视网膜内质网应激免疫组织化学抗体浓度选择的实验研究

陈小红，梁婉娇，黄诗舒，孙 晏，罗 欣，赖 璐，池昭晟，陈梅珠，王云鹏，严伟明

应用已知抗体和抗原发生特异性结合，并通过化学反应使标记在结合后的特异性抗体上的显色剂(如荧光素、酶、金属离子和核素)显色，以确定组织细胞内抗原的存在，对其进行定位、定性及半定量研究，称为免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)[1]。目前广泛应用于肿瘤疾病、感染疾病及药物靶向治疗等方面[2]。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反应主要包括三种通路，即肌醇需要酶1(inositol-requiring protein-1，IRE1)通路、转录激活因子6(activating transcription factor-6，ATF6)通路、蛋白激酶样内质网激酶(PKR-related ER kinase，PERK)通路。当发生ERS时，其上、下游多种相关信号分子亦发生相应的改变，本研究选用葡萄糖调剂蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12，Caspase-12)作为反应ERS的上、下游分子的检测指标。

近年研究发现，多种视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)模型中内质网有异常蛋白堆积，有相应ERS反应发生[3-5]；
目前在RP动物模型的构建中，N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)诱导的RP模型已被广泛报道[6-8]。IHC亦应用于ERS通道研究[9-13]，但其在ERS通道相关抗体使用浓度缺乏统一标准，且因实验标本不同，根据抗体说明书建议稀释比例进行IHC，其结果可能过强或较弱。因此，本研究选用MNU诱导的小鼠RP模型，应用IHC技术检测其视网膜ERS反应通路，探讨IRE1、ATF6、PERK、GRP78、Caspase-12抗体的最佳使用浓度，以期为研究RP发病机制及干预措施提供相应指标的检测方法。

1.1材料

1.1.1实验动物清洁级、健康雄性C57BL/6J小鼠[上海昇敞生物科技有限公司，SCXK(沪)2021-0002]，6～8周龄，体质量16～20g。于室温22℃～25℃、明暗交替12h/12h的环境中适应性饲养14d，食水不限。实验动物的使用遵循视觉与眼科研究协会(Association for Research in Vision and Ophthalmology，ARVO)相关规定，并通过伦理审查(2021-001)。

1.1.2主要试剂与器材戊巴比妥钠溶液(上海行知化工厂，1%体积质量比)；
盐酸赛拉嗪注射液[商品名：陆眠宁，吉林省华牧动物保健品有限公司；
规格：2mL∶0.2g；
批号：兽药字(2015)070011777]；
N-甲基-N-亚硝基脲(MNU，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，N136701-1g)，4℃环境储存于惰性气体中，使用前立即溶解于含0.05%醋酸的盐水中；
粉剂型抗原修复液(柠檬酸法)(福州迈新生物技术开发有限公司，MVS-0066)；
抗体稀释液(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9030)；
小鼠二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-9002)；
兔二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-9001)；
Anti-IRE1抗体(美国abcam，ab37073)；
Anti-ATF6抗体(美国abcam，ab203119)；
PERK抗体(B-5)(美国santa cruz，sc-377400)；
BiP(C50B12) Rabbit mAb(GRP78)(美国Cell Signaling Technology，3177S)；
Caspase-12抗体(1611)(美国santa cruz，sc-21747)。电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，SECURA124-1CN)；
组织包埋机(LEICA，EG1150)；
自动脱水机(LEICA，ASP300S)；
石蜡切片机(LEICA，RM2245)；
隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司，GHP-9080)；
光学显微镜(OLYMPUS，BX53)。

1.2方法

1.2.1动物造模取8只C57BL/6J小鼠，采用随机分组法分为正常组(N)和造模组(M)，每组4只，分别腹腔注射生理盐水和60mg/kg MNU[14]，造模后第7d时分别对小鼠进行视网膜电图(electroretinogram，ERG)检测及摘取小鼠眼球行苏木精-伊红(HE)染色组织切片，以观察到ERG呈熄灭型、HE染色组织切片上视网膜外核层感光细胞消失为小鼠RP模型造模成功。

