DNaseⅠ与Nd：YAP激光联合应用对根管内粪肠球菌生物膜清除作用的影响
时间：2023-06-15 10:30:10 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
叶静，刘青，温特，杜瑞，王园，马贲，尼娜△
根管治疗的主要目的是维持或促进根尖周组织的愈合［1］。治疗效果主要取决于机械预备、化学预备及根管充填［2］。然而，由于根管形态较为复杂，机械预备清理到的根管壁面积不超过总面积的35%［1］。另外，根管系统内的细菌以生物膜形式存在，其耐药性是浮游细菌100～1 000 倍，造成管内感染物清除相对困难［3］，机械预备配合化学预备最终清除的细菌仅达到50%～70%［4］。化学预备在感染根管治疗中尤为重要，目前临床常用的根管冲洗液虽种类繁多，但均不能完全清除感染根管中的粪肠球菌（E.f）生物膜［5］。自Whitchurch 等［6］发现脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）能够通过酶促降解细胞外基质细胞外DNA（eDNA）从而离散细菌生物膜以来，许多研究通过破坏生物膜细胞外基质来提高药物对生物膜的清除效果［7］。激光活化荡洗技术被广泛应用于去除根管内生物膜。Nd：YAP激光通过活化根管冲洗剂后具有明显的抑菌作用及去除玷污层的能力［8］，但DNaseⅠ与激光联合用于根管冲洗的效果尚不明确。本研究通过比较分析不同冲洗配伍方案，观察根管内E.f生物膜的去除情况，为DNaseⅠ与激光联合应用提供理论依据。
1.1 主要仪器与试剂 ATCC29212E.f购自美国模式菌种保藏中心。Nd：YAP 激光（Lokki，LONBAL 公司）；
次氯酸钠［NaOCl，朗力生物医药（武汉）有限公司］；
DNaseⅠ（10 U/mL，pH=6．8，AMPD1-1KT，美国Sigma-Aldrich 公司）；
SYTO-9 荧光染色剂（美国赛默飞世尔科技公司）；
PI 荧光染色剂、脑心浸液肉汤（BHI）培养基（北京索莱宝科技有限公司）；
KS160A-2型CO2培养箱（上海冠森生物科技有限公司）；
扫描电子显微镜（SEM，日本日立公司）；
Axio-Imager_LSM-800型激光共聚焦显微镜（CLSM，德国卡尔蔡司公司）；
96 孔板（上海生工生物工程股份有限公司）。
1.2E.f感染模型建立 收集2021年5月—2022年2月在天津市天津医院口腔科因正畸或牙周疾病而拔除的30颗前磨牙和磨牙。本研究经天津市天津医院医学伦理委员会批准（批准号：2021医伦理103）。纳入标准：离体牙发育完全，牙体完整，无裂纹，无龋坏，无充填物。将存于0．1%麝香草酚中的离体磨牙制备成2 mm×2 mm×1 mm（长×宽×高）的牙本质片，使用砂纸打磨抛光，共制备30 片。随后将其置于3%次氯酸钠（NaOCl）溶液中浸泡5 min，无菌去离子水冲洗，再浸泡于17%EDTA溶液中5 min，无菌去离子水冲洗。高温高压灭菌30 min 后，采用随机数字表法取2 片置于BHI 液体培养基中，37 ℃微需氧条件下（5%O2、85%N2、10%CO2）静置培养24 h，观察培养基中有无沉淀；
并将其置于BHI 固体培养基上划线后培养24 h观察有无菌落，从而检测牙本质片表面灭菌效果。若存在细菌需重新高温高压灭菌，在确定无残余活细菌后，将牙本质片置于无菌生理盐水中，4 ℃冰箱保存备用。
将E.f单菌落接种于新鲜配制的BHI 液体培养基中，37 ℃微需氧环境下静置培养，使用分光光度法监测细菌处于对数生长期（OD600nm=0．5，细菌浓度约1×108CFU/mL）时，取E.f液用BHI液稀释，调整菌液密度为1×107CFU/mL。将剩余28 片无菌牙本质片分别放入96 孔板中，将上述稀释好菌液加入96孔板。37 ℃微需氧条件下静置培养48 h，完成牙本质片表面E.f单菌种感染模型的建立，见图1。
1.3 SEM 观察感染模型建立情况 采用随机数字表法取3个样本固定于4%多聚甲醛24 h，PBS冲洗，采用乙醇逐级将样本脱水。真空下离子溅射仪喷金，采用SEM观察。
Fig．1 Establishment of a single E.f infection model on dentin discs图1 牙本质片表面粪肠球菌单菌种感染模型的建立
1.4 实验分组及处理 将剩余25 个培养48 h 的E.f生物膜样本采用PBS 冲洗去除游离菌后按照随机数字表法分为5组，每组5 个样本。A 组：2 mL PBS 轻轻冲洗去除游离菌，0．5%NaOCl 冲洗15 s；
B 组：2 mL PBS 轻轻冲洗去除游离菌，0．5%NaOCl 冲洗联合Nd：YAP 激光照射15 s；
C 组：1 mL PBS轻轻冲洗去除游离菌，1 mL DNaseⅠ溶液（10 U/mL，pH=6．8）冲洗，0．5%NaOCl 冲洗15 s；
D 组：1 mL PBS 轻轻冲洗去除游离菌，1 mL DNaseⅠ溶液（10 U/mL）冲洗，0．5%NaOCl 冲洗联合Nd：YAP 激光照射15 s；
E 组：1 mL PBS 轻轻冲洗去除游离菌，生理盐水冲洗15 s。Nd：YAP 激光照射根管时统一选择200 μm的光纤，平均功率为1．8 W，频率5 Hz。
