复方丹参双相胶囊体内外评价研究

夏明艳，吴秋焱，王灿坚，阳 涛，李东勲，魏鑫华，王堂勋，张观生，张文锍*，张国松*

·药剂与工艺·

复方丹参双相胶囊体内外评价研究

夏明艳1, 2，吴秋焱1, 3#，王灿坚1, 2，阳 涛1，李东勲1, 2，魏鑫华1, 2，王堂勋1, 2，张观生1, 2，张文锍1, 2*，张国松1, 2*

1. 江西中医药大学，江西 南昌 330006 2. 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006 3. 康龙化成（北京）新药技术股份有限公司，北京 101100

对比研究复方丹参双相胶囊（Fufang Danshen Biphasic Capsules，FDBC）与复方丹参胶囊（Fufang Danshen Capsules，FDC），证实复方丹参双相胶囊可降低冰片挥发损失且不会影响其他有效成分的体内外释药行为。采用GC法测定FDBC与FDC处于高温、高湿、光照及加速实验条件后冰片的含量；
以pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和纯水为溶出介质，采用小杯法测定FDBC和FDC中丹参酮IIA、丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在不同时间点的累积溶出率，绘制溶出曲线；
采用盐酸异丙肾上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）制备大鼠急性心肌缺血模型，预防给药7 d后监测大鼠心电图ST段变化，HE染色观察心肌组织病理损伤，并利用试剂盒测定大鼠血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、心肌肌钙蛋白-T（cardiac troponin-T，cTn-T）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平。FDBC在高温、高湿、光照条件下及加速实验条件下冰片含量均保持在94.61%以上，而FDC中冰片含量显著降低；
FDBC与FDC的体外溶出曲线相似；
FDBC可以改善ISO致心肌缺血大鼠心电图ST段改变，减少血清中心肌酶的含量，保持心肌细胞结构完整，具有明显的抗心肌缺血作用，与FDC具有相同的抗心肌缺血作用。与FDC相比，FDBC可以显著减少冰片挥发损失，且不会影响其他成分的体外释放和药理作用，显示出FDBC的优越性。

复方丹参双相胶囊；
复方丹参胶囊；
稳定性；
体外溶出；
冰片；
丹参酮IIA；
丹酚酸B；
三七皂苷R1；
人参皂苷Rg1；
人参皂苷Rb1；
心肌缺血；
心肌酶

复方丹参制剂是临床常用的治疗冠心病心绞痛的经典中药复方制剂，临床常用剂型有片剂、滴丸和颗粒等，由丹参、三七、冰片3味中药组成，具有活血化瘀、理气止痛的功效[1]。其中，冰片可“引药入心经”，对心脑血管疾病具有重要的药效作用[2]。现代研究表明，冰片可以显著增加心血管制剂中有效成分的血药浓度并提高生物利用度[3-8]、舒张血管[9]、提高血脑屏障通透性[10]。冰片主要成分龙脑是一种双环单萜类化合物，此外，冰片中还含有多种倍半萜及三萜类化合物[11]，具有挥发性，对热、空气和光照敏感，常规处理工艺难以解决其稳定性问题[12-13]，影响制剂的质量与药理作用[14-15]。因此，合理有效解决冰片的稳定性问题，是保证含冰片制剂质量和药效的关键所在。

针对上述问题，课题组设计构建一种“液相”与“固相”并存的新型释药系统——复方丹参双相胶囊（Fufang Danshen Biphasic Capsules，FDBC），即将冰片与适量溶剂制成“液相”封装于微型软胶囊中，丹参、三七提取物制成颗粒/微丸/小片，与软胶囊装填于同一硬胶囊中，通过处方筛选与优化，确定了丹参水溶性颗粒、丹参脂溶性固体分散体、三七总皂苷提取物颗粒和冰片软胶囊的制备工艺，评价了软胶囊壳的性能，结果表明其具有优良的溶解、隔水和机械性能，并以纯水为溶出介质，对FDBC进行了体外释药初步评价，各成分均可快速溶出[16]。本课题在前期研究的基础上，拟对FDBC中冰片的稳定性进行考察，通过对比FDBC与复方丹参胶囊（Fufang Danshen Capsules，FDC）的体外溶出行为和大鼠体内药效学差异，为阐释FDBC的优越性提供实验依据。

