利用GT1-7细胞系研究ghrelin对下丘脑刺鼠相关蛋白的表达效果
时间：2023-06-15 20:50:03 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
李培鑫 饶志坚 黄 虎
(1.首都医科大学附属北京友谊医院医疗保健中心综合外科，北京 100050；
2.上海师范大学体育学院人体科学教研室，上海 200234；
3.东卡罗来纳大学运动人体科学系、生理系、人体机能研究所 东卡罗来纳糖尿病与肥胖研究所，美国北卡来纳州 27834)
过去的十几年里，全球已有超6.5亿成人患有肥胖症，而肥胖是2型糖尿病的重要危险因素，也是心血管疾病的决定因素，目前急需一种行之有效的治疗方案[1-3]。袖状胃切除术(sleeve gastrectomy，SG)操作简便、减重效果明显，并可缓解2型糖尿病，尤其腹腔镜下SG，目前已成为应用最广泛的代谢手术之一[1, 4]。但SG对于机体代谢改变的机制仍未明确。目前普遍认为SG通过降低ghrelin使机体代谢改变[4-6]。Ghrelin(胃促生长素，俗称饥饿素)主要由胃底分泌，与下丘脑生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)结合，促进神经肽Y/刺鼠相关蛋白(neuropeptide Y/agouti-related protein，NPY/AgRP)神经元分泌NPY/AgRP，从而促进生长激素释放、促进进食行为并导致肥胖[1, 7]。然而由于ghrelin作用的神经元位于下丘脑，无法直接进行人体实验，动物实验需通过电生理学进行[8]，又很难达到普及。细胞实验相对容易操作，但目前缺乏适合操作的永生细胞系。本文旨在介绍一种可对ghrelin刺激产生反应的细胞系，并揭示ghrelin对AgRPmRNA表达的影响。
1.1 材料
小鼠下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神经元细胞系GT1-7细胞系，以及人肝癌细胞HepG2细胞系，均由美国东卡罗来纳大学、东卡罗来纳糖尿病与肥胖研究所惠赠。本研究利用的研究信息不含有使受试者的身份被直接识别或通过与其相关的识别物识别的信息，免除伦理审查。
1.2 主要试剂
试剂：达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin，P/S)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸[trypsin-EDTA，0.05%(质量分数)]，购于美国Thermo Fisher Scientific公司。Ghrelin ，购于美国Cayman Chemical 公司。
普通细胞培养液按DMEM 445 mL、FBS 50 mL、P/S 5 mL进行混合[10%(体积分数)FBS、 1%(质量分数) P/S]配制；
无血清细胞培养液(无FBS)按DMEM 495 mL、P/S 5 mL进行混合[1%(质量分数)P/S]配制。
细胞裂解液[cell lysis buffer(10×)]、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，购于美国Cell Signaling Technology 公司。BCA蛋白定量分析试剂盒、硝酸纤维膜(NC膜)(0.45 Micron，30 cm × 3.5 m/卷)，购于美国Thermo Fisher Scientific公司。蛋白质电泳胶板(4%～20% CriterionTMTris-HCl Protein Gel，18孔，30 μL/孔)，美国Bio-Rad Laboratories公司。一抗GHSR[GHS-R1 (E-7)， sc-374515]、二抗牛单克隆抗小鼠二抗耦联辣根过氧化物酶(bovine anti-mouse IgG-HRP，sc-2371)，购于美国Santa Cruz公司。
总RNA抽提试剂(trizol)，购于美国Invitrogen公司；
实时荧光定量 PCR 预混液(power SYBR green PCR master mix)，购于美国Applied Biosystems公司；
反转录反应试剂[prime script RT master mix(RR036A)]，购于日本TAKARA公司。基因引物序列参考已发表文献[1, 9-10]，详见表1。
表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequence
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养
