聚集素对肝脂肪变性细胞的作用及机制

苏 静，胡以平

(海军军医大学细胞生物学教研室，上海 200082)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种代谢相关的慢性肝病[1]，主要包括简单脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌4个阶段[2-3]，被认为是慢性肝病的主要原因。目前，NAFLD的发病机制最被广泛接受的理论是“二次打击”假说[4-5]，第1次“打击”是通过肝细胞中三酰甘油的积累而发生肝脂肪变性，然后在此基础上发生第2次“打击”即氧化应激和脂质过氧化反应，造成肝细胞损伤和炎症反应。第2次“打击”增加了肝细胞对凋亡和坏死的易感性，促进肝纤维化和肝硬化的发生和发展。聚集素(clusterin,CLU)也被称为载脂蛋白J(apolipoprotein J，Apo J)，是一种异二聚体糖蛋白，广泛分布于各种组织和体液中，参与组织重塑、脂质转运、补体抑制和凋亡调节等多种生理过程[6-8]。正常生理条件下，CLU表达水平较低，在病理条件下如氧化应激和炎症时[9-11]其表达上调。有研究表明，CLU与多种代谢性疾病有关[12-13]。Apo J-低密度脂蛋白受体相关蛋白2(low density lipoprotein receptor related protein 2，LRP2)轴是一种新的内分泌通路，对维持正常的葡萄糖稳态和胰岛素敏感性至关重要[14]。同时，ApoJ-LRP2轴也对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗起到保护作用[15]。CLU可以抑制氧化应激诱导的细胞死亡[16]，促进胆固醇从泡沫细胞中流出，并具有抗炎、抗动脉粥样硬化的作用[17-18]。有研究发现，CLU可以抑制西式饮食诱导的肥胖和NAFLD或者作为免疫预处理调节剂影响脂肪性肝炎[19-20]。目前本课题组在开展的关于CLU在小鼠肝纤维化中作用的研究也发现其对肝组织的保护作用(数据还未发表)。但关于CLU在脂代谢中的作用及机制的研究较少。基于此，本研究采用游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)[21]来处理小鼠肝癌细胞系Hep1-6建立体外肝脂肪变性细胞模型。同时建立稳定过表达CLU以及稳定敲减CLU的Hep1-6细胞株,通过检测脂生成和氧化代谢等相关基因的表达差异来研究CLU在肝脂肪变性细胞中的作用，探讨CLU与脂代谢之间的关系，并初步分析其潜在的作用机制。

1.1 细胞、主要试剂与仪器小鼠肝癌细胞系Hep1-6、293T工具细胞、DH5α细胞为本实验室长期保存细胞；
达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modification of Eagle′s medium，DMEM)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、青/链霉素(双抗)购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，油红O、油酸、棕榈酸钠购自美国Sigma公司，放射免疫沉淀法缓冲液(radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)购自上海碧云天生物技术有限公司，重组小鼠CLU蛋白购自美国R&D Systems公司，质粒小抽试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物由上海杰李生物技术有限公司合成，RNA反转录试剂盒和荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，含小鼠CLU基因全长Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRESpuromycin的过表达慢病毒载体质粒以及含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)元件的对照载体质粒均购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，含有CLU短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)干扰小鼠CLU基因的慢病毒载体及对照载体购自赛业(广州)生物科技有限公司，包装慢病毒的2个包装质粒 psPAX2 和 pMD2G 为实验室自有；
低温低速台式离心机购自德国Eppendorf公司，实时荧光定量PCR仪购自美国罗氏公司，Amersham Imager600多功能成像仪购自美国General Electric Company公司,全波长酶标仪购自美国Molecular devices 公司，CO2培养箱购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 Hep1-6和293T细胞培养细胞经37 ℃水浴快速复苏后，低温离心机1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，采用DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1和链霉素1 mg·L-1)于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，更换新培养基。