1.1 仪器

6890N气相色谱仪，美国Agilent公司；
MS 105DU型分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；
安捷伦7890 B-7000 D气质联用仪，美国Agilent公司；
101-3-BS-II电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；
LS-3000UV低温光照仪，北京天星科仪科技有限公司；
TEMI800恒温恒湿试验箱，北京中科环试仪器有限公司；
LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；
ZRS-8G溶出试验仪，天津市天大天发科技有限公司；
FE28 pH计，瑞士Mettler Toledo公司；
HC-3016R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；
Genius 3型涡旋混合器，德国IKA集团；
YB-6LF生物组织石蜡包埋机，湖北亚光医用电子技术有限公司；
RM2235石蜡切片机、DM2500光学显微镜，徕卡公司；
PT-3502C光栅型全波长酶标仪，江西华科精密仪器有限公司；
PowerLad生理记录仪，AD Instrument公司。

1.2 材料与药品

萘标准品，质量分数99.9%，批号C10636105，北京盛世康普化工技术研究院；
龙脑对照品，质量分数≥98.0%，批号DST210312-194，成都乐美天医药科技有限公司；
FDC，批号202101001，葵花药业集团（佳木斯）有限公司；
对照品丹酚酸B（质量分数96.6%，批号111562-201917）、丹参酮IIA（质量分数98.9%，批号110760-202022）、三七皂苷R1（R1，质量分数93.1%，批号110745-201820）、人参皂苷Rg1（Rg1，质量分数91.7%，批号110703- 201530）、人参皂苷Rb1（Rb1，质量分数93.1%，批号110704-201424）均购自中国食品药品检定研究院；
丹参水溶性提取物（批号MZ180420）、冰片（批号TB20180801），均购自西安明泽生物科技有限公司；
丹参脂溶性提取物，批号20180820，四川宏益生物工程有限公司；
三七总皂苷提取物，批号TB20180801，西安天宝生物科技有限公司；
糊精，批号2016081101，广饶丽枫生物科技有限公司；
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），批号20170306，湖南尔康制药有限公司；
泊洛沙姆188，批号WPAK524B，上海昌为医药辅料有限公司；
聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，批号57184468EO，德国巴斯夫公司；
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）400，批号160524，西陇科学股份有限公司；
明胶，批号20170328，广东罗塞洛明胶股份有限公司；
甘油，批号20170624，南昌白云药业有限公司；
山梨醇，批号F010G423165004H，广西南宁化学制剂有限公司；
0号胶囊，苏州胶囊有限公司；
聚山梨酯80（Tween 80，T80），批号170402，四川金山制造有限公司；
盐酸（批号180108）、氯化钠（批号120108）、醋酸（批号200914）、氢氧化钠（批号190218）、磷酸二氢钠（批号100107），均购自西陇科学股份有限公司；
无水乙酸钠，批号20130117，广东光华科技股份有限公司；
盐酸异丙肾上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO），美国Sigma公司；
羧甲基纤维素钠，批号170308，安徽山河药用辅料股份有限公司；
乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒（批号20211229）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒（批号20211229）、心肌肌钙蛋白-T（cardiac troponin-T，cTn-T）试剂盒（批号20220105）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒（批号20211229）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号20211229）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（批号20220105）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）试剂盒（批号20220105）均购自南京建成生物工程研究所；
三氯乙醛水合物，麦克林公司；
4%多聚甲醛，阿达玛斯公司；
苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色液，福州飞净生物科技有限公司；
正己烷、甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；
水为超纯水；
其他为分析纯试剂。

1.3 动物

SD大鼠48只，雄性，SPF级，体质量180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）2019-0004。本研究动物实验方案已获得江西中医药大学动物伦理委员会的批准（JZLLSC20210021）。

2.1 样品的制备

2.1.1 FDBC的制备及老化 按照课题组前期优化的处方工艺[16]，称取处方量丹参水溶性提取物、糊精，混合均匀，制粒，得颗粒①，备用；
称取处方量丹参脂溶性提取物、SDS、泊洛沙姆188，采用熔融法制备固体分散体，制粒，得颗粒②，备用；
称取处方量三七总皂苷提取物、糊精，制粒，得颗粒③，备用；
称取适量冰片细粉于研钵中，加入聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40、PEG400，研磨混合，得冰片内容物，备用；
再以明胶、甘油、山梨醇、PEG 400为胶皮配方，采用滴制法制备冰片微型软胶囊④，备用；
将处方量的颗粒①②③混合均匀，与④装入同一0号胶囊中，即得FDBC。将FDBC置于（40±2）℃，相对湿度（75±5）%的条件下加速1个月，即得老化的FDBC。

2.1.2 FDC的制备及老化 按“2.1.1”项下方法制备颗粒①②③，将处方量冰片细粉与颗粒①②③混合均匀，装入0号胶囊中，即得FDC。将FDC置于（40±2）℃，相对湿度（75±5）%的条件下加速1个月，即得老化的FDC。

2.2 FDBC中冰片稳定性考察

2.2.1 色谱条件 色谱柱为DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）柱；
进样口温度180 ℃；
检测器温度220 ℃；
柱温120 ℃；
载气为N2；
体积流量1 mL/min；
进样量1 μL；
分流比10∶1。