将冻存的细胞在37 ℃水浴槽内复苏，加入 DMEM(10% FBS、 1% P/S)，1 000 r/min离心5 min，超净台内弃除上清液，细胞沉淀加入新鲜普通细胞培养液，吹打致悬，转移至100 mm无菌细胞培养皿内，放入37 ℃，5%(体积分数)二氧化碳培养箱。待细胞汇合度达80%～90%左右，进行传代。弃除旧液，加入2 mL 0.05% trypsin-EDTA，待细胞消化适度，加入8 mL DMEM终止消化， 1 000 r/min离心5 min，弃除上清液，按1∶3传代。传代至第三代时进行相应实验。
1.3.2 GT1-7细胞GHSR表达的检测
从同期3个GT1-7细胞培养皿以及3个HepG2细胞培养皿内分别提取细胞蛋白，进行Western blotting。HepG2细胞为对照组。
1.3.3 血清饥饿对GT1-7细胞的影响
将细胞转移至6孔无菌细胞培养板，传代方式同上，每100 mm培养皿加入12 mL DMEM制造细胞悬液，每孔2 mL细胞悬液。待细胞汇合度达70%～80%左右，弃除旧的DMEM。其中3孔加入含FBS培养液，为含FBS组；
另外3孔加入无FBS培养液(仅1% P/S)，为不含FBS组。放入培养箱12 h后，提取cDNA，进行RT-qPCR，检验两组间mRNA表达量差异。
1.3.4 不同时间ghrelin刺激对含FBS培养液的GT1-7细胞的影响
将细胞转移至6孔无菌细胞培养板，共2板，传代方式同上。待细胞汇合度达70%～80%左右，弃除旧的DMEM。3孔加入含FBS培养液，为空白对照组；
另取一板，3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含FBS培养液，为3 h组，放入培养箱内；
2 h后将上述培养板的另外3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含FBS培养液，为1 h组，放入培养箱内；
1 h后提取cDNA，进行RT-qPCR，检验3组间mRNA表达量差异。
1.3.5 不同浓度ghrelin刺激对含FBS培养液的GT1-7细胞的影响
将细胞转移至6孔无菌细胞培养板，共2板，传代方式同上。待细胞汇合度达70%～80%左右，弃除旧的DMEM。3孔加入普通培养液，为空白对照组；
3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含FBS培养液，为100 nmol/L组；
3孔加入含50 nmol/L ghrelin的含FBS培养液，为50 nmol/L组；
3孔加入含10 nmol/L ghrelin的含FBS培养液，为10 nmol/L组。放入培养箱3 h后，提取cDNA，进行RT-qPCR，检验4组间mRNA表达量差异。
1.3.6 Western blotting操作步骤[1, 8]
弃除DMEM，细胞裂解液加入PMSF置入培养皿后刮取细胞，按标准步骤提取蛋白后，应用BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度，随后应用4%～20% CriterionTMTris-HCl Protein Gel进行电泳，后电转至NC膜，三羟甲基氨基甲烷聚山梨醇酯20缓冲液(tris-buffered saline with Tween-20，TBS-T)配制的5%(质量分数)脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗(无抗体，或GHS-R1(E-7)1∶1 000，或GHS-R1(E-7) 1∶500)4 ℃过夜，二抗(bovine anti-mouse IgG-HRP，1∶2 000)室温孵育2 h。以上各步之间应用TBS-T洗膜。应用电化学发光法显影，Bio-Rad ChemiDoc Touch影像系统曝光、显影、摄像。
1.3.7 RT-qPCR操作步骤[1, 8]
弃除DMEM，加入TRIzol后刮取细胞，提取总RNA后，应用全功能酶标仪Synergy H1测量RNA纯度(260/280比值在1.8～2.0之间者采用)及浓度。应用Prime Script RT Master Mix(RR036A)合成cDNA。应用Power SYBR Green PCR Master Mix配制反应液(3倍复孔)，应用Applied Biosystems ViiA 7 system进行RT-qPCR，并测量mRNA相对表达量。
1.4 统计学方法
2.1 GT1-7细胞可以表达GHSR
经Western blotting检测，GT1-7细胞可表达GHSR，而HepG2细胞不表达GHSR，详见图1。
图1 GT1-7细胞表达GHSRFig.1 GT1-7 cells express GHSRGHSR: growth hormone secretagogue receptor.