1.2.2ERG检测完全暗适应2h以上，采用戊巴比妥钠(0.3mL/100g)和盐酸赛拉嗪注射液(0.01mL)联合腹腔注射麻醉小鼠，复方托吡卡胺滴眼液点眼散瞳，安装电极(记录电极置于小鼠右眼角膜中央，参考电极置于小鼠同侧颊部，接地电极插于小鼠尾部皮下)。固定小鼠于Ganzfeld刺激器前,运用RETI-SCAN视觉电生理检查系统(德国Roland Consult公司)进行国际临床视觉电生理学会(International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV)ERG五项检测，包括暗适应0.01反应、暗适应3.0反应、暗适应Ops波反应、明适应3.0反应、明适应Flicker反应(明适应反应检测前进行10min标准光强明适应)[15]。

1.2.3组织切片制作ERG检查结束后，注射大剂量戊巴比妥钠溶液使小鼠死亡，立即摘取右侧眼球，置于混合固定液(冰乙酸、甲醛、生理盐水、75%乙醇按1∶2∶7∶10比例配制)中2h后，用注射器在眼球角膜中央扎一小孔，放回固定液中继续固定24h[16]。将固定24h后的眼球置于自动脱水机中，经梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡后制成石蜡标本。在组织包埋机上，按瞳孔-晶状体-视神经轴方向固定眼球，进行包埋，待石蜡凝聚成块后，在旋转石蜡切片机上，每个眼球沿瞳孔-视神经轴方向切片，取经视神经连续6张切片，厚度为4μm，摊片、捞片。

1.2.4HE染色组织切片在烤片机上70℃烤片20min，脱蜡至水、HE染色后树脂封片。光学显微镜下观察小鼠眼球组织切片结构。

1.2.5IHC染色将恒温水箱70℃烤片1h的切片经脱蜡、复水、抗原修复后，3% H2O2中室温封闭10min，PBS冲洗后，滴加一抗(阴性对照用PBS代替一抗，根据说明书及目前相关研究报道，按以下浓度稀释抗体：IRE1 1∶125、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000；
ATF6 1∶100[17]、1∶250、1∶500、1∶1000[18]、1∶2000；
PERK 1∶100[19-20]、1∶500、1∶1000、1∶1500；
GRP78 1∶100[21-22]、1∶200[23-24]、1∶500[25]；
Caspase-12 1∶100[26]、1∶500、1∶1000)，37℃孵育1h；
PBS冲洗后，37℃环境先后滴加增强剂、二抗，各孵育20min；
DAB显色剂显色，苏木精复染，乙醇脱水透明封片。光学显微镜下观察，并于视乳头旁500μm处拍摄高倍镜(40×10)视野照片，通过图像分析软件Image J对视网膜内质网应激蛋白染色阳性信号进行定量分析。

2.1RP小鼠模型造模情况腹腔注射给药后第7d时，正常组小鼠视网膜各层组织结构排列整齐，未见明显变化，ERG暗、明适应3.0反应均可见b波；
而造模组小鼠视网膜外核层细胞基本消失，且ERG暗、明适应3.0反应的b波均消失，ERG波形大致呈熄灭型，表明小鼠RP模型建立成功(图1)。

图1 正常组和造模组小鼠视网膜形态与功能检测结果 A：HE染色显示正常组小鼠视网膜各层形态结构正常(绿色箭头示视网膜外核层)；
B：HE染色显示造模组小鼠视网膜外核层细胞凋亡(红色箭头示视网膜外核层)；
C：正常组小鼠造模后第7d ERG暗、明适应3.0反应均可见b波振幅的代表性波形(绿色箭头示b波位置)；
D：造模组小鼠造模后第7d ERG暗、明适应3.0反应均可见b波振幅消失的代表性波形(红色箭头示b波位置)。RPE：视网膜色素上皮层；
OS：外节；
IS：内节；
ONL：外核层；
OPL：外丛状层；
INL：内核层；
IPL：内丛状层；
GCL：神经节细胞层。