2.2.2 溶液的配制

（1）对照品溶液的配制：精密称取一定量龙脑对照品于棕色量瓶中，醋酸乙酯溶解并定容，得质量浓度为1.41 mg/mL的龙脑对照品溶液。

（2）内标溶液的配制：精密称取一定量萘标准品于棕色量瓶中，醋酸乙酯溶解并定容，得质量浓度为1.38 mg/mL萘内标溶液。

（3）供试品溶液的配制：取FDBC内容物约0.5 g，精密称定，剪破微型软胶囊后置量瓶中，精密加入0.8 mL内标溶液，加醋酸乙酯超声10 min（250 W、40 kHz），放冷，醋酸乙酯定容，过0.45 µm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

（4）阴性对照溶液的配制：取不含冰片的FDBC内容物约0.5 g，精密称定，剪破微型软胶囊后置量瓶中，精密加入0.8 mL内标溶液，加醋酸乙酯超声10 min（250 W、40 kHz），放冷，醋酸乙酯定容，过0.45 µm滤膜，取续滤液作为阴性对照溶液。

2.2.3 方法学考察

（1）系统适用性试验：在样品气相色谱图中，龙脑的理论塔板数为6110，分离度为2.47，拖尾因子为0.81，系统适用性良好。

（2）专属性考察：将对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液依法测定，结果表明该方法专属性良好。

（3）线性关系考察：以龙脑质量浓度为横坐标（），龙脑与内标峰面积之比为纵坐标（）进行线性回归，得回归方程＝7.424 5＋0.013 8，2＝0.999 6，结果表明龙脑在0.028～1.125 mg/mL线性关系良好。

（4）精密度考察：取同一龙脑对照品溶液重复进样6次，得龙脑与内标峰面积比值的RSD为0.63%，结果表明仪器精密度良好。

（5）稳定性试验：取FDBC供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、10、12 h进样分析，得龙脑与内标峰面积比值的RSD为0.53%，供试品溶液在12 h内稳定。

（6）重复性试验：平行制备6份FDBC供试品溶液，进样分析，得龙脑与内标峰面积比值的RSD为1.63%，结果表明该方法重复性良好。

（7）加样回收试验：取已测定龙脑含量的FDBC内容物，精密加入定量龙脑对照品溶液，平行制备6份供试品溶液，分别进样分析，计算得龙脑的平均加样回收率为96.29%，RSD为1.72%。

2.2.4 影响因素考察 取FDBC、自制FDC与市售FDC，置于蒸发皿中，于高温（40±2）℃、高湿（25 ℃，相对湿度92.5%）、光照（4500±500）lx条件下分别放置15 d，分别于0、3、5、7、10、15 d取样，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算冰片相对含量（相对于冰片初始值的含量，以龙脑含量计），结果如表1所示。FDBC于高温（40±2）℃、高湿（25 ℃，相对湿度92.5%）、光照（4500±500）lx条件下放置15 d，冰片含量相对稳定，自制和市售FDC于3种条件下放置，随着时间延长，冰片含量逐渐下降，结果表明在高温、高湿和光照条件下FDBC中冰片稳定存在，而自制和市售FDC中冰片不稳定。

2.2.5 加速实验 取FDBC、自制FDC、市售FDC，置于（30±2）℃、相对湿度（65±5）%的恒温恒湿试验箱中，分别于1、2、3、6个月末取样，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算冰片相对含量（以龙脑含量计），结果如表2所示。加速实验6个月后，FDBC中冰片稍有下降，但仍大于90%；
自制和市售FDC加速实验2个月后，冰片含量已不足50%，加速实验6个月后，冰片质量分数分别下降至33.46%和42.86%。表明在加速实验条件下，FDBC中冰片相对稳定，自制和市售FDC中冰片不稳定。

表1 高温、高湿、光照对冰片稳定性的影响(, n = 3)

表2 加速实验结果

2.3 FDBC体外溶出评价

2.3.1 溶液的制备

（1）对照品溶液的制备：①丹参混合对照品溶液：精密称取一定量丹酚酸B、丹参酮IIA对照品置量瓶中，甲醇溶解并定容，得丹参混合对照品溶液（丹酚酸B与丹参酮IIA的质量浓度分别为114.43、40.12 µg/mL）。②三七混合对照品溶液：精密称取一定量R1、Rg1、Rb1对照品置量瓶中，甲醇溶解并定容，得三七混合对照品溶液（质量浓度分别为R1140.5 µg/mL、Rg1282.4 µg/mL、Rb1293.9 µg/mL）。