2.2 血清饥饿对GT1-7细胞表达AgRP mRNA的影响
经RT-qPCR多次检测，GT1-7细胞无NPY mRNA的表达，但可表达AgRPmRNA。血清饥饿可以影响AgRPmRNA的表达量，含FBS组：1.00±0.14，不含FBS组：3.45±0.16，两组间AgRPmRNA相对表达量差异有统计学意义(t=- 11.649，P=0.000)，详见图2。血清饥饿使GT1-7细胞显著增加了AgRPmRNA的表达。
图2 血清饥饿对AgRP mRNA表达的影响Fig.2 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells by serum starvation
2.3 不同时间ghrelin刺激对含FBS培养液的GT1-7细胞表达AgRP mRNA的影响
在含FBS(饱食)状态下，不同时间ghrelin刺激对AgRPmRNA的表达量不同，空白对照组：1.00±0.08， 1 h组：1.18±0.43，3 h组：1.75±0.16。3 h组分别与空白对照组及1 h组AgRPmRNA相对表达量差异有统计学意义(与空白对照组比较：LSD-t=5.03，P=0.002，与1 h组比较：LSD-t=3.86，P=0.008)，而1 h组与空白对照组比较差异无统计学意义(LSD-t=1.18，P=0.284)，详见图3。即使在含FBS(饱食)状态下，ghrelin刺激3 h后可使GT1-7细胞显著增加AgRPmRNA的表达。
2.4 不同浓度ghrelin刺激对含FBS培养液的GT1-7细胞表达AgRP mRNA的影响
在含FBS(饱食)状态下， ghrelin刺激3 h后，不同浓度对AgRPmRNA的表达量影响不同，空白对照组：1.00±0.07，10 nmol/L组：1.32±0.11，50 nmol/L组：1.30±0.09，100 nmol/L组：1.66±0.04。应用不同浓度ghrelin处理的各组与空白对照组中AgRPmRNA相对表达量差异均有统计学意义(与10 nmol/L组比较：LSD-t=2.71，P=0.027；
与50 nmol/L组比较：LSD-t=2.54，P=0.035；
与100 nmol/L组比较：LSD-t=5.57，P=0.001)，高浓度ghrelin组(100 nmol/L)与低浓度ghrelin组(10 nmol/L组及50 nmol/L组)AgRPmRNA相对表达量差异均存在统计学意义(与10 nmol/L组比较：LSD-t=2.86，P=0.021；
与50 nmol/L组比较：LSD-t=3.03，P=0.016)，10 nmol/L组及50 nmol/L组之间AgRPmRNA相对表达量差异无统计学意义(LSD-t=0.17，P=0.868)，详见图4。即使在含FBS(饱食)状态下，ghrelin刺激3 h后，AgRPmRNA的表达量仍显著增加，但是低浓度ghrelin显著低于高浓度ghrelin增加的AgRPmRNA表达量。
图3 不同时间100 nmol/L ghrelin刺激对AgRP mRNA 表达的影响Fig.3 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells in non-serum-starvation medium by ghrelin (100 nmol/L) stimulation at different time duration
图4 不同浓度ghrelin刺激3 h对AgRP mRNA表达的影响Fig.4 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells in non-serum-starvation medium by ghrelin stimulation at different concentration