1.5 CLSM 观察牙本质表面E.f黏附情况 处理后各组避光条件下加入SYTO-9/PI 混合液1 mL，染色15 min 后用1 mL无菌去离子水轻轻冲洗，CLSM应用2个通道观察，PI红色通道发射波长619 nm和激发波长559 nm，SYTO-9绿色通道发射波长520 nm 和激发波长448 nm。25 个样本均随机取3 个视野进行观察。利用Imaris v7．2．3软件对所获取的生物膜样本断层扫描图像进行三维重建，以荧光强度为筛选标准进行分析，计数绿色荧光量即为活细菌量。
1.6 统计学方法 采用SPSS 25．0 软件进行数据分析，非正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组间多重比较采用Bonferonni 法。P＜0．05为差异有统计学意义。
2.1 牙本质表面感染模型建立情况 SEM 观察可见牙本质表面的小管口开放，E.f黏附聚集在牙本质表面，并见到牙本质小管深层内细菌黏附，见图2。
Fig．2 SEM images of dentin surface infection model图2 牙本质表面感染模型的SEM图像
2.2 牙本质表面粪肠球菌黏附情况 CLSM观察可见A、B、C组CLSM图像中绿色荧光的活细菌散在分布于牙本质表面，D 组可见较少量的绿色荧光，E 组绿色荧光的活细菌覆盖全部样本表面。见图3。
2.3 各组活细菌量计数比较 A、B、C、D、E 组菌量（单位：×104/mm2）分别为38．33（32．18，52．23）、13．52（7．14，20．01）、3．79（1．50，7．50）、0．79（0．08，2．28）、122．76（99．14，156．15），组间比较差异有统计学意义（χ2=22．206，P＜0．01）。其中D 组中菌量明显小于A组和E组，C组菌量明显小于E组（P＜0．01），余组间活细菌量计数差异无统计学意义。
感染根管系统内的生物膜为多菌种生物膜［5］。在持续性或者继发性根管感染中E.f检出率为29%～77%，其为革兰阳性兼性厌氧菌［9-10］。在根管充填后E.f可以在无营养的根管内维持低代谢状态存活；
当环境改变，营养良好时其又将引起感染的复发［3］。此外，E.f在在10～45 ℃下均能够生长，且E.f具有耐药性，特别是黏附聚集形成生物膜后。不同研究中E.f黏附并形成生物膜的时间均不一致。相关报道建立E.f生物膜所需的培养时间为几小时、24 h、2周或3 周［1，3］。本研究在预实验中牙本质表面培养E.f在培养48 h时SEM直观清晰观察到E.f黏附聚集，证实成功建立了牙本质表面感染模型。Nd：YAP激光为波长1 341 nm 的最新激光类型，具有良好的热效应、爆破效应、空化效应以及负压效应，可以彻底对根管系统进行荡洗，甚至是侧支根管、根尖分歧、峡部这些区域［8，11］。Liu 等［3］研究Nd：YAP 激光活化荡洗技术对于根管内E.f生物膜的影响，发现激光组较仅应用5．25%NaOCl 组更能有效清除根管壁和牙本质小管内的E.f。目前临床中还常见应用Er：YAG激光辅助根管冲洗［12］。Golob 等［13］研究结果显示Er：YAG配合5%NaOCl能够有效去除E.f生物膜。本研究应用Nd：YAP激光配合0．5%NaOCl处理样本后E.f细菌量与只采用0．5%NaOCl 进行传统冲洗组差异无统计学意义。
DNaseⅠ是一种特异性的DNA 水解酶，能够在磷酸二酯键处切割单链或双链DNA［14］。eDNA是细菌生物膜细胞外多聚物基质的成分，其在细菌黏附、聚集以及生物膜形成、成熟和稳定中都起到重要的作用，并且在细菌耐受抗菌剂和逃避宿主免疫中也起到重要的作用［14-16］。已有研究证明，DNaseⅠ可通过降解eDNA 来减少E.f的黏附和生物膜的形成［7］。Ramaraj 等［10］研究DNaseⅠ与蜂毒素联合应用对于E.f生物膜的影响，结果显示DNaseⅠ提高了蜂毒素抗生物的作用，联合应用使生物膜对NaOCl 敏感性增加，降低了NaOCl 的使用浓度。Yu 等［17］研究表明，0．5%NaOCl 联合DNaseⅠ处理与5%NaOCl 单独处理的效果相同，DNaseⅠ增加了E.f生物膜对NaOCl的敏感性。NaOCl具有良好的抗菌性，但其浓度越大，细胞毒性越大［18］；
同时高浓度的NaOCl若流至根尖周组织或者接触口腔黏膜会引起剧烈疼痛、感染以及出现肿胀等情况。本研究采取低浓度的0．5%NaOCl溶液与DNaseⅠ联合应用观察E.f生物膜去除情况，结果显示C 组菌量明显小于E 组，D 组菌量明显小于A组和E组，但其与B组和C组菌量无明显差异，同时，B 组、C 组与A 组菌量无明显差异，证明DNaseⅠ可以联合Nd：YAP用于辅助冲洗，在联合使用过程中不会互相影响其清除细菌性能，并能有效提高0．5%NaOCl去除E.f生物膜的细菌量。
Fig．3 CLSM images of E.f adhesion on dentin surface after different ways of processing(SYTO-9/PI staining,×200)图3 不同方式处理后牙本质表面粪肠球菌E.f黏附的CLSM图像（SYTO-9/PI染色，×200）
综上所述，相较单独使用0．5%NaOCl，DNaseⅠ联合Nd：YAP激光与0．5%NaOCl进行冲洗能更有效地处理E.f生物膜。本研究为DNaseⅠ与激光联合应用处理E.f生物膜提供了理论依据，但是具体机制还有待深入研究。
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