老年白内障患者血清miR-26a和miR-26b表达水平及意义*
时间：2023-06-15 17:00:06 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
曾 涛，唐晓蕾，曾 建
电子科技大学医学院附属绵阳医院·绵阳市中心医院眼科,四川绵阳 621000
白内障是导致中老年人低视力和致盲的主要病因，据统计50岁以上人群白内障患病率达22.24%，70岁以上为60.03%[1]。白内障以晶状体混浊为主要病理特征，上皮-间质转化(EMT)介导的晶状体纤维化是导致晶状体混浊的关键[2]。EMT可介导成肌纤维细胞积累，胶原蛋白过度分泌，沉积于晶状体，引起晶状体浑浊和视力障碍[3]。微小核糖核酸(miRNA)具有基因转录后表达水平调控作用，影响细胞增殖、分化、凋亡等过程，在晶状体上皮细胞凋亡和EMT过程中也发挥着重要的作用[4]。现有研究显示miR-26家族成员miR-26a、miR-26b在EMT和纤维化中起关键作用，miR-26a可通过抑制EMT减少滋养层细胞增殖和侵袭[5]，还可负性调控心房组织血管紧张素Ⅱ/ Kruppel样因子4/转化生长因子-β(TGF-β)通路抑制心脏纤维化[6]。miR-26b可抑制其靶点Gata4表达水平，抑制血管紧张素-Ⅱ引起的心室心肌细胞中心钠素和β肌球蛋白重链表达水平，抑制心肌纤维化和肥大[7]。但miR-26a、miR-26b在白内障的报道十分少见，鉴于此本研究拟检测血清miR-26a、miR-26b的表达水平，分析其与老年人白内障易感的相关性。
1.1一般资料 选择2018年2月至2021年12月本院收治的137例老年白内障患者作为白内障组，其中男56例，女81例，年龄62～77岁，平均(68.15±5.19)岁，中位体质量指数23.65 kg/m2，中位收缩压135.26 mm Hg，中位舒张压72.16 mm Hg；
基础疾病：高血压51例，糖尿病75例；
吸烟史62例，饮酒史35例。纳入标准：(1)裂隙灯显微镜、超声等检查确认存在晶状体混浊，经临床诊断为白内障[8]；
(2)年龄60岁以上；
(3)入组前未接受手术、药物治疗。排除标准：(1)眼外伤、眼球震颤、青光眼等；
(2)瞳孔、晶状及角膜等器质性病变；
(3)患有感染、免疫性疾病或血液疾病；
(4)合并肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化等疾病。另选择同期于本院门诊体检的107例志愿者作为对照组，均排除白内障、青光眼、眼底病变等眼部疾病，其中男42例，女65例，年龄61～76岁，平均(67.79±5.07)岁，中位体质量指数23.52 kg/m2，中位收缩压134.05 mm Hg，中位舒张压72.09 mm Hg；
基础疾病：高血压42例，糖尿病35例；
吸烟史23例，饮酒史21例。两组受试者均对本研究知情同意；
白内障组合并糖尿病、吸烟史比例高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
两组年龄、性别、体质量指数、收缩压、舒张压、合并高血压比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2仪器与试剂 M-MLV 逆转录酶(Epicentre 公司)，TRIzol试剂盒(美国赛默飞公司)，CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)，cDNA逆转录试剂盒购自美国赛默飞公司，引物序列测定及合成由上海基康公司完成，SpectraMax®iD5 多功能酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司)，双抗体夹心酶联免疫试剂盒购自奥维亚生物技术有限公司。使用日立HITACHI 7600-020全自动生化分析仪及其配套试剂。
1.3方法
1.3.1miR-26a、miR-26b的表达水平及纤维化指标检测 所有受试者均于入组后当天采集静脉血3 mL注入干燥试管，血液凝固后取上层液离心(4 ℃ 3 000 r/min，半径10 cm，时间15 min)，上机检测。采用TRIzol法提取总RNA，选择吸光度值A260/A280比值位于1.9～2.1的RNA样品，采用M-MLV 逆转录酶将其转录为cDNA。逆转录反应条件：50 ℃逆转录反应45 min,再85 ℃ 5 min灭活逆转录酶。实时荧光PCR 仪检测血清中miR-26a、miR-26b的表达水平。引物序列：miR-26a正向引物为5′-CGG TTC AAG TAT CCA GGA-3′;反向引物为5′-TGG GTT CAT TTG TGG GTC TT-3′。miR-26b正向引物为5′-CGG CCT GTT GTC CAT TAG T-3′，反向引物为5′-TGG GTT CAT TTC TGG GTG TT-3′。β-actin正向引物为5′-TGT CCA CCT TCC AGC AGA TGT-3′，反向引物为5′-GCT CAG TAA CAG TCC GCC TAG A-3′。