Ghrelin是由28个氨基酸组成的肽类激素，主要由胃底分泌[11]，又称胃促生长素，可以与GHSR结合，控制生长激素的释放，促进食欲并维持能量守恒。在人类的进化过程中，其最重要的生理功能是保护机体避免因饥饿导致低血糖[7, 11-12]。在饥饿和能量不足时，下丘脑弓状核(arcuate nucleus，ARC)的神经元在ghrelin等激素的刺激下，通过AgRP/NPY、γ-氨基丁酸等作用于室旁核从而促进摄食[13]。GHSR主要分布于ARC内的促进食欲的表达AgRP/NPY的神经元内，AgRP/NPY主要产生促进进食、减少能量消耗的作用，而且AgRP/NPY负责了ghrelin绝大部分在摄食和代谢方面的作用[14]。肥胖、糖尿病、高血压、不孕症等均与表达AgRP/NPY的神经元的过度活跃有关[3, 15]。除了机械性限制食物摄入之外，目前比较公认的SG改善代谢的机制就是通过切除胃底，减少ghrelin分泌，进而限制ARC分泌AgRP/NPY，从而减少食欲、增加能量消耗。为了全面了解肥胖症等代谢疾病以及代谢手术的作用机制，充分研究下丘脑神经元的细胞及分子机制是非常有必要的[16]。但是挑选合适的研究对象则是一个困难的选择。
Ghrelin作用的靶点神经元位于下丘脑，临床研究很难取得人体下丘脑标本，故无法进行相关实验。动物实验虽有进行，但要么为间接实验，要么需相关专业设备或操作极其困难。Kawasaki等[17]对大鼠行SG，应用RT-qPCR测量下丘脑中NPYmRNA表达量，间接说明下丘脑神经元变化；
Li等[1]对NPY-绿色荧光蛋白(neuropeptide Y-green fluorescent protein，NPY-GFP)小鼠行SG，应用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)直接观察下丘脑神经元变化。以上两项研究通过测量循环ghrelin，与其他结果一起分析，证实SG术后ghrelin减少，并影响下丘脑神经元活动，但均为间接实验。Laing等[8]处死小鼠后，立即切取下丘脑冰冻切片，应用LSCM直接观察下丘脑神经元，给予包括ghrelin在内的各种刺激，进行电生理学实验。该实验为直接实验，但要求小鼠年龄为6周内，故无法研究SG机制，仅可用来研究ghrelin对下丘脑神经元的影响；
而Perez-Tilve等[18]通过侧脑室注射ghrelin，直接观察ghrelin对下丘脑神经元的影响。以上两项研究，对研究者的技术要求极高，很难达到普及。
而细胞实验相对容易操作，近年来各种基因组编辑工具，如常间回文重复序列丛集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技术，使细胞实验可以进行更多的研究。有关ghrelin与神经元细胞之间的机制研究就可应用细胞实验完成。虽然通过神经元原代培养可以进行研究，但由于下丘脑神经元众多，难以实际操作。本文采用的下丘脑永生细胞系GT1-7细胞，培养简单，是由小鼠下丘脑分离获得的，具有高度分化的神经内分泌细胞典型特征，目前广泛应用于生殖调控的研究中[19-20]。笔者首先通过Western blotting证明GT1-7细胞具有GHSR ，可对ghrelin产生反应。进而通过RT-qPCR证实该细胞可以表达AgRPmRNA，故GT1-7细胞可应用于ghrelin对下丘脑NPY/AgRP神经元影响的相关研究。
笔者发现，如果去除培养液中的血清，也就是模拟饥饿状态下，细胞就会增加AgRPmRNA的表达量，这与其他动物实验或人体实验结果相符[17]，提示机体在饥饿状态下增加AgRP而避免低血糖。另外，笔者发现，即使在含FBS培养液中，也就是模拟饱食的状态下，ghrelin依然可以刺激AgRPmRNA的表达，但是ghrelin在饱食状态下需要3 h的刺激才可以引起AgRPmRNA的表达升高，为时间依赖。同时，笔者发现随着ghrelin浓度的升高，AgRPmRNA的表达量亦随之升高，也就是说AgRPmRNA的表达是受ghrelin浓度影响的，ghrelin浓度越高，AgRPmRNA的表达量越高，反之，如果减少ghrelin的分泌，AgRPmRNA的表达量也会减少，进而AgRP的促进进食、减少能量消耗的作用就会减少，以至于出现食欲下降，能量消耗增加。许多研究观察到SG术后患者的血清ghrelin水平下降[4-5, 21]，结合笔者的细胞实验结果发现，SG切除了患者包括胃底在内的80%的胃组织，从而减少了ghrelin的分泌，随着血清ghrelin浓度的降低，下丘脑表达AgRP/NPY的神经元的活性随之减弱，分泌的AgRP/NPY减少，最终导致患者食欲下降、能量消耗增加。而食欲下降、能量消耗增加，则可以导致包括体质量下降、血糖稳定等在内的代谢改善。
