不同施肥处理对杨树林地土壤微生物群落的影响
时间：2023-06-15 10:05:21 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
孙 慧，吴中能，苗婷婷，刘俊龙，苏晓华，丁昌俊，曹志华，闫彩霞，王 涛
（1安徽省林业科学研究院，合肥 230088；
2中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091；
3亳州市林业科学研究所，安徽亳州 233600）
长期栽植杨树纯林会导致严重的地力衰退，会使土壤氮、磷及有机质含量降低，林地生产力急剧下降[1-3]。姜啸虹等[4]指出合理轮作、适当混交、农林复合、科学施肥等均能改善杨树林地土壤退化。其中，施肥是提高林地生产力的重要措施之一[5-6]。不同种类的肥料，如：无机肥、有机肥、生物炭及生物菌肥等，对于改善土壤肥力、酶活性及微生物群落组成的作用不同[7-10]。土壤细菌和真菌是生态系统中重要的消费者和分解者，与土壤相互作用形成动态系统，不仅在土壤养分循环中起着关键作用，还与土壤质量息息相关[11-14]。有研究指出，使用不同的施肥处理均不同程度地影响杨树林地土壤微生物的组成[15-18]。卢伟伟等[19]得出300℃和500℃制备生物炭对土壤微生物影响的方向一致同时制备温度越高影响程度越大。也有研究表明，施用有机肥会增加土壤微生物功能多样性，比施用无机肥更能促进微生物的繁殖，同时能提高土壤微生物生物量和碳源利用率，促进植物营养的吸收[20-23]。王国兵等[24]指出施用有机肥+生物炭最有利于提高杨树人工林土壤微生物碳氮磷的含量。但是，针对施用不同配比的氮肥、磷肥、钾肥、有机肥和土壤改良生物菌肥对杨树林地的影响还未有相关的研究，故笔者以安徽北方5年生杨树二代林为研究对象，探讨不同施肥处理对杨树林地土壤微生物群落组成及多样性的影响，旨在找出合适的肥料配比方案，为提高土壤质量及微生物多样性和土壤可持续利用提供参考。
1.1 研究区概况
试验地位于涡阳县曹市镇徐楼村(33°20′—33°47′N，115°53′—116°33′E)，属暖温带半湿润季风气候。该区域气候温和，雨量适中，年平均气温15.1℃，历年平均日照时数为2015.7 h，年平均降雨量为809.8 mm。
1.2 样品采集
2016年选取品种、立地及生长状况基本一致的杨树二代林（2025杨）作为试验地。按正交试验法设计，采用L16(45)正交设计，3次重复，每个处理小区为15株，株行距为3 m×4 m。肥料种类为氮肥（尿素）、磷肥（过磷酸钙）、钾肥（硫酸钾）、有机肥和土壤改良生物菌肥，每种肥料采用4个水平，同时设3个对照，分别为：间作不施肥、只施复合肥和只施土壤改良生物菌肥，共计57个小区，19种处理及对照。通过连续4年的施肥试验，于2019年10月，根据林木长势情况，选取正交试验中部分代表性处理号开展了土壤理化性质和微生物检测，处理号共有7个，分别为：1号（对照），13号（年均胸径增长量最高），8号、11号、7号（位列2～4位），14号（超出年均胸径生长量平均值、位列第9），12号（年均胸径增长量最低）（施肥处理详见表1）。分别在小区内划分对角线，于对角线0、两边各1/2处，共3个采样点采集土样，分0～20、20～40、40～60 cm土层采取土样。采集的土样一部分置于泡沫箱保存，里面放上干冰，带回实验室置于-80℃冰箱保存，用于分析土壤微生物细菌及真菌群落组成；
另一部经风干后研磨过筛，用于土壤酶活性及土壤理化性质的测定。
表1 不同处理施肥剂量统计表
1.3 指标测定
晾干的土壤过筛后测定土壤过氧化氢酶(CAT)、脲酶(Urease)、碱性磷酸酶(ALP)、pH、有机质(SOM)、全氮(TN)、速效氮(AN)、全磷(TP)、速效磷(AP)、全钾(TK)及速效钾(AK)等土壤酶及土壤理化指标。
从冰箱中取出土壤样品解冻，使用DNA提取试剂盒进行DNA的提取。对16S RNA基因的V3～V4高可变区片段和ITS rDNA基因序列的ITS1～ITS2片段进行PCR扩增，每个样本3个重复，同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；
2%琼脂糖电泳检测。后续PCR产物送广州基迪奥公司进行测序。
1.4 数据处理
采用 Excel 2013、SPSS 20.0、R for Window 3.5.1、MEV 2.0、CANOCO 5.0软件进行数据处理和统计分析，采用聚类分析方法对微生物物种关系进行分析。
2.1 土壤微生物多样性特性
2.1.1 不同施肥处理土壤细菌多样性 由表2中α多样性指数可知，11号样地0～20 cm土层细菌Sobs值最大，为3552.33，表征其检测到的OUT个数最多；
7号样地0～20 cm土层细菌Shannon值较高，为9.88，代表其物种分布较均匀，多样性较高；