2.2RP小鼠视网膜ERS相关蛋白IHC染色

2.2.1RP小鼠视网膜IRE1蛋白IHC染色结果IHC染色结果显示，IRE1抗体浓度为1∶125、1∶250、1∶500时，全视网膜(包括细胞核、细胞浆)均呈棕色；
IRE1抗体浓度为1∶1000、1∶2000时，视网膜神经节细胞层中神经节细胞呈阳性表达，内核层部分细胞呈阳性表达，外核层细胞呈绕核阳性表达，其余视网膜结构层均呈淡棕色，见图2A。

图2 RP小鼠视网膜不同浓度IRE1抗体IHC染色结果 A：IRE1不同抗体浓度IHC染色典型图，A1：1∶125；
A2：1∶250；
A3：1∶500；
A4：1∶1000；
A5：1∶2000；
A6：阴性对照。B：定量分析各抗体浓度IHC染色阳性表达结果，bP<0.01 vs IRE1抗体浓度1∶125；
dP<0.01 vs IRE1抗体浓度1∶250；
fP<0.01 vs IRE1抗体浓度1∶500；
hP<0.01 vs IRE1抗体浓度1∶1000。

IRE1抗体浓度为1∶125、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000时，RP小鼠视网膜IRE1阳性表达分别为(32.93±3.44)%、(34.33±2.59)%、(33.56±2.63)%、(29.89±2.77)%、(21.90±2.39)%，差异有统计学意义(F=54.996，P<0.001)，其中除IRE1抗体浓度为1∶125、1∶250、1∶500时，IRE1蛋白阳性表达两两比较差异无统计学意义(均P>0.05)，其余抗体浓度IRE1蛋白阳性表达两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)，见图2B。

2.2.2RP小鼠视网膜ATF6蛋白IHC染色结果IHC染色结果显示，视网膜内节层至神经节细胞层均可见阳性表达，其中神经节细胞层、内核层、外核层为核周表达，神经节细胞层、内核层中少数细胞呈阳性表达，且表达强度随ATF6抗体稀释倍数增加而减弱，见图3A。ATF6抗体浓度为1∶100、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000时，RP小鼠视网膜ATF6蛋白阳性表达分别为(33.47±2.96)%、(32.48±1.30)%、(25.27±1.07)%、(25.42±2.14)%、(13.02±1.98)%，差异有统计学意义(F=348.948，P<0.001)，其中除ATF6抗体浓度为1∶100、1∶250时和ATF6抗体浓度为1∶500、1∶1000时，ATF6蛋白阳性表达差异均无统计学意义(P>0.05)，其余抗体浓度ATF6蛋白阳性表达两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)，见图3B。

图3 RP小鼠视网膜不同浓度ATF6抗体IHC染色结果 A：ATF6不同抗体浓度IHC染色典型图，A1：1∶100；
A2：1∶250；
A3：1∶500；
A4：1∶1000；
A5：1∶2000。B：定量分析各抗体浓度IHC染色阳性表达结果，bP<0.01 vs ATF6抗体浓度1∶100；
dP<0.01 vs ATF6抗体浓度1∶250；
fP<0.01 vs ATF6抗体浓度1∶500；
hP<0.01 vs ATF6抗体浓度1∶1000。

2.2.3RP小鼠视网膜PERK蛋白IHC染色结果IHC染色结果显示，PERK抗体浓度为1∶100时，全视网膜呈强阳性表达，PERK抗体浓度为1∶500、1∶1000、1∶1500时，除神经节细胞层、内核层及外核层的细胞核外，其余视网膜结构均呈阳性表达，见图4A。PERK抗体浓度为1∶100、1∶500、1∶1000、1∶1500时，PERK蛋白阳性表达分别为(68.03±6.84)%、(38.51±3.91)%、(39.18±5.78)%、(31.90±5.76)%，差异有统计学意义(F=153.712，P<0.001)，其中除PERK抗体浓度为1∶500、1∶1000时，PERK蛋白阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)，其余抗体浓度PERK蛋白阳性表达两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)，见图4B。

