-NF-κB p65 的核易位
免疫荧光染色显示，control 组软骨细胞核中没有显示出强烈的绿色荧光，IL-1β 组软骨细胞核中显示出强烈的绿色荧光；
与 IL-1β 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 组软骨细胞核内的绿色荧光减弱；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组软骨细胞核内的绿色荧光增强 (图 2)。
图2 各组大鼠软骨细胞中 p-NF-κB p65 核易位的免疫荧光测定 a：control 组；
b：IL-1β；
：IL-1β+antagomir-NC 组；
d：IL-1β+miR-21-5p antagomir 组；
e：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 组；
f：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组Fig.2 Immunofluorescence assay of p-NF-κB p65 nuclear translocation in rat chondrocytes in each group a: Control group; b: IL-1β group; c: IL-1β + antagomir-NC group; d: IL-1β + miR-21 -5p antagomir group; e: IL-1β + miR-21-5p antagomir + si-NC group; f: IL-1β + miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 group
六、各组大鼠软骨细胞中 TNFAIP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和 IκBα 蛋白水平
与 control 组相比，IL-1β 组软骨细胞中 TNFAIP3 和 IκBα 蛋白水平显著降低，p-NF-κB p65/ NF-κB p65 比值显著升高 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 组 TNFAIP3 和 IκBα 蛋白水平显著升高，p-NF-κB p65/ NF-κB p65 比值显著降低 (P＜ 0.05)；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组 TNFAIP3 和 IκBα 蛋白水平显著降低，p-NF-κB p65/ NF-κB p65 比值显著升高 (P＜ 0.05) (图 3、表 5)。
表5 各组大鼠软骨细胞中 TNFAIP3、p-NF-κB p65/ NF-κB p65 和 IκBα 蛋白水平比较 (，n=3)Tab.5 Comparison of TNFAIP3, p-NF-κB p65 / NF-κB p65 and IκBα protein levels in chondrocytes of rats in each group (,n=3)
表5 各组大鼠软骨细胞中 TNFAIP3、p-NF-κB p65/ NF-κB p65 和 IκBα 蛋白水平比较 (，n=3)Tab.5 Comparison of TNFAIP3, p-NF-κB p65 / NF-κB p65 and IκBα protein levels in chondrocytes of rats in each group (,n=3)
注：与 control 组相比，aP ＜ 0.05；
与 IL-1β 组相比，bP ＜ 0.05；
与 IL-1β+miR-21-5p antagomir 组相比，cP ＜ 0.05Notice: Compared with control group,aP ＜ 0.05; compared with IL-1β group, bP ＜ 0.05; compared with IL-1β + miR-21-5p antagomir group, cP ＜ 0.05
图3 各组大鼠软骨细胞中 TNFAIP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和 IκBα 蛋白印迹图 (A：control 组；
B：IL-1β 组；
C：IL-1β+antagomir-NC 组；
D：IL-1β+miR-21-5p antagomir 组；
E：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 组；
F：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 组)Fig.3 Western blot of TNFAIP3, p-NF-κB p65, NF-κB p65 and IκBα in rat chondrocytes in each group ( A: Control group; B: IL-1β group; C: IL-1β + antagomir-NC group; D: IL-1β + miR-21-5p antagomir group; E: IL-1β + miR-21-5p antagomir + si-NC group; F: IL-1β + miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 group)
七、miR-21-5p antagomir 降低 OA 模型大鼠膝关节软骨细胞凋亡
与假手术组相比，模型组和 antagomir-NC 组大鼠膝关节软骨组织中 miR-21-5p 水平和 TUNEL 阳性细胞百分比显著升高，TNFAIP3 mRNA 水平显著降低 (P＜ 0.05)；
与模型组相比，miR-21-5p antagomir 组大鼠膝关节软骨组织中 miR-21-5p 水平和 TUNEL 阳性细胞百分比显著降低，TNFAIP3 mRNA 水平显著升高 (P＜ 0.05) (图 4、表 6)。
表6 各组 OA 模型大鼠膝关节软骨组织中 miR-21-5p、TNFAIP3 mRNA 水平和 TUNEL 阳性细胞百分比比较 (，n=10) Tab.6 Comparison of miR-21-5p,TNFAIP3 mRNA levels and percentage of TUNEL positive cells in knee articular cartilage tissue of OA model rats in each group (,n=10)
