纳米银和乙烯利预处理调控伊藤牡丹‘巴茨拉’切花瓶插品质

史国安 王 依,2 史 田,3 高双成 赵 渊 尚申申 胡思源

(1.河南科技大学牡丹学院洛阳市牡丹生物学重点实验室 洛阳 471023；

2.郑州安图生物工程股份有限公司 郑州 450000；

3.洛阳国家牡丹园 洛阳 471011)

伊藤牡丹最初是由日本人伊藤东一通过芍药组(Sect.Paeonia)与牡丹组(Sect.Moutan)远缘杂交选育出的组间类型(Intersecitional peony group，Itoh groups/peonies)(Smith, 2001)。目前，国内外有200多个伊藤牡丹品种，综合性状表现良好且运用到生产中的有50多个品种(孙菊芳等， 2007；

吴国新等， 2011)。‘巴茨拉’伊藤牡丹系列品种，株形优美，长势旺盛，花大色艳，花瓣亮黄，花色奇特，气味芳香，抗逆性强，具有极高的观赏价值，近年来国内大量引种栽培(马翔龙等， 2018)，用于公园露地观赏、小区绿化美化和鲜切花等生产领域。但是，‘巴茨拉’切花吸水开放迅速，快速落瓣(赵丹阳等， 2017)，属于短寿命切花类型(王依等， 2021)。随着对牡丹高品质切花产品需求量的不断增加，需要适宜的采后技术来提高切花的瓶插寿命和品质(Costaetal.， 2020)。

1.1 试验材料

2019年5月2日上午7点，伊藤牡丹切花品种‘巴茨拉’采自河南省洛阳千卉谷农业有限公司。切取长势一致且均处于绽口期(Ⅱ级)的花枝，放置于带有冰袋的泡沫箱中，加以保湿并立即运回河南科技大学洛阳市牡丹生物学重点实验室进行。

1.2 试验处理

花枝基部置于蒸馏水中重新进行水切，并保留长度25cm，2片复叶。随机均分为4组，每组50枝，分别置于蒸馏水(对照，Control)、20 μg·mL-1纳米银(nano silver，NS)、5 μL·mL-1乙烯利(CEPA5)和20 μL·mL-1乙烯利(CEPA20)中预处理1 h，然后蒸馏水单枝瓶插。自瓶插起，于0、3、6、12、24、48、72、84、96、108和120 h观察花枝形态和测定各生理指标，记录花朵开放、花枝变化特征。室内瓶插条件均控制在温度23～25 ℃，相对湿度50%～60%，光照强度为80 μmol·m-2s-1(室内散射光加日光灯补光)，光照周期为12 h/12 h。

1.3 试验方法

1.3.1 花枝形态指标 自瓶插0 h起，记录花朵开放状态，分别记为Ⅱ(绽口期)、Ⅲ(初开期)、Ⅳ(半开期)、Ⅴ(盛开期)、Ⅵ(始衰期)和Ⅶ(落瓣期)；

定时用数显卡尺测量花朵直径，统计花径变化率和最大花径；

分别统计切花瓶插寿命和最佳观赏期(王凯轩等， 2020)。

1.3.2 花枝水分状况 采用称重法(郭闻文等， 2004; 史国安等， 2010)测量花枝吸水量、失水量和花枝鲜样质量，水分平衡值为花枝吸水量与失水量之差。

1.3.3 花瓣MDA和可溶性蛋白质含量 分别用硫代巴比妥酸法和考马斯亮蓝法测定花瓣丙二醛(MDA)和可溶性蛋白质含量(赵世杰等， 2002)。

1.3.4 花瓣乙烯代谢 利用气相色谱仪同步测定花瓣乙烯释放速率和呼吸速率(史国安等， 2011)。花瓣ACC含量、ACS和ACO活性亦采用气相色谱法(王哲等， 2014)。

