不同炮制方法对知母饮片化学成分的影响*
时间：2023-06-16 11:40:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
任栩慧 许平翠 邓雪慧 吴美兰 王娜妮,#
1 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310053
2 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007
3 浙江景岳堂药业有限公司 浙江 绍兴 312025
知母是百合科植物知母的干燥根茎，其化学成分种类复杂，最主要的为黄酮类和甾体皂苷类[1，2]，具有多种药理作用，如抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]、抗骨质疏松等[6]。目前，知母的炮制饮片主要包括净知母、清炒知母、麸炒知母、酒知母、醋知母、盐知母、知母炭等7种规格[7]。知母的药性会随着炮制的不同而发生改变。例如，净知母苦寒滑利，多用于温病壮热烦渴[8]；
盐炙可引药下行，专于入肾，能增强滋阴降火的作用[9]；
与盐炙相反，酒炙则引药上行[10]，改变药性[11]；
目前对于知母炮炙前后药理药效变化的研究热点多在滋阴降火方面。现已有关于知母炮制前后化学成分变化的报道，但是主要集中于盐炙或麸炒方法，对以上7种炮制规格知母饮片化学成分的系统对比尚未见报道。本文通过前期课题组优化的炮制工艺对知母进行炮制，比较不同炮制品水溶性浸出物和2种成分含量的差异，研究不同炮制方法的影响，以期对临床选用知母炮制品和药理活性研究提供依据。
1.1 仪器：Agilent 1260 Infinity Ⅱ Prime液相色谱仪（Agilent公司，配备蒸发光散射检测器、紫外检测器）、KQ-400DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、ME104E型电子天平（梅特勒公司）、DK-S24型电热恒热水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、BPG-9056A精密鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、Smart2PureUV/UF纯水仪（THERMO）、具塞锥形瓶、移液枪、移液管、蒸发皿。
1.2 药品及试剂：知母药材购于浙江景岳堂药业有限公司，产地为河北（执行标准：中国药典2015年版），芒果苷（批号：151226，纯度≥98%）购于北京世纪奥科生物技术有限公司，知母皂苷BⅡ（批号：16041602，纯度：99.45%）购于北京世纪奥科生物技术有限公司；
乙腈溶液（色谱纯）、稀乙醇。知母样品经不同炮制方法后性状见图1。
图1 知母样品经不同炮制方法后表观变化
2.1 知母炮制品的制备：①净知母：取大小均匀的知母原药材，将杂质去除后放置于滚筒式洗药机洗净，润制一段时间后晾晒，切薄片，厚度为4mm左右，50℃恒温干燥。②清炒知母：取大小均匀的知母片，置于热锅中，用文火炒至知母呈焦，用器具将其取出后筛去碎屑，晾凉，备用，即得。③麸炒知母：将麸皮均匀撒入热锅中，待飘起青烟后，倒入知母片，炒至颜色开始泛黄后取出，再筛去麸皮，晾凉，备用，即得。④酒知母：取大小均匀的知母片一定量，加入适量黄酒闷润，待酒液被完全吸尽后，置于炒制容器内，用文火加热至炒干，取出晾凉，备用，即得。⑤醋知母：取一定量知母片，加入适量醋闷透，待醋被吸尽后，放置于自控温旋盖电炒药机内，加热，炒10min，取出晾凉，即得。⑥盐知母：取一定量知母片，加一定浓度的食盐水拌匀，闷透，待盐水被吸尽后，放置于自控温旋盖电炒药机内加热，炒10min，取出晾凉，即得。⑦知母炭：将知母生药放在铁锅内用火炒黑存性，即得。
2.2 分析方法：分述如下。
2.2.1 对照品溶液的配制：精密称取芒果苷和知母皂苷BⅡ，加稀乙醇配置成每1mL含50μg的溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液的配制：取知母药材或其不同炮制品粉末（过三号筛）0.1g，精密称定，置25mL具塞锥形瓶中，加稀乙醇25mL，称重，超声提取（功率40w，频率100Hz），补足失重。过0.22μm膜孔滤膜，置于进样瓶进行高效液相色谱测定。
2.2.3 色谱条件：Inertsil ODS-3 C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流动相：乙腈（B）-0.2醋酸水（A）溶液，梯度洗脱程序：0～15min，10%～15%B；
15～20min，15%～25%B；
20～25min，25%～35%B；
35～40min，60%～90%B；
40～45min，90%～10%B；
柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长258nm，ELSD气体流速1.6mL/min，漂移管温度80℃，进样量20μL。
2.3 方法学考察：分述如下。