（2）供试品溶液的制备：取FDBC内容物约0.5 g，精密称定，剪破微型软胶囊后置量瓶中，加70%甲醇超声30 min（250 W、40 kHz），放冷，70%甲醇定容，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

（3）阴性对照溶液的制备：取不含丹参水溶性、脂溶性提取物和三七总皂苷提取物的FDBC内容物约0.5 g，精密称定，剪破微型软胶囊后置量瓶中，加70%甲醇超声30 min（250 W、40 kHz），放冷，70%甲醇定容，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液作为阴性对照溶液。

（4）龙脑对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液的制备：同“2.2.2”项。

2.3.2 丹参和三七成分色谱条件

（1）丹参成分色谱条件：色谱柱为Diamonisl C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；
流动相为乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～12 min，30%乙腈；
12～20 min，30%～80%乙腈；
20～30 min，80%乙腈；
30～35 min，80%～30%乙腈；
35～40 min，30%乙腈；
柱温30 ℃；
体积流量1 mL/min；
进样量20 µL；
检测波长286、270 nm。

（2）三七成分色谱条件：色谱柱为Diamonisl C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；
流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～12 min，19%乙腈；
12～35 min，19%～38%乙腈；
35～45 min，38%乙腈；
45～50 min，38%～19%乙腈；
50～55 min，19%乙腈；
柱温30℃；
体积流量1 mL/min；
进样量20 µL；
检测波长203 nm。

（3）专属性考察：在上述色谱条件下分别进样测定对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，各成分的分离度、理论塔板数、拖尾因子与信噪比结果见表3，均符合要求，专属性良好。

表3 各成分系统适用性结果

2.3.3 龙脑检测条件

（1）色谱条件：色谱柱为VF-WAXms毛细管柱（30 m×250 µm，0.25 µm）；
柱温145 ℃；
进样口温度250 ℃；
载气He；
体积流量1 mL/min；
分流比20∶1；
进样量1 µL。

（2）质谱条件：传输线温度250 ℃；
EI源能量70 eV；
离子源温度230 ℃；
溶剂延迟4 min；
SIM扫描（龙脑95，萘128）。

（3）专属性考察：在上述检测条件下分别进样测定龙脑对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，结果表明该方法专属性良好。

2.3.4 方法学考察

（1）线性关系考察：以质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（）进行线性回归，得丹酚酸B、丹参酮IIA、R1、Rg1、Rg1的回归方程分别为＝ 21 123－72 007（2＝0.999 8）、＝32 760－ 5 709.9（2＝1.000 0）、＝4 532.7＋9 797.1（2＝0.999 5）、＝8 716.3＋14 709（2＝0.999 9）、＝4 324.9＋3 682.2（2＝0.999 8），线性范围分别为4.005～114.427、1.404～40.118、2.195～140.500、2.206～282.400、2.296～293.900 μg/mL，结果表明各成分线性关系良好。

以龙脑质量浓度为横坐标（），龙脑与内标峰面积之比为纵坐标（），进行线性回归，得线性回归方程＝0.357 5＋0.030 6，2＝0.999 7，结果表明龙脑在0.793～317.200 μg/mL线性关系良好。

（2）精密度考察：分别取丹参混合对照品溶液、三七混合对照品溶液，重复进样6次，得丹酚酸B、丹参酮IIA、R1、Rg1和Rb1的RSD分别为1.34%、1.10%、1.95%、1.59%、1.59%，结果表明仪器精密度良好。

（3）稳定性考察：取FDBC供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、10、12、24、36、48、60、72 h进样分析，得丹酚酸B、丹参酮IIA、R1、Rg1和Rb1的RSD分别为1.82%、1.86%、1.00%、2.06%、1.59%，结果表明供试品溶液在72 h内稳定。

（4）重复性考察：平行制备6份FDBC供试品溶液进样分析，得丹酚酸B、丹参酮IIA、R1、Rg1和Rb1的RSD分别为1.85%、1.54%、1.65%、1.57%、1.45%，结果表明该方法重复性良好。

（5）加样回收率考察：取已测定各成分含量的FDBC，精密加入定量丹参混合对照品溶液和三七混合对照品溶液，平行制备6份供试品溶液进样分析，得丹酚酸B、丹参酮IIA、R1、Rg1和Rb1的平均加样回收率分别为92.36%、91.05%、101.87%、102.01%、96.53%，RSD分别为1.44%、2.19%、1.95%、1.25%、1.99%。

2.3.5 体外溶出试验

（1）溶出介质：本实验选择pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸缓冲液、含0.5% SDS的pH 6.8磷酸盐缓冲液和纯水4种溶出介质进行溶出度试验。