1.3.5 花瓣能量代谢 花瓣呼吸底物蔗糖、葡萄糖、果糖和甘露糖含量，采用高效液相色谱法测定(史国安等， 2009；

王凯轩等， 2020；

王依等， 2021)。己糖含量为葡萄糖、果糖和甘露糖含量之和。

花瓣腺苷酸(ATP、ADP和AMP)含量，用高效液相色谱法测定(王凯轩等， 2020；

王依等， 2021)。能荷(EC)=([ATP]+0.5[ADP])/(ATP+ADP+AMP)。

花瓣呼吸代谢关键酶琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)、H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性，分别采用北京索莱宝生物科技有限公司(SDH、CCO)和南京建成生物工程研究所(H+-ATPase和Ca2+-ATPase)超微量试剂盒按操作说明进行测定。

1.4 数据处理

使用 Microsoft Office 2016 进行作图分析，IBM SPSS Statistics 20 软件进行差异显著性分析(邓肯氏法，P< 0.05)。

2.1 ‘巴茨拉’切花开放衰老特征与瓶插品质变化

由图1可知，‘巴茨拉’切花瓶插期间，花朵发育等级由Ⅱ级露色期迅速吸水开放，12 h达到初开期，24 h接近Ⅴ级盛开状态，高浓度乙烯利促进花朵开放，其他处理之间差异不显著；

对照和纳米银处理84 h花瓣开始出现轻度失水，纳米银延缓花瓣衰老，而乙烯利处理加速花瓣衰老。20 μL·L-1乙烯利预处理促进花朵衰老的效应显著高于低剂量，表现出明显的剂量效应，瓶插76 h 第1朵花出现落瓣(图2)。花瓣脱落是‘巴茨拉’切花衰老的根本特征。与对照相比，纳米银处理显著延长瓶插寿命和最大花径；

乙烯利处理降低瓶插寿命、最佳观赏期和最大花径，加速花瓣脱落的剂量效应差异显著(表1)。以上结果表明，调控乙烯代谢途径是‘巴茨拉’切花保鲜的重要技术路线。

图1 ‘巴茨拉’切花开放和衰老等级的变化Fig.1 Index change of opening and senescence stages of ‘Bartzella’ cutflower in vaseCK:对照Control;NS:纳米银Nano silver;CEPA5:5 μl·mL-1乙烯利Ethephon；
CEPA20：20 μl·mL-1乙烯利Ethephon。下同。The same below.

2.2 ‘巴茨拉’切花花枝水分状况变化

由图3可知，‘巴茨拉’切花瓶插是快速吸水开放过程，花枝鲜样质量和水分平衡值是反映其水分状况的重要指标。瓶插初期0～12 h花枝吸水开放，瓶插24 h 花朵开放等级接近盛开状态，花枝相对鲜样质量持续升高，对照和乙烯利预处理48 h 达到峰值，纳米银处理72 h达到峰值，而后持续下降。水分平衡值均在12 h达峰值，纳米银推迟花枝水分平衡值达到0 值的时间，而乙烯利则加速达到0值的时间。纳米银预处理显著促进花朵直径增大，乙烯利预处理与对照没有显著差异。以上结果说明，纳米银预处理能够改善切花的水分状况，而乙烯利的生理作用则相反。

图2 ‘巴茨拉’切花出现落瓣时的效果图Fig.2 Effect drawing of initiate petal abscission of ‘Bartzella’ cut flower

图3 切花鲜样质量和水分平衡值的变化Fig.3 Changes of fresh mass and water balance value of cut tree peony flowers during vase periods

2.3 花瓣可溶性蛋白质和MDA含量变化

花瓣可溶性蛋白质和膜脂过氧化产物MDA含量是反映切花衰老变化的重要指标。瓶插过程中花瓣可溶性蛋白质含量，呈现初期迅速升高而后持续下降的趋势，瓶插12 h 可溶性蛋白质含量达到峰值，NS预处理较对照显著升高7.65%(P<0.05)，而CEPA5预处理和CEPA20预处理较对照分别降低7.04%和11.78%(P<0.05)；