1.3 稳定过表达CLU和敲减CLU的慢病毒感染细胞株构建质粒扩增：将过表达CLU慢病毒载体质粒、敲减CLU shRNA慢病毒载体质粒、对照质粒采用DH5α感受态细胞进行质粒DNA转化，涂板培养12～16 h后挑取单细胞菌落置于LB培养液中,随后将LB培养瓶置于37 ℃、250 r·min-1的振荡培养箱中过夜培养，使用质粒小抽试剂盒抽取富集得到目的质粒。慢病毒包装:复苏293T工具细胞，接种至10 cm细胞培养皿中进行培养，直至细胞密度达到 70%～80%；
取1 mL DMEM置于1.5 mL无菌离心管Eppendorf(EP)管中，再依次将目的质粒、包装质粒(psPAX2)、外壳质粒(pMD2G)按照 421 的比例加入EP管中，总量14 μg，吹打混匀。再加入42 μg聚乙烯亚胺轻柔混匀，室温静置15 min。将293T细胞换液，加入9 mL DMEM完全培养基后放回培养箱中。稍后将EP管中的混合液逐滴加入293T细胞培养皿中，轻轻混匀，置于细胞培养箱中，8 h后更换新鲜培养液，48 h后收集病毒上清，0.45 μm 滤膜过滤，分装保存。细胞感染：提前复苏肝癌细胞Hep1-6，传代1～2次后待其密度约为40%时，将细胞随机分为对照组、CLU组、Sh组和GFP组。更换新鲜培养液，对照组细胞不给予任何处理，CLU组细胞加入过表达CLU慢病毒上清，Sh组细胞加入敲减CLU慢病毒上清，GFP组细胞加入对照病毒上清，然后各组细胞再分别加入聚凝胺(5 mg·L-1)，轻柔混匀。感染8～12 h后更换新鲜培养液，继续培养 24～48 h后，荧光显微镜下观察CLU组、Sh组和GFP组细胞的感染效率，嘌呤霉素(2～20 mg·L-1)筛选出3组中表达GFP的阳性细胞，并扩大培养用于后续实验。

1.4 蛋白免疫印迹法检测对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞中CLU蛋白的表达将对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞培养皿取出，置于冰上操作，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2遍后加入适量PBS，用细胞刮板刮取细胞，细胞收集后，依据细胞量加入适量RIPA细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，混匀后，冰上裂解20 min，4 ℃、12 900 r·min-1离心5 min，收集上清。取 1 μL 上清液定量蛋白浓度，余下的上清液根据体积加入 5×蛋白上样缓冲液，混匀后沸水煮5 min。制备质量分数10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，依次上样、转膜后，加入稀释度11 000 CLU抗体以及β-肌动蛋白抗体，4 ℃过夜孵育,然后加入稀释的二抗室温孵育1 h,增强化学发光试剂显色，应用Amersham Imager600凝胶成像系统拍照。

1.5 脂肪变性细胞模型的建立将油酸和棕榈酸钠按照21的比例加入含有体积分数1% BSA的DMEM无血清培养基中，得到 1 mmol 的FFA工作液。待对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞培养至密度约80%时，加入提前配置好的FFA工作液1 mmol 诱导24 h，得到脂肪变性细胞模型。细胞模型建好后，Sh组细胞随机分为Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组，Sh-CLU低剂量组每毫升培养基中加入400 ng CLU，Sh-CLU高剂量组每毫升培养基中加入800 ng CLU，继续培养24 h。

1.6 酶标仪检测BSA组、对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞中脂滴沉积量将对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞接种于12孔细胞培养板，每孔4×105个细胞，每组细胞接种2孔，待细胞贴壁后加入FFA诱导24 h;同时设BSA组作为对照，将对照组细胞以每孔4×105个细胞接种于12孔培养板，接种2孔，细胞贴壁后，加入含有体积分数1%BSA的DMEM无血清培养基培养24 h。将5组细胞用PBS冲洗2次后，用4 mg·L-1多聚甲醛溶液室温固定5～10 min,PBS冲洗3次，每次5 min。体积分数60%异丙醇覆盖细胞2～3 min后，弃去异丙醇，加入油红染液室温作用30 min后，弃去油红染液，蒸馏水冲洗2次，苏木精染色2 min，流水轻柔冲洗5 min，取适量双蒸水覆盖细胞，显微镜下观察红色脂质着色情况。参照文献[22]中的方法测细胞中脂滴沉积量。具体方法为：细胞经油红染色后蒸馏水清洗，弃去蒸馏水，残余水分吸干后加入 500 μL 异丙醇反复吹打溶解油红染料，取100 μL溶解油红的异丙醇液体加入96孔板中，设3个复孔，用酶标仪测定各组油红溶解液在540 nm波长处的光密度(optical density，OD)值，OD值越大代表脂滴沉积越多。实验重复3次，取均值。