（2）介质体积的选择：分别以上述4种介质进行测试，介质体积500 mL，转速100 r/min，取FDBC，按《中国药典》2020年版四部通则溶出度测定方法第二法[17]操作，在60 min时取样，进样分析，结果只有丹参酮IIA的信噪比＞10，可以定量，其他4种成分的信噪比＜10，无法定量，故考虑采用小杯法，介质体积250 mL。

（3）溶出转速的选择：取FDBC，以pH 6.8磷酸盐缓冲液作为溶出介质，体积为250 mL，转速分别为50、75、100 r/min，按《中国药典》2020年版四部通则溶出度测定方法第三法操作，在5、10、15、30、45、60 min取样5 mL，过0.45 µm滤膜，取续滤液适量，分别按“2.3.2”项下丹参和三七色谱条件进样分析。另取剩余续滤液1 mL，加入0.8 mL萘内标溶液，振摇1 min后，以3500 r/min（离心半径16 cm）离心5 min，取上层液，按“2.3.2”项下龙脑检测条件进样。各成分累积溶出率测定结果见图1。由结果可知，转速为75、100 r/min时，各成分的累积溶出率均优于50 r/min；
其中，Rg1在75 r/min时的累积溶出率明显高于100 r/min时的累积溶出率，而其他成分在75、100 r/min时累积溶出率差异不明显。故综合来看，转速选择75 r/min。由于在3种转速下，丹参酮IIA的累积溶出率均极小，故考虑在溶出介质中添加表面活性剂来增加其溶出度。

图1 各成分在不同转速下的溶出曲线

（4）表面活性剂种类及用量的选择：取FDBC，分别以pH 6.8磷酸盐缓冲液，含0.01%、0.1%、0.5% T80及SDS的pH 6.8磷酸盐缓冲液作为溶出介质，体积为250 mL，转速为75 r/min，按《中国药典》2020年版四部通则溶出度测定方法第三法操作，分别在5、10、15、30、45、60 min取样，按“2.3.2”项下丹参色谱条件检测丹参酮IIA，计算累积溶出率，结果见图2。由结果可知，添加0.1% SDS、0.5% T80和0.5% SDS后可显著提高丹参酮IIA在pH 6.8磷酸盐缓冲液中的累积溶出率，且丹参酮IIA在含0.5% SDS的pH 6.8磷酸盐缓冲液中累积溶出率最大，故表面活性剂选择SDS，用量为0.5%。

图2 添加不同表面活性剂后丹参酮IIA的溶出曲线

（5）溶出曲线的测定：按照《中国药典》2020年版四部通则溶出度测定方法第三法，取脱气后的溶出介质250 mL，温度（37.0±0.5）℃，转速75 r/min，取FDBC 6粒，分别投入溶出杯中，分别于5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300 min取样5 mL，同时补充等温等体积溶出介质，过0.45 µm滤膜，取续滤液适量按“2.3.2”项下丹参和三七色谱条件进样测定各成分的含量。

另取剩余续滤液1 mL加入0.8 mL萘内标溶液，振摇1 min后，以3500 r/min（离心半径16 cm）离心5 min，吸取上层液，按“2.3.2”项下龙脑检测条件进样测定龙脑的含量。

依次更换溶出介质，分别按照上述方法进行溶出测定。FDC及老化后的FDBC、FDC的溶出度测定与上述方法相同。结果见图3～6。

由图3可知，在pH 1.2盐酸溶液中，前45 min各胶囊中龙脑的累积溶出率差异不大，45～60 min老化的FDC中龙脑的累积溶出率明显低于其他3种胶囊。在pH 1.2盐酸溶液中，300 min内4种胶囊中除龙脑外其他有效成分的累积溶出率均不足10%，可能是在酸性条件下，大部分丹酚酸B、R1、Rg1及Rb1发生了降解反应[18-19]，导致检测到的浓度减少，计算所得累积溶出率相应减少。

由图4～6可知，①在pH 4.5醋酸缓冲液、含0.5% SDS的pH 6.8磷酸盐缓冲液和纯水3种溶出介质中，与FDC相比，FDBC和老化的FDBC中各成分的溶出曲线均相似，表明FDBC将冰片制备成微型软胶囊不会对各有效成分的体外释药行为产生影响；
②老化的FDC在3种溶出介质中各有效成分的溶出曲线均与FDC有明显差异，表明FDC老化后会影响有效成分的体外释药行为；
③FDBC与老化的FDBC相比，各有效成分的溶出曲线无明显差异，表明老化处理对FDBC中各有效成分的体外释药行为无明显影响，冰片微型软胶囊没有导致释药迟缓。