瓶插后期84 h，NS预处理较对照显著升高7.23%，CEPA5和CEPA20预处理较对照分别降低7.02%和28.34%。瓶插初期随着花朵开放MDA含量快速升高，而后略有下降再缓慢升高，后期则快速增加，瓶插84 h，NS预处理较对照显著降低11.84%(P<0.05)，而CEPA5和CEPA20预处理较对照分别增加20.30%和39.53%。以上结果说明，纳米银预处理能够延缓‘巴茨拉’切花的衰老进程，而乙烯利则加快花瓣的衰老进程。

图4 花瓣可溶性蛋白质和MDA含量的变化Fig.4 Content changes of soluble protein and MDA in petals of cut tree peony flowers during vase periods

图5 花瓣乙烯释放量、ACC含量、ACS和ACO活性的变化Fig.5 Changes of ethylene production rate, ACC content, ACS and ACO activity of cut tree peony flowers during vase periods

2.4 ‘巴茨拉’切花乙烯代谢的变化

由图5可知，‘巴茨拉’瓶插期间有一个明显的乙烯跃变峰。CK、NS、CEPA5和CEPA20各预处理均在瓶插6 h出现较为明显的乙烯峰值，NS预处理较对照峰值降低26.5%，CEPA5和CEPA20预处理较CK分别升高19.0%和125.5%(P<0.05)，说明‘巴茨拉’切花对外源乙烯极为敏感，NS预处理能够一定程度降低内源乙烯的释放，而外源高浓度CEPA预处理则显著促进内源乙烯的释放。ACC为乙烯合成的直接前体物质，瓶插初期0～12 h ACC含量迅速降低，瓶插12 h NS预处理较对照峰值降低5.95%，CEPA5和CEPA20 预处理分别比对照升高9.68%和14.03%(P<0.05)，而后逐渐恢复呈现明显的V字变化。ACS活性呈现先升高后缓慢下降的变化趋势，瓶插12 h ACS活性达到峰值，瓶插24 h NS预处理较对照降低9.29%(P<0.05)，CEPA5和CEPA20预处理较对照升高10.42%和23.37%。而花瓣中ACO活性在衰老过程中呈快速下降再升高，至峰值后继续下降的变化趋势，瓶插48 h到达最高值，NS预处理较对照降低5.63%，CEPA5和CEPA20预处理较对照升高28.64%和36.31%(P<0.05)。以上结果说明，纳米银预处理能够抑制乙烯的生物合成，乙烯利则加速乙烯合成并且有明显的剂量效应。

2.5 花瓣糖含量和能量状态变化

由图6可知，‘巴茨拉’花瓣中可溶性糖主要测得蔗糖、葡萄糖和果糖，甘露糖含量较少。瓶插0～12 h花瓣内蔗糖含量持续下降出现一个较低值，NS预处理较对照显著升高12.73%(P<0.05)，CEPA5和CEPA20预处理较对照分别降低21.58%和35.27%；

随花朵达到盛开期蔗糖含量升至最高值，之后伴随花朵衰老蔗糖含量逐渐降至较低水平。己糖(葡萄糖、果糖、甘露糖之和)含量在瓶插初期略有下降，随着花朵开花迅速回升之后维持在较高水平，瓶插24 h NS预处理较对照显著升高8.50%，CEPA5和CEPA20预处理较对照分别降低16.54%和28.68%。‘巴茨拉’切花瓶插初期0～24 h 花瓣ATP含量和能荷水平均迅速升高，峰值分别出现在瓶插12 h和24 h，花朵开放后两者均持续下降。以上结果表明，纳米银预处理有利于维持较高的己糖和能荷水平，乙烯利则加速己糖消耗和维持较低的能荷水平。

图6 花瓣糖含量和能量状态变化Fig.6 Changes of sugars content and energy level in petals of cut tree peony flowers during vase periods

2.6 花瓣呼吸代谢关键酶活性变化

SDH、CCO、H+-ATPase和Ca2+-ATPase是线粒体三羧酸循环和呼吸链上，细胞能量合成与转换的4个关键酶。由图7可知，瓶插期间SDH呈现持续下降状态，48 h 后仅CEPA20预处理SDH活性显著低于对照，降幅达24.85%(P<0.05)；