1.7 实时荧光定量PCR法检测对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞中CLU mRNA相对表达量以及对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂滴形成、脂转运、脂解、氧化应激和糖代谢相关基因mRNA相对表达量采用总核糖核酸抽提试剂(total RNA extraction reagent，TRIzol)法提取细胞RNA，测定RNA浓度进行反转录获取cDNA,反转录条件为42 ℃ 30 min,37 ℃ 1 h。cDNA扩增条件为95 ℃预变性10 min,95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环后，72 ℃延伸5 min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参基因，上游引物序列为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物序列为5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′，产物大小123 bp。CLU上游引物序列为5′-AAGGGGGTGTACTTGAGCAG-3′，下游引物序列为5′-TCCCTTGAGTGGACAGTTCTTG-3′，产物大小60 bp。脂肪酸合成相关基因[23]引物：脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)上游引物序列为5′-TGTGAAGCCGTTGGGAGTGA-3′,下游引物序列为5′-GCAATCTGGATGGCAGTGAGG-3′， 产物大小108 bp；
乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-coenzyme A carboxylase alpha,ACACA)上游引物序列为5′-ATGGGCGGAATGGTCTCTTTC-3′,下游引物序列为5′-TGGGGACCTTGTCTTCATCAT-3′， 产物大小148 bp；
硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)上游引物序列为5′-TTCTTGCGATACACTCTGGTGC-3′,下游引物序列为5′-CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT-3′，产物大小98 bp；
固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein1c,SREBP1C)上游引物序列为5′-GGTCAAAACCAGCCTCCCA-3′,下游引物序列为5′-CAGTCCCCGTCCACAAAGAA-3′，产物大小156 bp；
成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)上游引物序列为5′-CTGCTGGGGGTCTACCAAG-3′,下游引物序列为5′-CTGCGCCTACCACTGTTCC-3′，产物大小154 bp。脂肪酸氧化相关基因[24]引物：肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferases 1,CPT1)上游引物序列为5′-TGTATCGTCGCACGGTAGACC-3′,下游引物序列为5′-CGGGAAGTATTGAAGAGTCGCT-3′，产物大小106 bp；
酰基辅酶A氧化酶1(acyl-coenzyme A oxidase 1,ACOX1)上游引物序列为5′-AGCTGCTCACAGTGACTCGC-3′,下游引物序列为5′-CTTCTTGGCCCACTCAAACA-3′，产物大小134 bp；
过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α(peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator lalpha,PGC1α)上游引物序列为5′-TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT-3′,下游引物序列为5′-CCACTTCAATCCACCCAGAAAG-3′，产物大小134 bp；
过氧化物增殖激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα)上游引物序列为5′-CAAGAAGACCGAGTCCGACG-3′,下游引物序列为5′-CTCCCTGAACAGTGGCAACG-3′，产物大小106 bp。脂滴形成相关基因[25]引物：脂肪诱导蛋白(fat inducing protein,Fitm)1上游引物序列为5′-TAGCCACGGCAACTTCTTCA-3′,下游引物序列为5′-AACACCACCAGCAGCACAAA-3′，产物大小93 bp；
Fitm2上游引物序列为5′-TTACCAACTACCACCTGACGGG-3′,下游引物序列为5′-ACTGCTGCTTGCTGCGATG-3′，产物大小186 bp；