反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ′(2×)12.5 μL，dNTP 1.6 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，正、反向引物 10 μmol/L各1 μL，加反应缓冲液至20 μL。反应参数：92 ℃预变性 20 s，96 ℃ 变性2 s，85 ℃延伸 20 s，80 ℃ 退火6 s，共30 个循环。以β-actin 为内参，2-ΔΔCt法计算miR-26a、miR-26b相对表达水平，取3 次平行试验的平均值。取血清样本，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清转化生长因子-β2(TGF-β2)、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原肽(PCⅢ)水平。
1.3.2临床资料收集 收集所有受试者性别、年龄、体质量、收缩压、舒张压、基础疾病(高血压、糖尿病)、生活习惯(吸烟、饮酒、户外阳光暴露时间)、实验室指标；
收集患者白内障晶状体浑浊分级(LOCSⅢ分级)。采用酶法检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、直接法测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。血糖仪检测末梢血空腹血糖(FPG)，ACCESS 2全自动免疫分析及其配套试剂测定血清空腹胰岛素(FINS)。根据FPG、FINS计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)]，公式为HOMA-IR= FPG×FINS/22.5。LOCSⅢ分级从6张晶状体断面彩色照片分析晶状体核(NC)颜色和皮质(C)，后囊膜(P)浑浊程度并进行评分，评分范围：NC颜色1.0～6.9分，C浑浊为1.0～5.9分，P浑浊为1.0～5.9分[9]。
2.1白内障组和对照组LOCSⅢ分级户外阳光暴露时间、糖脂代谢指标比较 白内障组LOCSⅢ分级NC颜色评分1～5分，平均(3.39±0.78)分；
C评分1～4分，平均(2.45±0.37)分；
P评分1～3分，平均(1.97±0.23)分。白内障组户外阳光暴露时间长于对照组，血清TC、FPG、FINS水平，HOMA-IR指数高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 白内障组和对照组户外阳光暴露时间、糖脂代谢指
2.2白内障组和对照组血清miR-26a、miR-26b和血清纤维化指标比较 白内障组血清miR-26a、miR-26b表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，TGF-β2、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 白内障组和对照组血清miR-26a、miR-26b和血清纤维化指标差异
2.3miR-26a、miR-26b表达与LOCSⅢ分级评分的相关性 miR-26a、miR-26b表达与LOCSⅢ分级NC颜色、C、P评分均呈负相关(P<0.05)，见表3。
表3 miR-26a、miR-26b表达与LOCSⅢ分级评分的相关性
2.4miR-26a、miR-26b表达水平与纤维化指标相关性分析 miR-26a、miR-26b表达水平与TGF-β2、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ均呈负相关(P<0.05)，见表4。
表4 miR-26a、miR-26b表达水平与纤维化指标相关性
2.5老年白内障易感的因素分析 将糖尿病(赋值：0=否，1=是)、吸烟史(赋值：0=否，1=是)、户外阳光暴露时间，TC、FPG、FINS、HOMA-IR、miR-26a、miR-26b纳入Logistic方程，向后逐步法排除无关变量，最终糖尿病是老年白内障易感的危险因素(P<0.05)，miR-26a、miR-26b是保护因素(P<0.05)，见表5。校正糖尿病影响后，miR-26a(OR=0.436，95%CI：0.302～0.619)、miR-26b(OR=0.411，95%CI：0.295～0.603)仍与老年白内障易感有关(P<0.05)。
表5 老年人发生白内障的危险因素
2.6miR-26a、miR-26b诊断白内障的价值分析 miR-26a、miR-26b、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ诊断白内障的最佳截断值为2.31、2.65、261.35 μg/L、159.42 μg/L、96.08 μg/L、125.19 μg/L，曲线下面积为0.689、0.775、0.775、0.804、0.797、0.837，结合Logistic回归模型分析联合miR-26a、miR-26b诊断白内障的曲线下面积为0.954，经Delong test 检验联合检测高于单独miR-26a、miR-26b、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ(Z=7.101、5.298、6.235、5.135、0.598、0.435，P<0.05)，见表6和图1。