表6 各组 OA 模型大鼠膝关节软骨组织中 miR-21-5p、TNFAIP3 mRNA 水平和 TUNEL 阳性细胞百分比比较 (，n=10) Tab.6 Comparison of miR-21-5p,TNFAIP3 mRNA levels and percentage of TUNEL positive cells in knee articular cartilage tissue of OA model rats in each group (,n=10)
注：与假手术组相比，aP ＜ 0.05；
与模型组相比，bP ＜ 0.05Notice: Compared with the sham operation group,aP ＜ 0.05;compared with the model group,bP ＜ 0.05
图4 各组 OA 模型大鼠膝关节软骨细胞凋亡 (TUNEL) a：假手术组；
b：模型组；
c：antagomir-NC 组；
d：miR-21-5p antagomir 组Fig.4 Apoptosis of knee articular chondrocytes in OA model rats in each group (TUNEL) a: Sham operation group;b: Model group;c: Antagomir-NC group;d: miR-21-5p antagomir group
八、miR-21-5p antagomir 降低 OA 模型大鼠膝关节软骨损伤
番红 O/ 固绿染色结果显示，假手术组大鼠膝关节软骨结构完整，番红 O 染色均匀，模型组大鼠出现膝关节 OA 症状，包括表面裂隙的形成，番红 O 染色减少以及深层出现肥大软骨细胞；
与假手术组 0.32±0.05 相比，模型组 5.74±0.60 和 antagomir-NC 组 5.80±0.63 大鼠 OARSI 评分显著升高 (P＜ 0.05)；
与模型组 5.74±0.60 相比，miR-21-5p antagomir 组大鼠膝关节番红 O 染色增加，OARSI 评分 2.51±0.39 显著降低 (P＜ 0.05) (图 5)。
图5 各组大鼠膝关节番红 O/ 固绿染色 a：假手术组；
b：模型组；
c：antagomir-NC 组；
d：miR-21-5p antagomir 组Fig.5 Safranin O/ fast green staining of knee joints of rats in each group a: Sham operation group;b: Model group;c: Antagomir-NC group;d: miR-21-5p antagomir group
研究显示，miR-21-5p 在 OA 中高表达，是 OA 潜在的治疗靶点[6]。先前的报道称，10 ng/ ml IL-1β 可诱导软骨细胞发生炎症反应和软骨细胞凋亡[12]，IL-1β 参与 OA 进展；
并且 IL-1β 可诱导软骨细胞 MMP (如 MMP-13) 表达增加，进而导致 OA 中的软骨降解以及软骨细胞特异性蛋白 (如胶原蛋白 Ⅱ) 的低表达[13]。因此，本研究中使用 10 ng/ ml 作为 IL-1β 的工作浓度，刺激软骨细胞以模拟 OA 的病理生理学。
MMP-13 可分解细胞外基质中的蛋白多糖，如蛋白聚糖和胶原蛋白，是 OA 中软骨破坏的主要机 制[14]。ADAMTS 家族是复杂的分泌蛋白，在组织形态发生和病理生理重塑、炎症和血管生物学中具有关键和广泛的作用。有证据表明 ADAMTS5 是 OA 发病机制中裂解蛋白聚糖的主要蛋白聚糖酶，并且是 OA 治疗干预的潜在靶点[15]。本研究结果显示，在体外软骨细胞中 miR-21-5p 的表达在 IL-1β 刺激后上调，并且 IL-1β 促进软骨细胞中炎症介质的释放 (IL-6、TNF-α) 以及细胞凋亡，并刺激软骨细胞产生高水平的 MMP-13 和 ADAMTS5 以及低水平的 COL2A1，破坏关节软骨稳态。在 IL-1β 诱导的软骨细胞中，下调 miR-21-5p 可以改善 COL2A1、ADAMTS5 和 MMP-13 的变化，减少细胞凋亡和炎症因子释放，逆转软骨细胞外基质的重塑。这与之前的研究一致，表明 miR-21-5p 是 OA 治疗的重要靶点。
NF-κB 信号通路参与 OA 进展过程中炎症介质的调节。NF-κB 是一种定位于细胞质的转录因子，通过与抑制性蛋白 IκB 的组成型相互作用而失去活性。在存在 IL-1β 的情况下，NF-κB p65 与 IκB 分离并转移到细胞核以调节炎症介质的表达[16]。NF-κB 核易位的小分子抑制剂已显示出对小鼠关节炎的治疗效果[17]。本研究表明，miR-21-5p 的敲低抑制了 IL-1β 刺激的大鼠软骨细胞中 NF-κB p65 的活化和核易位。提示，抑制 NF-κB 的活化可能是 miR-21-5p 敲低抑制软骨细胞中 IL-1β 诱导的炎症反应的基础。TNFAIP3 是一种有效的 NF-κB 信号抑制剂[18]，据报道，沉默 TNFAIP3 可提高 NF-κB 转录活性[19]；
并且 TNFAIP3 可通过抑制 OA 成纤维细胞样滑膜细胞中 NF-κB 信号通路的激活来抑制炎症细胞因子的释放，是治疗 OA 的潜在靶点[20]。本研究通过生物学信息预测发现 TNFAIP3 是 miR-21-5p 的靶蛋白，既往研究也证实 miR-21-5p 可抑制 TNFAIP3 的表达[9-10]。在本研究中，IL-1β 刺激后软骨细胞中 miR-21-5p 的上调，伴随着 TNFAIP3 的降低；
而敲低 miR-21-5p 后，TNFAIP3 表达上调，NF-κB 的活化和核易位减少；
并且沉默 TNFAIP3 可逆转敲低 miR-21-5p 对软骨细胞的影响。提示，miR-21-5p 的高表达可能通过靶向下调 TNFAIP3，诱导软骨细胞损伤。
笔者的体内研究数据进一步支持 miR-21-5p 在 OA 病理生理学中的作用，RT-qPCR、TUNEL 和番红 O/ 固绿染色结果表明，在体内使用 miR-21-5p antagomir 敲低 miR-21-5p 表达可显著上调 OA 大鼠软骨组织中 TNFAIP3 表达，减少软骨细胞凋亡，并抑制由软骨细胞凋亡引起的软骨组织损失。
综上所述，miR-21-5p 水平升高具有关节破坏作用，敲低 miR-21-5p 可通过靶向上调 TNFAIP3，抑制关节软骨细胞的凋亡和手术诱导的 OA 模型大鼠膝关节软骨的丢失，减轻 OA 期间的软骨损伤。本研究结果将对开发新的 OA 治疗方法具有重要意义。但本研究尚存在一些局限性，如 OA 常见于老年患者，来自老年动物的细胞可能更适合体外研究；
此外，由于本研究样本有限，对 miR-21-5p 分子机制的研究还需要进一步证实。