G0/G1期开关基因2 (G0/G1switch gene 2,G0S2)上游引物序列为5′-TGCCACCGAATCCAGAACT-3′,下游引物序列为5′-CTCCTTGATTGCTCGCACA-3′，产物大小113 bp；
脂滴包被蛋白2(perilipin 2，Plin2)上游引物序列为5′-ATACAGTTTTGGGGATGGTGC-3′,下游引物序列为5′-CGTTCATAGTTGCTCGGCTT-3′，产物大小169 bp。脂转运相关基因[25]引物：血小板反应蛋白受体(thrombospondin receptor,CD36)上游引物序列为5′-TACCTGGGAGTTGGCGAGA-3′,下游引物序列为5′-CCGACTGGCATGAGAATGC-3′，产物大小146 bp；
脂肪酸结合蛋白1(fatty acid binding protein 1,Fabp1)上游引物序列为5′-AGCCAGGAGAACTTTGAGCC-3′,下游引物序列为5′-CACTTTGGGTCCATAGGTGATG-3′，产物大小144 bp。脂解相关基因[25]引物：含PATATIN样磷脂酶域蛋白2(PATATIN like phospholipase domain containing protein 2 ，PNPLA2)上游引物序列为 5′-CCATGATGGTGCCCTATACTCT-3′,下游引物序列为5′-GCTACCCGTCTGCTCTTTCAT-3′，产物大小119 bp；
肝脂酶(hepatic lipase，LIPC)上游引物序列为5′-ATGGGAAATCCCCTCCAAATCT-3′,下游引物序列为5′-GTGCTGAGGTCTGAGACGA-3′，产物大小207 bp；
激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，LIPE)上游引物序列为5′-CCAGCCTGAGGGCTTACTG-3′,下游引物序列为5′-CTCCATTGACTGTGACATCTCG-3′，产物大小106 bp。氧化应激相关基因[24]引物：醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)上游引物序列为5′-ATCCTGCGTTTCTGTGGCTT-3′,下游引物序列为5′-GCAAAATAGAGTGGGGTCTCCT-3′，产物大小 146 bp；
谷胱甘肽硫转移酶M1(glutathione S-transferase M1,GSTM1)上游引物序列为5′-GGACTTTCCCAATCTGCCTT-3′,下游引物序列为5′-TCCATCCAGGTGGTGCTTT-3′，产物大小100 bp；
谷胱甘肽S转移酶α2(glutathione S transferase alpha 2,GSTA2)上游引物序列为5′-AGCCCGTGCTTCACTACTTCA-3′,下游引物序列为5′-TCTTCAAACTCCACCCCTGC-3′，产物大小85 bp；
谷胱甘肽S转移酶Α4(glutathione S transferase A4，GSTA4)上游引物序列为5′-TGATTGCCGTGGCTCCATTTA-3′,下游引物序列为5′-CAACGAGAAAAGCCTCTCCGT-3′，产物大小135 bp；
谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate cysteine ligasecatalytic，GCLC)上游引物序列为5′-GGGGTGACGAGGTGGAGTA-3′,下游引物序列为5′-GTTGGGGTTTGTCCTCTCCC-3′，产物大小125 bp。糖代谢相关基因[24]引物：丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(pyruvate dehydrogenase kinase,isozyme 1，PDK1)上游引物序列为5′-GGACTTCGGGTCAGTGAATGC-3′,下游引物序列为5′-TCCTGAGAAGATTGTCGGGGA-3′，产物大小122 bp；
丙酮酸激酶同工酶L/R(pyruvate kinase L/R，PKLR)上游引物序列为5′-CCCTCCCATAGTCCCACATCT-3′,下游引物序列为5′-TGAGCGGATTGAGACAGGGATA-3′，产物大小 129 bp；
Kruppel样因子15(Kruppel like factor 15，KLF15)上游引物序列为5′-TCTCGTCACCGAAATGCTCA-3′,下游引物序列为5′-AACAGAAGGCTTGCGAGTCAG-3′，产物大小150 bp；
葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(glucose-6-phosphatase catalytic，G6PC)上游引物序列为5′-TGTTTGTTGGTGCTTTTGTAGG-3′,下游引物序列为5′-TTTCTGCCCCAGGAATCAA-3′，产物大小123 bp。反应产物经溶解曲线鉴定为单一产物，采用 2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。实验重复3次，取均值。