表6 miR-26a、miR-26b诊断白内障的效能
图1 miR-26a、miR-26b诊断白内障的ROC曲线
白内障是一种常见的与年龄相关的疾病，由晶状体浑浊引起。正常晶状体是弹性、透明、双凸的球形结构，由上皮细胞和纤维细胞组成，晶状体赤道部上皮细胞不断向体内延伸分化成纤维细胞，以维持晶状体的透光性，实现光反射和光调节功能。晶状体EMT可引起上皮细胞异常增殖迁移，导致上皮结构完整性受损，散乱的间充质样细胞会积聚到晶状体上皮细胞，分泌过多的纤连蛋白和胶原蛋白，导致结缔组织积累和纤维化，最终丧失正常晶状体结构和功能，发生晶状体浑浊[10]。miRNA是一组长度为22～25个核苷酸的非编码RNA分子，可通过翻译抑制或mRNA降解调节其靶标参与多种生物过程，已知miR-146a通过靶向Notch1抑制TGF-β诱导的人晶状体上皮细胞EMT过程[11]，miR-22-3p通过靶向组蛋白去乙酰基酶6促进α-微管蛋白乙酰化来防止晶状体纤维化进展[12]，miR-30a-5p则可靶向SNAI1抑制晶状体上皮细胞的EMT[13]。
miR-26家族包含两个成熟的miRNA，分别是miR-26a和miR-26b，miR-26表达主要由缺氧状态下缺氧诱导因子诱导，在细胞分化过程中也出现上调，miR-26靶基因参与细胞代谢、增殖、分化、凋亡、侵袭和转移，在多种不同类型肿瘤中表达异常，是一种癌症潜在的有价值生物标志物和治疗新靶点。有研究显示，miR-26在肝癌[14]、乳腺癌[15]、肠道肿瘤[16]中发挥抑癌基因作用。在纤维化疾病中，miR-26家族也同样具有重要作用，ZHANG等[17]报道显示，miR-26a可直接抑制TGF-β2表达降低结缔组织生长因子水平，阻止肾纤维化。WEI等[18]报道指出miR-26a通过分别靶向胶原蛋白Ⅰ和结缔组织生长因子抑制心脏纤维化进程。miR-26a还可通过直接靶向Smad4、Smad3抑制TGF-β2诱导的特发性肺纤维化[19]。miR-26b通过靶向抑制Kelch样ECH相关蛋白Ⅰ表达介导核因子红细胞2相关因子2激活，减弱胶原蛋白Ⅰ和α平滑肌肌动蛋白表达，抑制异丙肾上腺素诱导的心脏纤维化[20]。miR-26b还可通过抑制自噬减弱心肌细胞中胰岛素样生长因子-1表达水平，抑制心肌肥大[21]。
本研究结果发现，白内障患者miR-26a、miR-26b表达水平均下调，且二者与晶状体浑浊程度呈负相关，说明miR-26a、miR-26b可能参与了老年人白内障发病和进展的过程。进一步相关性分析结果显示，miR-26a、miR-26b表达均与TGF-β2、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平呈负相关。TGF-βS是最显著的促纤维化因子，TGF-β2是房水中TGF-βS的主要亚型，TGF-β2诱导的EMT在晶状体纤维化中发挥关键作用[22]。HA是结缔组织主要成分，主要由间质细胞合成，LN由内皮细胞合成，可介导细胞间黏连作用，在纤维化疾病中，HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平均明显升高[23-24]。由此可见miR-26a、miR-26b可能通过调控晶状体纤维化参与了老年人白内障的发病过程。分析可能的机制为：miR-26b可作用于晶状体上皮细胞中Smad4和选择性环氧化酶2，上调E-钙黏蛋白的表达水平，下调间充质相关蛋白的表达水平，抑制晶状体上皮细胞增殖迁移和EMT过程[25]，进而抑制晶状体纤维化。Jagged-1/细胞表面跨膜蛋白(Notch)是纤维化关节信号通路，Jagged-1/Notch激活可诱导TGF-β2表达上调和EMT过程[26]。miR-26a、miR-26b可直接靶向Jagged-1/Notch信号传导抑制TGF-β2的表达水平，逆转EMT和纤维化进程，miR-26a、miR-26b还可抑制TGF-β2表达逆转晶状体纤维化进程[27]。
本研究ROC曲线分析结果显示，miR-26a、miR-26b诊断白内障死亡曲线下面积为0.689、0.775，说明二者均具有诊断白内障的价值，联合miR-26a、miR-26b及纤维化指标HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ指标后诊断效能明显提高，miR-26a、miR-26b均低于阈值及HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ升高提示更高的白内障患病风险。
综上所述，老年人白内障患者血清miR-26a、miR-26b的表达水平均降低，miR-26a、miR-26b低表达可能是导致老年人发生白内障的危险因素。miR-26a、miR-26b可能通过诱导晶状体纤维化参与白内障发病过程。miR-26a、miR-26b可作为白内障诊断的辅助指标，有望成为白内障未来治疗的靶点。本研究局限性在于未检测晶状体中miR-26a、miR-26b的表达水平，晶状体局部miR-26a、miR-26b的表达水平变化及其与晶状体纤维化程度的关系尚无法验证，仍需进一步纳入手术治疗的白内障患者加以证实。
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