2.4 FDBC对急性心肌缺血大鼠的保护作用

2.4.1 动物分组与给药 SD大鼠，雄性，48只，适应性饲养7 d，随机分为6组：对照组、模型组（ISO，5 mg/kg）、FDBC组（SX-Z，400 mg/kg）、FDBC老化组（SX-L，400 mg/kg）、FDC组（PT-Z，400 mg/kg）和FDC老化组（PT-L，400 mg/kg）。FDC和FDBC中的固体颗粒用0.5%羧甲基纤维素钠按所需剂量配制成混悬液，ig给药，给药体积为10 mL/kg，FDBC中的冰片软胶囊用胶囊投灌胃药器给予，每天1次，对照组和模型组ig相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，连续给药7 d。

图4 pH 4.5醋酸缓冲液中各有效成分溶出曲线

Fig 4 Dissolution curve of each active component in pH 4.5 acetate buffer

图5 含0.5% SDS的pH 6.8磷酸盐缓冲液中各有效成分溶出曲线

2.4.2 异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血模型的制备 给药第5～7天，除对照组外，所有各组给药30 min后，背部多点sc ISO（5 mg/kg），每天1次，连续3 d制作急性心肌缺血模型，时间间隔24 h，对照组注射等体积生理盐水[20]，实验期间动物自由饮食和饮水。

图6 含0.5% SDS的纯水中各有效成分溶出曲线

2.4.3 心电图的测量 末次sc ISO前，以10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，仰卧固定，连接生理记录仪，记录肢体II导联体表心电图，分析ST段的变化，结果见表1。由结果可知，ISO诱导前，各组大鼠心电图ST段无明显差异；
ISO诱导后，与对照组比较，模型组大鼠ST段值升高近0.2 mV，差异显著（＜0.01）；
与模型组比较，各给药组大鼠ST段值均降低，其中SX-Z组、SX-L组与PT-Z组降低显著，有统计学差异（＜0.05），PT-L组无统计学差异。

表1 各组心电图ST段变化(, n = 8)

与对照组比较：##＜0.01；
与模型组比较：*＜0.05，表2同

##< 0.01control group;*< 0.05model group, same as table 2

2.4.4 心脏指数的测定 实验完毕处死大鼠，迅速开胸取心脏，生理盐水冲洗余血，至心脏基本不出血为止，滤纸吸干多余水分后称定质量，计算心脏指数（心脏指数＝心脏质量/大鼠体质量），结果见表2。与对照组相比，模型组大鼠心脏指数显著升高（＜0.01）；
与模型组相比，SX-Z组、SX-L组、PT-Z组和PT-L组心脏指数明显降低（＜0.05）。

表2 各组心脏指数测定结果(, n = 8)

2.4.5 心肌病理学检查 心脏称定质量后，取心尖组织，4%多聚甲醛固定24～72 h，固定好的组织经系列乙醇、二甲苯脱水处理后，石蜡包埋，切片，脱蜡，苏木素染色，1%盐酸乙醇溶液分化，自来水洗反蓝后，伊红染色，中性树脂封片。光镜下观察各组大鼠心肌组织形态学变化并拍照，结果见图7。可知，对照组心肌细胞纹理清晰排列整齐，结构完整，无炎细胞浸润；
模型组心肌细胞纹理界限模糊，排列紊乱，心肌细胞水肿，有大量炎细胞浸润；
SX-Z组、SX-L组、PT-L组和PT-Z组均可不同程度减轻ISO引起的心肌组织病变，心肌细胞水肿减轻，炎细胞浸润明显减少。

图7 各组HE染色结果(HE, ×20)

2.4.6 血清指标的测定 心电图监测完成后，腹主动脉取血6 mL，室温凝聚1 h后，3500 r/min（离心半径13.5 cm）离心10 min，分离上层血清放入EP管内，−80 ℃冰箱保存。测定时快速解冻，按照试剂盒说明书检测定血清中CK、LDH、cTn-T、SOD、MDA、TNF-α和IL-6水平，结果见表3。

与对照组相比，模型组大鼠血清中CK活力和cTn-T水平显著升高（＜0.01），LDH活力也明显升高（＜0.05）；
与模型组相比，SX-Z组、SX-L组、PT-Z组和PT-L组大鼠血清中CK活力显著降低（＜0.01），LDH活力也明显降低（＜0.05）；
与模型组相比，SX-Z组和PT-Z组大鼠血清中cTn-T水平显著降低（＜0.01），SX-L组和PT-L组大鼠血清中cTn-T水平也明显降低（＜0.05）。