2.1 稳定过表达和敲减CLU的细胞株构建及验证结果见图1和图2。CLU组细胞中CLU蛋白表达量最多，明显多于对照组和GFP组，Sh组几乎无CLU蛋白表达，GFP组和对照组的CLU蛋白表达量基本一致。对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞中CLU mRNA相对表达量分别为1.03±0.06、3.64±0.12、0.25±0.13、1.08±0.32。CLU组细胞中CLU mRNA相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组细胞中CLU mRNA相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
GFP组与对照组细胞中CLU mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。显微镜白光视野下观察发现，CLU组细胞形态与对照组细胞相似，呈现上皮样，细胞为多边形；
Sh组大部分细胞呈扁平状，细胞变大伸展铺开，细胞边缘呈锯齿状。

1：对照组；
2:CLU组；
3：Sh组；
4：GFP组。

右侧图分别为左侧方块圈起的放大视野。

2.2 对照组、BSA组、CLU组、Sh组和GFP组细胞中脂滴沉积量比较结果见图3和表1。BSA组细胞中无明显的脂滴沉积，对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞中存在大量脂滴沉积。对照组、CLU组、Sh组和GFP组细胞中脂滴沉积量显著高于BSA组，差异有统计学意义(P<0.05)；
CLU组细胞中脂滴沉积量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组细胞中脂滴沉积量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
GFP组与对照组细胞中脂滴沉积量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A：对照组；
B:BSA组；
C：CLU组;D:Sh组;E:GFP组。

表1 对照组、BSA组、CLU组、Sh组和GFP组细胞中脂滴沉积量比较

2.3 对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中脂肪酸合成和脂肪酸氧化相关基因mRNA相对表达量比较结果见表2和表3。CLU组细胞中FASN、ACACA、SCD1 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
CLU组与对照组细胞中SREBP1C、FGF21 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh组细胞中FASN、ACACA、SCD1、SREBP1C mRNA的相对表达量显著高于对照组和CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组细胞中FGF21 mRNA的相对表达量与对照组、CLU组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU低剂量组与对照组细胞中FASN、ACACA mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；
Sh-CLU低剂量组细胞中SCD1、SREBP1C、FGF21 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh-CLU低剂量组细胞中FASN、ACACA mRNA的相对表达量显著低于CLU组，FGF21 mRNA 的相对表达量显著高于CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU低剂量组与CLU组细胞中SCD1、SREBP1C mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU低剂量组细胞中ACACA、SCD1 mRNA的相对表达量显著低于Sh组，FGF21 mRNA的相对表达量显著高于Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU低剂量组与Sh组细胞中FASN、SREBP1C mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU高剂量组细胞中FASN、ACACA、SCD1、SREBP1C、FGF21 mRNA的相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh-CLU高剂量组细胞中FASN、ACACA、SCD1、FGF21 mRNA的相对表达量均显著高于CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU高剂量组与CLU组细胞中SREBP1C mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

CLU组细胞中CPT1、ACOX1、PGC1α mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
CLU组与对照组细胞中PPARα mRNA 的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh组细胞中CPT1、ACOX1 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与对照组细胞中PGC1α、PPARα mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh组细胞中CPT1、PGC1α、PPARα mRNA的相对表达量显著低于CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与CLU组细胞中ACOX1 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中CPT1、ACOX1、PPARα mRNA的相对表达量均显著高于对照组、CLU组和Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh-CLU低剂量组细胞中PGC1α mRNA相对表达量显著高于对照组和Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU低剂量组与CLU组细胞中PGC1α mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU高剂量组细胞中PGC1α mRNA相对表达量显著高于对照组、Sh组和CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组、Sh-CLU高剂量组细胞中脂肪酸合成相关基因mRNA相对表达量比较

表3 对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组、Sh-CLU高剂量组细胞中脂肪酸氧化相关基因mRNA相对表达量比较

2.4 对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中脂滴形成、脂转运及脂解相关基因mRNA相对表达量比较结果见表4和表5。CLU组细胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的相对表达量显著低于对照组，Plin2 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh组细胞中Fitm1、Fitm2、Plin2 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组细胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的相对表达量显著高于CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与CLU组细胞中Plin2 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU低剂量组细胞中Fitm1 mRNA的相对表达量显著低于对照组，Plin2 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU低剂量组与对照组细胞中Fitm2 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU低剂量组细胞中Plin2 mRNA的相对表达量显著高于CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU低剂量组与CLU组细胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU 低剂量组细胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的相对表达量显著低于Sh组，Plin2 mRNA的相对表达量显著高于Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh-CLU高剂量组细胞中Fitm1 mRNA的相对表达量显著低于对照组、CLU组和Sh组，Plin2 mRNA的相对表达量显著高于对照组、CLU组和Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU高剂量组与对照组、CLU组细胞中Fitm2 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；
Sh-CLU高剂量组细胞中Fitm2 mRNA的相对表达量显著低于Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组细胞中G0S2mRNA的相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