2.3.1 线性关系：精密移取1.0mg/mL的芒果苷和知母皂苷BⅡ对照品溶液适量，用流动相梯度稀释，按2.2.3项色谱条件进样，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标（x），芒果苷或知母皂苷BⅡ峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性方程，详见表1。
表1 芒果苷和知母皂苷BⅡ的线性方程及线性范围
2.3.2 精密度：取同一混合对照品溶液，连续进样6次，按2.2.3项色谱条件进样，记录峰面积，计算芒果苷和知母皂苷BⅡ的RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 重复性：取同一知母样品，按2.2.2项供试品溶液制备方法平行制备6份，按2.2.3项色谱条件进样，记录峰面积，计算芒果苷和知母皂苷BⅡ的RSD均小于3.0%，表明此方法重复性良好。
2.3.4 稳定性：取同一知母供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24h，按2.2.3项色谱条件进样，记录峰面积，计算芒果苷和知母皂苷BⅡ的RSD均小于3.0%，表明样品稳定性良好。
2.4 色谱分析结果：将芒果苷、知母皂苷BⅡ对照品溶液和知母不同炮制样品溶液的色谱图进行对比，见图2。
图2 知母炮制品液相色谱图
在蒸发光散射检测器下，知母皂苷BⅡ出峰时间约为25.0min；
在紫外检测器下，芒果苷出峰时间约为17.8min。样品色谱图分离度良好，直观可见不同知母炮制品峰高、峰面积各有差异。
2.5 不同炮制方法测得芒果苷、知母皂苷BⅡ、浸出物的含量比较：研究从药材到炮制品，芒果苷、知母皂苷BⅡ、浸出物含量的量值传递规律，分析不同炮制方法对量值传递的影响。7种炮制品与知母药材相比，结果见图3。
图3 不同炮制方法对知母饮片芒果苷、知母皂苷BII和浸出物的影响
采用HPLC-UV-ELSD方法中的UV检测器，可检测不同炮制品中芒果苷的含量。知母药材中的芒果苷含量为0.97%，知母炭中的芒果苷含量最少，为0.35%，而最高的是醋知母，为1.90%，其次是麸炒知母。按芒果苷含量高低排列为：醋知母＞麸炒知母＞净知母＞酒知母＞盐知母＞清炒知母＞知母片＞知母炭。采用HPLC-UVELSD方法中的ELSD检测器，可检测出不同炮制品中知母皂苷BⅡ的含量。知母药材中的知母皂苷BⅡ为3.28%，净知母中知母皂苷BⅡ的含量最高，为3.55%，其次为酒知母，最低的是知母炭仅为2.19%。按知母皂苷BⅡ含量高低排列是：净知母＞酒知母＞醋知母=盐知母＞清炒知母=麸炒知母＞知母片＞知母炭。
采用热浸法，以水作为溶剂分析不同炮制品中浸出物的含量。知母药材的浸出物为47.61%，炮制后的知母除知母炭和麸炒知母外都有不同程度的增加，浸出物最低的饮片是麸炒知母，比知母药材少了2.36%，知母炭和麸炒知母的浸出物分别为47.12%和45.25%。浸出物最高的饮片为酒知母，比知母药材高了11.14%，为58.75%。净知母为49.21%，清炒知母为49.38%，醋知母为55.92%，盐知母为50.23%。按浸出物含量高低排列为：酒知母＞醋知母＞盐知母＞清炒知母＞净知母＞知母片＞知母炭＞麸炒知母。
芒果苷的含量在各炮制品中都有增加，可能有以下三个原因：①炮制加热使知母药材质地疏松，加速了芒果苷溶出；
②加热会引起新芒果苷7位糖苷键(Glu-O)断裂转化为芒果苷，导致芒果苷的含量在炮制品中变化[12]；
③盐炙工艺研究更有利于新芒果苷水解生成芒果苷[13，14]。
知母中含有知母皂苷AⅢ、BⅡ、B等甾体皂苷，有研究发现经炮制后知母皂苷E的含量有所降低，而知母皂苷AⅢ、BⅡ、BⅢ的含量升高。推测可能由于知母皂苷E分子结构为呋甾烷醇型皂苷型，由于其本身化学性质不稳定，在加热、加盐的因素下，转化为知母皂苷BⅡ[15]。知母炭的炮制条件相对比较苛刻，可能造成了知母中多种有效成分的分解，因此芒果苷和知母皂苷BⅡ含量均显著降低。
中医临床常用的300种饮片中，醋炙品约70余种，各种文献表明，醋炙可以增效，用来增加有效成分的溶解度，增加有效成分的含量或溶出量，引药入肝；
还可以减毒，破坏毒性成分，降低毒性成分含量[16]。
酒炙法是中药炮制的重要方法之一，传统中药炮制理论认为：药物酒炙后有升提作用，缓和药物的寒性，酒炙后药物中有效成分或辅助成分的溶出量会增加，各不同成分的溶出比例也会发生变化。有研究表明酒炙知母对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用弱于生知母，但不能说明酒炙知母的降糖效果弱于生知母，因为糖尿病的发病机制较为复杂，我们还需从不同的降糖机制入手，考察其他降糖指标[17]。
综观古今知母的炮制技术，绝大多数都是以盐为辅料，采用炒、拌等方法来炮制知母，其中用的最多的便是盐炙法，即使目前药典及全国大部分地区炮制知母大多采用盐炙法，炮制对知母化学成分及药理作用产生的影响至今都没有完全开发。因而我们需要在整理历代炮制沿革的基础上对各种炮制方法进行系统研究，早日实现知母炮制的规范化、标准化及现代化，保证其临床用药的安全有效，加强对知母炮制的现代化研究。
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