图4 RP小鼠视网膜不同浓度PERK抗体IHC染色结果 A：PERK不同抗体浓度IHC染色典型图，A1：1∶100；
A2：1∶500；
A3：1∶1000；
A4：1∶1500。B：定量分析各抗体浓度IHC染色阳性表达结果，bP<0.01 vs PERK抗体浓度1∶100；
dP<0.01 vs PERK抗体浓度1∶500；
fP<0.01 vs PERK抗体浓度1∶1000。

2.2.4RP小鼠视网膜GRP78蛋白IHC染色结果IHC染色结果显示，视网膜神经节细胞层、内核层表现为绕核阳性表达，其中神经节细胞层少数细胞呈阳性反应，内核层及外核层个别细胞呈阳性反应，且随抗体稀释倍数增加阳性表达减弱，见图5A。GRP78抗体浓度为1∶100、1∶200、1∶500时，RP小鼠视网膜GRP78蛋白阳性表达分别为(15.32±3.57)%、(12.75±2.35)%、(10.75±2.78)%，差异有统计学意义(F=12.740，P<0.001)，且两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5B。

图5 RP小鼠视网膜不同浓度GRP78抗体IHC染色结果 A：GRP78不同抗体浓度IHC染色典型图，A1：1∶100；
A2：1∶200；
A3：1∶500。B：定量分析各抗体浓度IHC染色阳性表达结果，bP<0.01 vs GRP78抗体浓度1∶100；
cP<0.05 vs GRP78抗体浓度1∶200。

2.2.5RP小鼠视网膜Caspase-12蛋白IHC染色结果IHC染色结果显示，除视网膜神经节细胞层、内核层及外核层细胞核外，其余视网膜结构均呈阳性表达，见图6A。Caspase-12抗体浓度为1∶100、1∶500、1∶1000时，RP小鼠视网膜Caspase-12蛋白阳性表达分别为(24.24±4.30)%、(14.26±2.21)%、(12.26±1.46)%，差异有统计学意义(F=96.978，P<0.001)，且两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图6B。

图6 RP小鼠视网膜不同浓度Caspase-12抗体IHC染色结果 A：Caspase-12不同抗体浓度IHC染色典型图，A1：1∶100；
A2：1∶500；
A3：1∶1000。B：定量分析各抗体浓度IHC染色阳性表达结果，bP<0.01 vs Caspase-12抗体浓度1∶100；
dP<0.01 vs Caspase-12抗体浓度1∶500。

IHC染色通过已知一抗及相应二抗与特定目标分子反应，再通过酶标抗体染色法，使目标分子在普通显微镜下即可直接观察其分布情况。目前RP相关研究中，常使用免疫荧光染色技术(IF)进行亚细胞器定位；
然而IF染色信号需通过荧光显微镜或共聚焦显微镜显现，技术要求相对较高[27]。内质网是细胞内细胞器的一种，负责细胞内多种蛋白的折叠、加工。ERS是由于正常内质网的内环境受到多种因素刺激后导致蛋白折叠异常、堆积，最终引起细胞功能紊乱，甚至引起细胞凋亡，造成相应疾病的产生，其中包括RP。运用IHC技术检测ERS通道相关蛋白，包括ATF6、PERK、IRE1、GRP78、Caspase-12，根据其阳性反应强度变化，可大致判断ERS三条通路在RP中的参与程度，探索其发病机制，具有简单可行性。

然而，目前关于应用IHC研究ERS相关蛋白的抗体浓度及染色方法未见详细统一报道。Crespo等[28]于2012年探索谷氨酰胺对实验性炎性肠病大鼠ERS和细胞凋亡的影响，对结肠标本行IHC染色时，使GRP78抗体与标本4℃孵育过夜，未明确提及抗体稀释比例。Liu等[29]在2015年研究氟中毒成骨细胞ERS反应时，应用IHC检测氟暴露Wistar大鼠骨组织，其中GRP78、Caspase-12抗体稀释比例为1∶100。2016年，Guo等[23]研究ERS是否参与镍肾毒性机制时，应用稀释比例为1∶200的GRP78抗体与氯化镍(NiCl2)激活的肉仔鸡肾脏组织在4℃孵育过夜。Hirai等[30]于2018年研究ER在麻风病发病机制中的意义，对麻风病患者标本进行IHC检测，其中GRP78、PERK、IRE1α和ATF6抗体按1∶100比例稀释，孵育时间为14h。2020年，Samanta等[31]研究ERS与卵巢癌的相关性时，采用IHC染色检测患者标本时，GRP78、PERK、ATF6抗体孵育30～60min，未明确提及稀释比例。