CLU组细胞中CD36、Fabp1、PNPLA2、LIPC、LIPE mRNA的相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh组细胞中CD36、Fabp1、NPLA2、LIPC mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与对照组细胞中LIPE mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh组细胞中CD36、LIPE mRNA的相对表达量显著低于CLU组，PNPLA2 mRNA的相对表达量显著高于CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与CLU组细胞中Fabp1、LIPC mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中CD36、Fabp1、PNPLA2、LIPC、LIPE mRNA的相对表达量均显著高于对照组、CLU组和Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中脂滴形成相关基因mRNA相对表达量比较

表5 对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中脂转运和脂解相关基因mRNA相对表达量比较

2.5 对照组、CLU组、Sh-CLU组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中氧化应激及糖代谢相关基因mRNA相对表达量比较结果见表6和表7。CLU组细胞中NQO1、GSTA2、GCLC mRNA的相对表达量显著高于对照组，GSTM1 mRNA的相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
CLU组与对照组细胞中GSTA4 mRNA 相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh组NQO1、GSTM1、GCLC mRNA的相对表达量显著高于对照组，GSTA4 mRNA的相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与对照组细胞中GSTA2 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh组细胞中GSTM1 mRNA的相对表达量显著高于CLU组，GSTA2、GSTA4、GCLC mRNA相对表达量显著低于CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与CLU组细胞中NQO1 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中NQO1、GSTM1、GSTA2、GCLC mRNA 的相对表达量显著高于对照组、CLU组和Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh-CLU低剂量组细胞中GSTA4 mRNA的相对表达量与对照组、CLU组比较差异无统计学意义(P>0.05)；
Sh-CLU 低剂量组细胞中GSTA4 mRNA相对表达量显著高于Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh-CLU 高剂量组细胞中GSTA4 mRNA的相对表达量显著高于对照组、CLU组和Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。

CLU组细胞中PDK1、PKLR、KLF15、G6PC mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh组细胞中KLF15、G6PC mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与对照组细胞中PDK1、PKLR mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh组细胞中PDK1、G6PC mRNA相对表达量显著低于CLU组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh组与CLU组细胞中PKLR、KLF15 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU 低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中PDK1、G6PC mRNA相对表达量显著高于对照组、CLU组和Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh-CLU高剂量组细胞中PKLR mRNA的相对表达量显著低于对照组、CLU组和Sh组，差异有统计学意义(P<0.05)。Sh-CLU低剂量组细胞中PKLR、KLF15 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU低剂量组细胞中PKLR、KLF15 mRNA的相对表达量与CLU组、Sh组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Sh-CLU高剂量组细胞中KLF15 mRNA的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Sh-CLU高剂量组与CLU组、Sh组细胞中KLF15 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表6 对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中氧化应激相关基因mRNA相对表达量比较

表7 对照组、CLU组、Sh组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中糖代谢相关基因mRNA相对表达量比较