而在96 h 后NS预处理显著高于对照，升幅达132.69%。瓶插期间CCO、H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性呈现初期随着花朵开放而快速升高，其中瓶插6 h 纳米银和乙烯利预处理CCO和H+-ATPas活性比对照有不同程度的升高，均在12 h 出现峰值，NS预处理3个酶活性比对照分别升高9.84%、9.60%和14.44%，CEPA5预处理3个酶活性比对照分别下降14.40%、10.84%和5.08%，CEPA20预处理3个酶活性比对照分别下降24.14%、20.91%和17.42%(P<0.05)。以上结果说明，纳米银和乙烯利预处理能够调控‘巴茨拉’切花瓶插期间能量代谢，两者的生理作用相反。

图7 花瓣SDH、CCO和ATP酶活性的变化Fig.7 Changes of SDH, CCO and ATPase activities in petal of cut tree peony flowers during vase periods

2.7 ‘巴茨拉’切花生理生化指标的主成分分析

将测定的与‘巴茨拉’切花瓶插开放衰老相关的23个重要指标，包括水分基础代谢(花径FD、鲜样质量FM、花径变化率FDR、水分平衡值WB、可溶性蛋白质含量SP、丙二醛含量MDA)，乙烯代谢(乙烯释放速率Eth、1-氨基环丙烷-1-羧酸含量ACC、ACC合成酶活性ACS、ACC氧化酶活性ACO)，能量状态(能荷水平EC、ATP含量、ADP含量和AMP含量)，呼吸基质(蔗糖S、葡萄糖G、果糖F、甘露糖M)，呼吸代谢(琥珀酸脱氢酶活性SDH、细胞色素C氧化酶活性CCO、H+-ATPase活性 HA、Ca2+-ATPase活性 CA和呼吸速率R)进行主成分分析(表2)，以判定各指标在‘巴茨拉’切花开放衰老过程中的贡献大小。

CK组前3个主成分的累计贡献率达85.84%，基本上能够代表‘巴茨拉’切花瓶插期间的代谢状况。第1、第2、第3 主成分的累计贡献率分别为56.95%、74.54%和85.84%。第1 主成分R和SDH得分最高，其次是ACS和SP，这些指标切花花瓣呼吸、乙烯代谢与基础代谢状况的关键指标；

第2 主成分中FM、CCO和ATP得分相对较高，表明它们是水分基础和能量相关代谢的重要指标；

第3 主成分中EC和ACO得分相对较高，是反映糖、能量水平和乙烯代谢的补充指标。经NS预处理后，花瓣内的生理机制发生显著变化，前3个主成分的累计贡献率达86.83%，第1 主成分是R得分最高，其次是ACS和SDH，表明呼吸与乙烯代谢是调控‘巴茨拉’切花衰老的关键指标；

第2 主成分CCO得分较高，其次是FM和WB，表明这些指标是呼吸和水分基础代谢的重要指标；

第3 主成分ACO和EC得分相对较高，表明这些是乙烯代谢和能量水平的补充指标。CEPA5预处理组，前3个主成分的累计贡献率达87.07%，第1 主成分得分最高的是SP、SDH和R，这3个指标是切花花瓣基础和呼吸代谢状况的关键指标；

第2 主成分中CCO、FM和ACS得分相对较高；

第3 主成分中HA、EC和G得分相对较高，表明这些指标是反映了呼吸代谢、能量水平和呼吸基质水平的补充指标。CEPA20预处理组，1～3个主成分的累计贡献率达86.33%，第1 主成分SP、SDH、R和ATP得分最高，是反映水分基础代谢、呼吸代谢和能量水平的关键指标；

第2 主成分FM、ACS和CCO得分相对较高，是反映水分基础代谢、乙烯代谢和呼吸代谢的重要指标；

第3 主成分中EC得分相对较高，其次是HA和CA，是反映能量水平和呼吸代谢的补充指标。通过上述分析，各处理第1主成分中CK和NS预处理，R、SDH和ACS得分均排在前3位；