11号样地0～20 cm土层细菌Chao1和Ace值均最大，分别为4280.66和4289.15，表示它们预测的OTU个数最多；
13号样地40～60 cm土层土壤细菌Goods_coverage值较高，为0.9885，反映了其测序饱和度较高。
表2 不同施肥处理土壤细菌α多样性指数
Rank丰度曲线可直观的反应样品中包含的分类丰富度和均匀度，由图1可知，11号样地20～40 cm土壤细菌Rank丰度曲线在横轴上的跨度最大，其分类的丰富度越高；
在垂直方向上，13号样地40～60 cm土壤细菌Rank丰度曲线较平缓，反映了样品中物种分布较均匀。
图1 不同施肥处理土壤细菌Rank丰度曲线
2.1.2 不同施肥处理土壤真菌多样性 根据不同施肥处理土壤真菌α多样性指数可知（见表3），13号样地0～20 cm土层真菌Sobs值最大，为685.00，表征其检测到的OUT个数最多；
12号样地0～20 cm土层真菌Shannon值较高，为5.56，代表其物种分布较均匀，多样性较高；
13号样地40～60 cm土层真菌Chao1值最大，为1029.11，12号样地40～60 cm土层真菌Ace值最大，为1065.36，表示它们预测的OTU个数最多；
CK样地40～60 cm土层土壤真菌Goods_coverage值较高，为0.9882，反映了其测序饱和度较高。
表3 不同施肥处理土壤真菌α多样性指数
根据图2可得，13号样地0～20 cm土壤真菌Rank丰度曲线在横轴上的跨度最大，其分类的丰富度越高；
在垂直方向上，12号样地0～20 cm土壤真菌Rank丰度曲线较平缓，反映了样品中物种分布较均匀。
图2 不同施肥处理土壤真菌Rank丰度曲线
2.2 土壤微生物群落结构特征
2.2.1 不同施肥处理土壤细菌群落结构 从试验结果中挑选所有样本中的丰度均值排名Top10的物种详细展现，其他已知物种归为Others，未知物种标记为Unclassified。图3中不同施肥处理土壤细菌群落分布前十的菌属分别为MND1、Gaiella、小梨形菌属(Pirellula)专性好氧菌、RB41、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、放线菌纲酸微菌目 Iamia、Dongia、Haliangium、溶杆菌属(Lysobacter)及Subgroup_10。其中MND1在CK样地20～40 cm土层所占比例最大，为3.28%；
Gaiella在7号样地20～40 cm土层所占比例最大，为3.34%；
小梨形菌属(Pirellula)在11号样地40～60 cm土层所占比例最大，为3.19%。RB41在8号样地40～60 cm土层所占比例最大，为3.28%。
图3 不同施肥处理土壤细菌群落属水平上的分布特征
2.2.2 不同施肥处理土壤真菌群落结构 根据图4可知，不同施肥处理土壤真菌分布前十的菌属分别为蜡蚧菌属(Lecanicillium)、被孢霉属(Mortierella)、镰刀菌属 (Fusarium)、Populus、链 格 孢 属 (Alternaria)、Clonostachys、毛 壳 菌 属 (Chaetomium)、篮 状 菌 属(Talaromyces)、曲 霉 属 (Aspergillus)及 芸 苔 属(Brassica)。其中蜡蚧菌属(Lecanicillium)、被孢霉属(Mortierella)及镰刀菌属(Fusarium)3种菌属为优势菌属，蜡蚧菌属(Lecanicillium)在14号样地0～20 cm土层所占比例最大，为27.09%；
被孢霉属(Mortierella)在14号样地20～40 cm土层所占比例最大，为25.92%；
镰刀菌属(Fusarium)在11号样地20～40 cm土层所占比例最大，为28.53%。
图4 不同施肥处理土壤真菌群落属水平上的分布特征
2.3 不同施肥处理土壤微生物物种聚类分析
2.3.1 不同施肥处理土壤细菌聚类分析 微生物物种丰度热图可以反映样品之间的物种组成和差异，也可以对物种和样本进行聚类分析。由图5属水平上的物种丰度热图可知，7号样地40～60 cm和20～40 cm土层在物种组成上较为相似；
11号样地和12号样地0～20 cm土层在物种组成上较为相似。CK样地0～20 cm土层与8号、11号、12号及13号样地0～20 cm土层物种组成上具有较大的差异，CK样地0～20 cm土层内MND1、Ellin6067及出芽菌属(Gemmata)菌属组成比例较大，而8号、11号、12号及13号样地0～20 cm土层则较小。
图5 不同施肥处理土壤细菌群落属水平上的物种丰度热图
2.3.2 不同施肥处理土壤真菌聚类分析 如图6所示，在属的分类水平上，对总丰度前20的物种进行热图分析表明，8号样地0～20 cm土层和12号样地20～40 cm土层在物种组成上较为相似。各样地各土层的优势菌属均有较大的差异，说明真菌群落在土层中分布相关性较小。
图6 不同施肥处理土壤真菌群落属水平上的物种丰度热图