肝脏是脂质代谢和葡萄糖代谢的中心器官，关于NAFLD的大量研究强调了病变肝脏内代谢功能改变的重要性。肥胖和代谢综合征可导致NAFLD的发生以及机体一系列病理生理变化，如增加了肝脏对急性肝损伤的易感性，这可能逐步导致肝硬化和肝细胞癌的发生。在NAFLD进展过程中，肝细胞脂肪变性是第1个发展阶段。CLU一直被认为与脂转运和氧化应激相关，且有研究显示，CLU过表达可以改善肥胖症或NAFLD[19]。本研究采用过量FFA诱导CLU过表达和敲减的Hep1-6细胞株，并建立脂肪变性细胞模型，观察并检测肝细胞脂质沉积量，脂肪酸合成与氧化、脂解、葡萄糖代谢和氧化应激相关基因mRNA表达水平的变化。本研究发现，Sh组细胞株的形态较对照组细胞更为扁平，细胞形态更差，说明CLU可能对维持细胞正常形态有一定作用。通过FFA诱导脂肪变性细胞模型发现，Sh组细胞中脂滴沉积量显著高于对照组，CLU组细胞中脂滴沉积量显著少于对照组，说明CLU过表达可促进脂滴的沉积，而沉默CLU表达则可在一定程度上减少脂滴沉积。正常的肝脏脂质代谢平衡离不开脂肪酸的合成和氧化作用，本研究通过检测细胞中脂生成相关基因FASN、ACACA、SCD1和SREBP1C的mRNA表达发现，与CLU组相比，Sh组细胞中ACACA、SCD1和SREBP1C mRNA表达水平显著增加；
与对照组相比，CLU组细胞中FASN、ACACA和SCD1 mRNA的表达也在一定程度上增加。与Sh组相比，Sh-CLU低剂量组细胞中脂肪酸合成相关基因mRNA表达水平显著减少，而Sh-CLU高剂量组细胞中表达水平显著升高。说明CLU可能起到平衡脂肪酸合成的作用。FGF21可提高胰岛素的敏感性，从而降低三酰甘油的表达[26]。本研究结果显示，与CLU组相比，Sh组细胞中FGF21 mRNA 的表达水平显著降低；
与对照组相比，CLU组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中FGF21 mRNA的表达水平显著升高。该结果说明，CLU过表达会显著增加脂肪酸的氧化。与CLU组相比，Sh组细胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的表达水平显著升高；
与Sh组相比，Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中Fitm mRNA表达水平显著降低；
说明过表达CLU会降低脂滴储存的稳定性。与对照组和Sh组相比，CLU组、Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中脂转运和脂解相关基因mRNA表达水平均显著升高，说明CLU可能是通过抑制脂滴储存的稳定性和增加脂解来维持脂质平衡的。与CLU组相比，Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中脂解相关基因mRNA表达水平显著升高，提示脂解程度的高低可能与CLU水平密切相关。NAFLD的一个重要特征是氧化应激的变化[27]，CLU是一种敏感的氧化损伤生物传感器，即使是细胞氧化负荷的微小变化[28-29]，CLU也能感应到并作出反应。本研究结果发现，与Sh组相比,CLU组细胞中氧化应激相关基因mRNA表达水平显著升高，表明CLU过表达可以有效提高抗氧化因子表达。与CLU组相比，Sh-CLU低剂量组和Sh-CLU高剂量组氧化应激相关基因mRNA表达水平显著升高，再次证实了CLU在脂代谢中可能作为抗氧化应激的保护性生物效应器起作用，这一作用可能在外源CLU的加入下增强。葡萄糖代谢可提供合成三酰甘油所需的甘油及脂肪酸,其中甘油由糖酵解生成的磷酸二羟丙酮转化而成,脂肪酸由糖氧化分解生成的乙酰辅酶A合成，PDK1能磷酸化丙酮酸脱氢酶使其失去活性,抑制丙酮酸转化成乙酰辅酶A[30],并且有研究表明，脂解速度决定了糖异生速度[31-32]。本研究还发现，与对照组和Sh组相比，CLU组、Sh-CLU 低剂量组和Sh-CLU高剂量组细胞中PDK1和G6PC mRNA表达水平显著升高,表明CLU可能会抑制糖酵解中乙酰辅酶A产生，并可促进糖异生。

综上所述，CLU在脂代谢的调控中可能主要通过脂肪酸氧化和脂解发挥作用，同时通过提高胰岛素的敏感性和促进糖异生等辅助调节脂质平衡。除此之外，CLU还可能通过减少氧化损伤对细胞的刺激，从而对细胞起保护作用，这或许对整体细胞功能来说具有重要意义。因为本次只在细胞层面进行研究，未涉及到太多机制，所以这一结果应结合体内研究综合分析，扩大当前研究的意义，从而进一步阐明CLU在NAFLD发展中的作用，及其在糖代谢、血脂代谢和氧化应激中的具体作用机制。

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