ARC内控制进食、调节平衡代谢的神经元还有很多，如表达阿片-促黑素细胞皮质素原(proopiomelanocortin，POMC)的神经元以及表达酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)的多巴胺能神经元。Li等[1]发现，SG术后可导致下丘脑弓状核区表达TH的神经元数量减少、表达POMC的神经元数量增加，所以未来可应用GT1-7细胞进行关于TH及POMC相关的研究。Ge等[7]发现由小肠或肝脏分泌的肝表达抑菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide 2，LEAP2)可以非竞争性拮抗GHSR与ghrelin结合，从而使机体减少进食。除此之外， LEAP2还具有抑制ghrelin分泌的功能，从而进一步减少机体的食物摄取。正常情况下，LEAP2几乎不在正常的胃组织内分泌，但是SG术后残胃中的LEAP2的分泌量却显著增加。Li等[1]发现SG术后，小鼠肝脏中LEAP2 mRNA的表达量升高。综上所述，LEAP2的分泌增加，也有可能是SG产生其相应的代谢效应的原因之一。在将来的研究中，可以利用GT1-7细胞进一步研究LEAP2，ghrelin与下丘脑调节代谢平衡的神经元之间的关系。
Klotho蛋白因其抗衰老的作用最早被学者认识。Klotho与成纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)23共同作用，并与FGF受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)形成受体复合物产生抗衰老作用。随着对其研究深入，尤其是α-Klotho亚型，具有抗炎、抗氧化应激和调控离子通道等多种生物学功能，目前在肾损害[22]、肾移植[23]、心脏损害[24]、阿尔茨海默病[25]等方面广泛研究，而笔者所在团队则将Klotho引入肥胖及2型糖尿病等代谢疾病的研究。通过侧脑室注射α-Klotho发现α-Klotho通过FGFR增加了POMC神经元活性、抑制 NPY/AgRP神经元活性，并减少了AgRPmRNA表达。但侧脑室导管的置入手术、侧脑室注射、甚至小鼠在置入侧脑室导管后的活动均可能造成部分小鼠的死亡，最终导致将α-Klotho的长期效果研究改为短期效果研究[26]。而笔者的另一项研究[27]则通过应用GT1-7细胞系发现α-Klotho通过磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-related kinases，ERK)下调了AgRPmRNA的表达，而FGFR1的抑制剂则可抑制该过程。所以，未来可应用GT1-7细胞系进行更多的下丘脑相关神经元通过α-Klotho调节代谢的研究，尤其是信号通路研究。
基于以上研究，本团队发现血清饥饿使GT1-7细胞增加AgRPmRNA表达，ghrelin即使在饱食状态下也可以刺激GT1-7细胞增加AgRPmRNA表达，并且为时间及浓度依赖。因此，GT1-7细胞可作为研究下丘脑神经元对AgRP调控，以及下丘脑神经元对其他代谢功能的调节，尤其是其背后分子机制研究的体外模型。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明李培鑫：提出研究思路，设计研究方案，操作实验，统计数据，撰写论文；
饶志坚：把关实验操作的准确性，复审统计结果；
黄虎：总体把关，确保研究方案可行性，审定论文。