不同疾病模型中，ERS反应参与程度不同，且实验组织标本各异，因此若简单根据抗体说明书提供的IHC抗体稀释比例及抗体孵育时间或不同疾病、组织的相关研究数据进行实验，最终IHC染色结果差异较大，未能达到实验者所需的最适阳性表达。目前尚无IHC应用于视网膜ERS反应相关指标的详细研究报道，而本研究前期预实验发现ATF6、PERK抗体单纯根据说明书建议的稀释比例进行IHC染色，均未能得到较满意的IHC染色结果。因此，本研究针对RP小鼠模型，将ERS通路中的相关抗体根据说明书及在现有相关研究的基础上，各设置3个及以上稀释浓度，孵育时间均为1h，以便后期根据其阳性表达程度，选择合适的抗体浓度检测相应指标。结果发现，IRE1、ATF6、PERK、GRP78、Caspase-12不同抗体浓度均可在视网膜呈阳性表达，但其强弱程度不同。IRE1抗体浓度为1∶125、1∶250、1∶500时IRE1蛋白阳性表达无区别，且均呈强阳性，IRE1抗体浓度为1∶1000时阳性表达较适宜，IRE1抗体浓度1∶2000时内核层阳性表达明显减弱，这与麻风病组织IHC染色时所使用的1∶100 IRE1抗体孵育14h具有明显差异[30]。ATF6抗体浓度为1∶100和1∶250时其蛋白阳性表达在视网膜各层结构均较强、无法区别，ATF6抗体浓度为1∶500和1∶1000时ATF6蛋白阳性表达适宜，ATF6抗体浓度为1∶2000时其阳性表达在神经节细胞层、内核层、外核层均不显著，而麻风病组织IHC染色时采用1∶100 ATF6抗体孵育14h[30]，卵巢癌组织ATF6抗体(未说明抗体浓度)IHC染色一抗孵育时间为30～60min[31]，均与本研究不同。PERK抗体各浓度阳性表达均较强，PERK抗体浓度为1∶1500时其目标蛋白阳性表达仍较适宜，本研究中1∶1500的PERK抗体稀释比例远远低于麻风病组织所使用的1∶100 PERK抗体稀释浓度，且孵育时间明显缩短[30]。GRP78抗体浓度为1∶200时，其在RP小鼠视网膜神经节细胞层中与内核层中绕核阳性表达清晰、强度适宜，目前已有的相关研究中，GRP78较常用的稀释比例为1∶100[28，31]，亦可见1∶200的抗体稀释比例[23]，但其一抗孵育时间均远大于本研究抗体孵育时间。Caspase-12抗体浓度为1∶100时，在视网膜阳性表达较强，Caspase-12抗体浓度为1∶500、1∶1000时，Caspase-12蛋白阳性表达不明显，这与氟中毒成骨细胞ERS反应的相关研究所使用的抗体浓度相符[29]。

本研究结果表明，小鼠RP模型视网膜ERS通路相关抗体IRE1抗体浓度为1∶1000、ATF6抗体浓度为1∶500和1∶1000、PERK抗体浓度为1∶1500、GRP78抗体浓度为1∶200、Caspase-12抗体浓度为1∶100，一抗孵育时间为1h时，均可获得阳性表达强度较适宜的IHC检测结果，可在一定范围内作为后续研究RP中ERS发病机制及干预措施疗效提供具体指标检测参考。未来将在本研究基础上扩大实验动物数量、进一步探索MNU诱导的RP小鼠发病过程中视网膜ERS反应通路中各通路参与其发病机制的情况。

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