CEPA5预处理第1主成分中与CK基本一致，而CEPA20预处理，第一主成分则是SP、ATP和SDH。由此说明，‘巴茨拉’切花衰老与水分供应、乙烯代谢、呼吸代谢、基质水平和能量状态密切相关，经不同纳米银和乙烯利预处理其生理生化代谢特征有明显改变，表明通过调控花枝水分状态、乙烯和能量代谢是调控切花开放和衰老进程的重要途径。

表2 ‘巴茨拉’切花瓶插过程中水分状况、乙烯代谢、能量水平与呼吸代谢之间的主成分分析①Tab.2 Principal component analysis of water status,ethylene metabolism,energy level and respirtory metabolism of ‘Bartzella’ cut flowers in vase

3.1 ‘巴茨拉’切花乙烯代谢及其调控效应

3.2 ‘巴茨拉’切花能量代谢及其调控效应

3.3 ‘巴茨拉’切花衰老生理指标的关联性分析

花瓣衰老的关键特征已有诸多研究，如激素调节(Iqbaletal.， 2017; Maetal.， 2018)、脂质过氧化(Songetal.， 2014; Rogers, 2012; Rogeretal.， 2016; 年林可等, 2017；

Costaetal.， 2020)、糖代谢(史国安等, 2009; van Doorn, 2004; Arrometal.， 2012)、程序化细胞死亡(Yamadaetal.， 2007)以及相关基因调控网络(van Doornetal., 2008; Shahrietal., 2014; Gaoetal.， 2016)。乙烯能够显著的调控气孔保卫细胞的开度(Arveetal.， 2015)，加速植物叶片和花瓣失水，导致脂质过氧化水平升高以及能量供应能力的降低(王依等， 2021)，加速切花花瓣的衰老进程(Wuetal.， 2017; Maetal.， 2018)。本研究结果表明，‘巴茨拉’切花开放和衰老过程是一个快速吸水和脂质过氧化过程(图2、图3)。用纳米银和乙烯利预处理‘巴茨拉’切花，对涉及的23个生理生化指标的测定结果进行的主成分分析表明，第一、二主成分均显示呼吸代谢(活性速率、SDH和CCO活性)、能量状态(ATP含量)、乙烯代谢(ACS活性)与水分状况(可溶性蛋白质含量和花枝鲜样质量)是‘巴茨拉’切花紧密关联的关键和重要指标(表2)。因此，伊藤牡丹‘巴茨拉’切花保鲜技术的基础依赖于有效地调控花枝水分供应、乙烯和能量等相关生理生化代谢过程。

3.4 ‘巴茨拉’牡丹切花保鲜技术策略

对于乙烯敏感型切花，确定适宜的采收时期、适时预冷及采后抗乙烯处理是决定保鲜成效的关键环节(Hashemabadi, 2014; Wangetal.， 2014; Arveetal.， 2015;Zhaoetal.， 2018; Costaetal.， 2020;Xueetal.， 2020;史国安等， 2010; 叶迪等， 2021)。抑制乙烯生物合成与信号转导通路能够有效地调节‘巴茨拉’切花开花衰老进程(王依等， 2021)，选择适宜的抗乙烯处理措施是乙烯敏感型切花保鲜技术的基本策略(Scariotaetal.， 2014)，深入研究‘巴茨拉’切花采后衰老及其信号分子应答与调控网络是今后重要的研究方向。

‘巴茨拉’伊藤牡丹切花属于乙烯超敏感类型。乙烯受体抑制剂纳米银能够抑制乙烯生物合成与信号转导，而乙烯释放剂乙烯利能够加速内源乙烯释放，并且有明显的剂量效应，说明内源乙烯是‘巴茨拉’切花致衰的关键因子之一。在采后调控‘巴茨拉’乙烯代谢的基础上，瓶插过程兼顾维持切花花枝较好的水分状况和提高能量供应水平，对完善‘巴茨拉’切花保鲜技术具有重要的理论指导意义。

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