与对照组相比，模型组大鼠血清中SOD活力显著降低，MDA、TNF-α和IL-6含量显著升高（＜0.01）；
与模型组相比，SX-Z组、SX-L组和PT-Z组大鼠血清中SOD活力明显升高（＜0.05），炎症因子IL-6含量显著降低（＜0.01），PT-L组大鼠血清中SOD活力无明显差异，IL-6含量明显降低（＜0.05）；
与模型组相比，SX-Z组、SX-L组、PT-L组和PT-Z组大鼠血清中MDA含量显著降低（＜0.01）；
与模型组相比，SX-Z组大鼠血清中炎症因子TNF-α含量显著降低（＜0.01），SX-L组和PT-Z组大鼠血清中炎症因子TNF-α含量明显降低（＜0.05），PT-L组大鼠血清中炎症因子TNF-α含量无明显差异。

表4 血清中CK、LDH、cTn-T、SOD、MDA、IL-6和TNF-α测定结果(, n = 8)

与对照组比较：#＜0.05##＜0.01；
与模型组比较：*＜0.05**＜0.01

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

3.1 FDBC对冰片稳定性的影响

通过比较FDBC与FDC在高温、高湿、光照条件下放置15 d及加速实验6个月后冰片含量的变化，发现FDBC中冰片含量更为稳定，表明将冰片制成微型软胶囊后再与其它固体成分装填于同一硬胶囊的处理方式可以显著提高冰片的稳定性。

3.2 FDBC对其他成分体外释放的影响

通过对溶出转速、介质体积及表面活性剂等进行考察，确立了丹参酮IIA、丹酚酸B、R1、Rg1及Rb1溶出度测定方法。比较发现，FDBC与FDC的溶出曲线基本一致，表明FDBC对冰片的特殊处理不会对其体外释药行为产生影响。其次FDC老化后各时间点的累积溶出率明显减少，说明FDC老化后释药速率降低，释药迟缓，而FDBC老化后，各时间点的累积溶出率与FDBC无明显差异，说明老化处理不会影响其体外释药行为，显示出FDBC的优越性。

3.3 FDBC对急性心肌缺血大鼠的保护作用

ISO是一种β受体激动剂，可兴奋心脏，造成心肌细胞缺血缺氧，其发病机制可能与氧化应激、内质网应激、炎症反应、脂质过氧化、细胞自噬和凋亡等直接或间接相关，与人体心肌缺血损伤的代谢和形态学异常有许多相似之处[21]。ISO诱导的动物模型，实验操作简单易行、成本低，常用于制备轻度心肌损伤、心肌肥厚（多用5 mg/kg）、心肌梗死（10～120 mg/kg或150～400 mg/kg，常用85 mg/kg）以及心力衰竭等动物模型[22]，因此，本实验采用5 mg/kg的ISO制备SD大鼠急性心肌缺血模型。

心电图ST抬高是临床心肌缺血诊断标志之一，其抬高程度可以反映心肌缺血和损伤的程度[23]。本实验大鼠注射ISO后，模型组心电图ST段明显抬高，出现心肌缺血症状，而FDBC和FDC干预可抑制ST段的抬高，说明二者均有一定的抗心肌缺血作用。2种胶囊老化后也均可抑制ST段的抬高，其中老化的FDBC的抑制效果更明显。

CK、LDH是心肌组织中特异性较高的酶，当心肌损伤时，心肌细胞膜通透性改变，多种心肌酶从心肌细胞中释放入血，使CK、LDH等在血清中含量显著升高[24]。cTn-T是一种心肌收缩调节蛋白，一般在心肌细胞受损14～24 h，其血清水平达高峰，是反映心肌损伤的标志物之一[25]。本实验发现，大鼠注射ISO后，大鼠血清中CK、LDH和cTn-T水平显著升高，而FDBC和FDC干预可以明显改善这些心肌酶水平的升高。FDBC老化后，仍可抑制血清中CK、LDH和cTn-T水平显著升高，只是对cTn-T水平的抑制作用稍减弱；
FDC老化后，对CK和cTn-T的抑制作用均减弱。

心肌组织病理学结果显示，ISO诱导心肌缺血后，心肌细胞破损，排列紊乱，并伴有细胞间隙水肿及大量炎细胞浸润，FDBC可以明显改善由ISO引起的心肌组织病理学改变，FDC和老化后的两种胶囊也可改善该心肌组织病理学改变。

