蛋白质互作组学技术及其在植物研究中的应用进展

张文洋，张 胜，易干军，晏石娟

（1.广东省农业科学院农业生物基因研究中心/广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室，广东 广州 510640；
2.康奈尔大学生物技术研究所，美国 伊萨卡 14850；
3.广东省农业科学院，广东 广州 510640）

植物由于其固着的生长方式，一直暴露于自然环境的各种压力中［1］。为了应对这些挑战，植物已经进化出复杂的机制来感知外部胁迫并触发生理、分子和细胞水平的多层次反应［2-3］。构建如此复杂且精细的信号调节网络需要数千种分子的协作，在较早的研究中，人们对核酸、蛋白质、代谢物进行鉴定和量化，试图阐明代谢调控机理［4-5］。然而单纯的丰度变化信息所能提供的证据有限，仅能大致预测各种分子之前的潜在联系，却难以成为它们之间相互关联的直接证据，也无法确认这种关联是直接还是间接的，而且很多分子发挥功能并不需要体现在丰度的改变［6］。分子间的物理相互作用是一切信号转导、代谢调控的基础，蛋白质或代谢物可对外部刺激迅速作出反应，通过与其他代谢物和蛋白的相互作用推动细胞调节过程以维持细胞和生物体的稳态［7］。

过去10 年，受益于样品制备技术的改进和质谱仪、谱图检索算法的更新迭代，基于质谱的组学技术已能胜任对各类生物的代谢物及蛋白质进行全局的定性定量分析。在这些技术的基础上，还不断衍生出多种用于表征分子间相互作用的组学技术。为区别于常规的定量蛋白质组学技术，这类旨在鉴定及量化蛋白质与其他分子之间相互作用的技术被定义为“蛋白质互作组学技术”［8］。根据研究对象，这类技术被分为表征蛋白质-核酸、蛋白质-代谢物、蛋白质-蛋白质相互作用几大类别，每一个类别的技术又根据不同实施原理进行进一步细分。相比于传统的生化方法，蛋白质互作组学技术具有全局性、高通量的优点，已在蛋白质功能研究中扮演重要角色，但在植物系统中的应用具有挑战性，因为植物代谢途径多种多样，很多植物的基因组复杂且注释严重不足［9］，许多互作组学分析方法依赖遗传操作，而这在植物系统中也具有较大难度，特别是在多倍体中。同时，没有一种方法可以评估相互作用的所有特征（定位、互作模式、亲和力和周期等），通常需要组合不同的方法才能更全面地了解感兴趣的代谢物或蛋白质的相互作用情况。尽管存在这些固有的挑战，但全面了解植物复杂性状形成的代谢调控网络不仅是解决现代农业最紧迫问题的先决条件，也为守护粮食安全、应对全球极端气候以及可再生材料和燃料需求提供保障。

本文重点介绍了用于发现和验证蛋白质-代谢物相互作用（Protein-metabolite interaction,PMI）、蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction,PPI）的多种前沿蛋白互作组学技术，分析它们各自的优缺点和适用的相互作用类型，并且介绍了这些技术在植物领域的研究现状及最新进展。

植物是自然界中小分子的“仓库”，目前已发现了超过20 万种不同化学结构的代谢物［10］，次级代谢物在结构上更加多样化，显示出广泛的生物活性［11］。在细胞水平上，代谢物可以作为信使（如配体）或作为代谢组分（如酶的底物、产物、辅因子或调节剂）与蛋白质相互作用，调节几乎所有的细胞过程。了解代谢物生物活性的关键在于发现其蛋白质伴侣，经典的生物化学和遗传学方法一直是研究代谢物功能的常用选择，但受限于过长的实验周期，无法高通量筛选代谢物-蛋白质的相互作用，导致当前对代谢物-蛋白质相互作用的探索仍严重不足，特别是对于植物特有的代谢物，而这些信息对于理解植物稳态和育种研发都非常关键。