2.4 土壤微生物与土壤环境因子RDA分析
2.4.1 细菌群落与土壤环境因子RDA分析 RDA排序图中，分别以细菌和真菌菌属组成作为研究对象（蓝色小圆点表示），以CAT、Urease、ALP、pH、SOM、TN、AN、TP、AP、TK及AK作为土壤环境变量（红色箭头符号表示）。由图7可知，只有pH在第一象限，其他环境因子集中在第三、四象限内。其中脲酶和碱性磷酸酶的射线较长，说明它们对细菌菌属群落组成影响较大，而过氧化氢酶的射线较短，表明其对细菌菌属群落组成影响较小。细菌菌属在RDA排序图中以散射状分布在圆点附近，个别菌属分布较远。
图7 细菌群落与土壤环境因子RDA排序
2.4.2 真菌群落与土壤环境因子RDA分析 由图8可知，环境因子主要分布在第一、二及三象限内，脲酶的射线较长，说明其对真菌菌属群落组成影响较大；
而碱性磷酸酶、pH和速效钾的射线较短，表明它们对真菌菌属群落组成影响较小。真菌菌属在RDA排序图中主要集中在圆点附近，不同施肥处理样地土层真菌群落分布也较分散，说明它们的组成差异较大。
图8 真菌群落与土壤环境因子RDA排序
杨树人工林土壤退化的原因主要是多代连作、不科学的施肥方式、泛滥的使用农药及不合理的集材方式等，其中科学施肥是有效改善土壤退化的方式之一[4]。本研究旨在通过对连续施用不同肥料的杨树二代林土壤理化性质、酶活性及微生物群落变化地分析，找出适宜改善林地土壤状况的科学施肥配比。任嘉红等[25]指出微生物群落结构的变化会直接影响土壤的质量和健康状况，土壤微生物细菌及真菌多样性指数越高，其微生物多样性越丰富，土壤微生态系统越复杂，功能就越稳定。本研究表明：11号样地施用了250N、500P、500有机肥及200土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土层细菌Sobs、Chao1及Ace值均最大；
同时7号样地施用了125N、500P、75K及100土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土层细菌Shannon值较高，表层土壤的细菌分布较均匀且多样性较高，这两种施肥方案适合改善林地表层土壤细菌群落多样性。13号样地施用了500N、75K、500有机肥及150土壤改良生物菌肥，其40～60 cm土层真菌Chao1值最大，表征其检测到的OUT个数最多；
12号样地施用了250N、750P、25K、150土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土层真菌Shannon值最大且40～60 cm土层真菌Ace值最大，反映了此样地真菌的物种分布较均匀且多样性较高，这2种施肥方案适合改善林地深层土壤真菌群落多样性。因此，今后可考虑这些配方复合菌肥的开发与推广应用，以达到有效地解决杨树林地力衰退问题。
土壤中的溶杆菌属(Lysobacter)不仅在多种植物根际周围具有较好的定殖能力，还能够分泌多种抗生素、生物表面活性物质和胞外水解酶来抑制病菌的生长，控制植物病害的发生[26]。其中，12号样地20～40 cm土层中溶杆菌属(Lysobacter)所占比例最高，为1.69%，说明溶杆菌属(Lysobacter)在此土层中定殖的活性较大。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)凭借自身的高代谢能力、多功能的生理特性、无污染等特点，可在高度贫氧和恶劣条件下生长，能够用于芳香化合物的生物降解，其在环境保护和工业生产方面具有很大的应用潜力[27]。其中，7号样地0～20 cm土层鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)所占比例最高，为2.75%，说明鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在此土层中分布较活跃。
真菌参与土壤中动植物残体的分解，其在植物有机体分解的早期阶段比细菌和放线菌更加活跃[20]。其中，蜡蚧菌属(Lecanicillium)、被孢霉属(Mortierella)及镰刀菌属(Fusarium)3种菌属为真菌优势菌属。蜡蚧菌属(Lecanicillium)真菌寄主范围广泛，即可以寄生蚜虫、蚧、害螨等多种害虫，还能寄生线虫及锈病、白粉病菌等多种植物病原真菌[28]。所以，其是农林业生产中重要的生防真菌之一。14号样地0～20 cm土层蜡蚧菌属(Lecanicillium)所占比例最高，为27.09%，说明其在此土层中分布最多。
通过土壤微生物与土壤环境因子RDA分析表明，脲酶和碱性磷酸酶对细菌菌属群落组成影响较大，而过氧化氢酶对细菌菌属群落组成影响较小。脲酶对真菌菌属群落组成影响较大；
而碱性磷酸酶、pH和速效钾对真菌菌属群落组成影响较小。综上所述，脲酶对土壤细菌及真菌菌属群落组成影响均较大，是杨树林地重要的土壤环境因子。