SOD是机体内抗氧化酶防御机制之一，在消除氧自由基中起重要作用，MDA是脂质过氧化的产物，SOD的活力和MDA的含量可间接反应细胞所承受的自由基的损伤程度[26-27]。当心肌组织缺氧，会引起炎症细胞的聚集并释放IL-6、TNF-α等炎症因子，同时产生大量的自由基，进一步引起心肌损伤[28]，有文献报道丹酚酸类成分能对抗炎性因子而保护心肌[29]。本实验结果显示，FDBC、FDBC和老化的FDBC可以显著降低ISO诱导的心肌缺血大鼠血清中MDA、IL-6及TNF-α水平，提高SOD活力，提示其改善心肌缺血的机理可能与对抗缺血心肌的氧化应激及炎症反应有关。FDC老化后虽仍可对抗氧化应激及炎症反应，但抑制TNF-α水平和提高SOD活力的效果不明显。

综上所述，FDBC特有的冰片处理方式可以显著降低冰片挥发损失，同时不会对其有效成分的体内外释药行为及药效作用产生不利影响，显示出FDBC的制剂优越性，为解决中药挥发性物质不稳定问题提供了研究思路。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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andevaluation of Fufang Danshen Biphasic Capsules

XIA Ming-yan1, 2, WU Qiu-yang1, 3, WANG Can-jian1, 2, YANG Tao1, LI Dong-xun1, 2, WEI Xin-hua1, 2, WANG Tang-xun1, 2, ZHANG Guan-sheng1, 2, ZHANG Wen-liu1, 2, ZHANG Guo-song1, 2

1. Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, China 2. National Engineering Research Center of Chinese Medicine Solid Preparation Manufacturing Technology, Nanchang 330006, China 3. Pharmaron Beijing Co., Ltd., Beijing 101100, China

In order to confirm that Fufang Danshen Biphasic Capsules (FDBC, 复方丹参双相胶囊) can reduce the mass loss caused by volatilization of borneol without affecting theanddrug release behavior of other active ingredients, a comparative study was conducted between FDBC and Fufang Danshen Capsules (FDC, 复方丹参胶囊).GC method was used to determine the content of borneol in FDBC and FDC under high temperature, high humidity, bright light and accelerated experimental conditions. Using pH 1.2 hydrochloric acid solution, pH 4.5 acetate buffer, pH 6.8 phosphate buffer and pure water as the dissolution medium, the cumulative dissolution rate of tanshinone IIA, salvianolic acid B, notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1at different time points was adopted by the small cup method, then the dissolution curve was drawn. The rat model of acute myocardial ischemia was prepared by isoprenaline hydrochloride (ISO). After 7 days of prophylactic administration, the changes of ST segment of the rat"s electrocardiogram were monitored, the pathological damage of myocardial tissue was observed by hematoxylin-eosin staining, and the levels of creatine kinase (CK), lactic dehydrogenase (LDH), cardiac troponin-T (cTn-T), superoxide dismutase (SOD), malonaldehyde (MDA), tumornecrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in rat serum were determined with kits.The content of borneol in FDBC remained above 94.61% under high temperature, high humidity, bright light conditions and accelerated experimental conditions, while the content of borneol in FDC decreased significantly. The dissolution profiles of FDBC and FDC were similar. FDBC could improve the changes of ST segment of ECG in rats with myocardial ischemia induced by ISO, reduce the content of myocardial enzymes in serum, keep the structure of myocardial cells intact, and have obvious anti-myocardial ischemia effect. FDC had the same anti-myocardial ischemia effect.Compared with FDC, FDBC can significantly reduce the mass loss caused by volatilization of borneol without affecting therelease and pharmacological effects of other components, showing the advantages of FDBC.

Fufang Danshen Biphasic Capsules; Fufang Danshen Capsules; stability;dissolution; borneol; tanshinone IIA; salvianolic acid B; notoginsenoside R1; ginsenoside Rg1; ginsenoside Rb1; myocardial ischemia; myocardial enzymes

R283.6

A

0253 - 2670(2023)04 - 1064 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.006

2022-08-12

国家自然科学基金资助项目（81660667）；
国家自然科学基金资助项目（81960720）；
江西省主要学科学术和技术带头人资助项目（20182BCB22023）；
江西中医药大学创新药物研究与开发创新团队资助；
南昌市高层次科技创新人才“双百计划”项目资助；
江西中医药大学博士科研启动基金项目资助（2021BSZR014）

夏明艳（1991—），女，硕士研究生，研究方向为新药开发及仿制药一致性评价研究。Tel: (0791)87119617 E-mail: 2844797505@qq.com

张国松（1981—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为药物新剂型与新技术研究。Tel: (0791)87119623 E-mail: zhgs81411@aliyun.com

张文锍（1976—），男，硕士，副教授，硕士生导师，研究方向为中药新型给药系统的研究。Tel: (0791)87119623 E-mail: 1764523036@qq.com

#共同第一作者：吴秋焱（1997—），女，硕士研究生，研究方向为药物新剂型与新技术。

[责任编辑 郑礼胜]

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