近年来，组学技术已在多个分子领域取得巨大成功，越来越多的生化与组学相结合的蛋白质互作组学技术陆续被用于系统识别小分子-蛋白质相互作用，这些方法大多首先被用于药物研发领域，使得相关研究的通量和效率得到跨越性提升，在植物代谢物的功能研究中也逐渐展示出应用潜力。这些方法根据研究内容分为3 类，分别为以代谢物为中心寻找靶标蛋白、以蛋白质为中心寻找互作代谢物以及全局互作组分析。

1.1 以代谢物为中心寻找靶标蛋白

根据实施的原理，以代谢物为中心寻找靶标蛋白的方法可分为化学蛋白质组学（Chemical proteomics）和生物物理蛋白质组学（Biophysical proteomics）两大类别。

化学蛋白质组学方法需要对代谢物进行化学修饰或标记，并将其作为“诱饵”从天然细胞裂解物中对蛋白质进行“诱捕”，随后利用质谱鉴定互作蛋白［12］，由于发展较早，这类技术的应用已非常广泛，且不断得到多方面的改进。最简单的方式是将代谢物固定在固相基质表面进行富集，如利用光反应性水杨酸（SA）类似物4AzSA进行筛选，从拟南芥叶提取物中检测到35 种4AzSA 的互作蛋白，特别是病程相关基因非表达子1（NPR1），结束了关于这种蛋白质功能的长期争论［13］。该技术近期在植物中的另一个应用是鉴定RNA 的小分子降解产物2",3"-环磷酸腺苷（cAMP）与RNA 结合蛋白Rbp47b 之间的相互作用，继而发现这一互作可以促进拟南芥幼苗在暗胁迫和热胁迫下产生应激颗粒［14］。

虽然使用广泛且方便，但固定造成的空间位阻和药效团阻塞可能在一定程度上干扰代谢物与靶标蛋白间的相互作用。针对这一限制，基于活性的蛋白质分析（ABPP）用生物素或荧光标签修饰天然产物，以便其与蛋白质充分接触，从而更好地反映生理条件下的代谢物-靶标结合。双环乙内酰脲作为紫丁香素合成中的副产物引起人们关注，用生物素将其标记后，利用亲和纯化结合质谱技术鉴定出甘油醛3-磷酸脱氢酶GAPC1和GAPC2 是双环乙内酰脲的靶标［15］。BRI1 是植物中一种定位于质膜的富亮氨酸重复类受体蛋白激酶，是油菜素内酯受体复合物的关键成分，Kinoshita 等使用生物素标记的油菜素甾酮（BPCS，活性油菜素内酯），提供了活性油菜素内酯与BRI1 直接结合的第一个证据，并确定了最小结合域的序列［16］。

某些较大体积的生物素通常不能渗透膜，也会对内源性生物素化蛋白质产生假阳性结果，因此采用炔烃或叠氮化物标签代替生物素，在小分子上引入用于点击化学的生物正交基团，能尽可能保持天然产物的理化性质，并允许其进入细胞与靶蛋白进行原位结合。这种方法常用于医学研究，在植物科学也出现了使用小型标记的E-64和乙烯基砜探针的案例，通过标记拟南芥叶、幼苗或细胞培养物来证明该方法的稳健性和多功能性，可检测和鉴定以前通过体外标记未检测到的靶标［17］。

一些天然产物通过非共价键（如氢键、离子键和疏水相互作用）与其蛋白质靶标相互作用。点击化学探针并不适合这类小分子，因为活性分子和靶蛋白之间的非共价结合会在点击反应和富集过程中被破坏。光亲和力标记（Photo-affinity labeling,PAL）适合研究这类非共价结合的相互作用，为避免小分子和靶标蛋白之间的结合被破坏，光亲和探针可在特定波长的光下共价结合目标蛋白质，随后对靶标进行富集。例如，在探究控制合欢叶感夜运动的茉莉酸糖苷靶标中，三功能探针由感兴趣的小分子茉莉酸糖苷、作为反应功能的二苯甲酮和作为富集功能的生物素组成，探针在365 nm 照射下被激活，经链霉亲和素富集后，成功发现了一种膜蛋白是参与 茉莉酸糖苷控制感夜性的靶蛋白［18］。

对天然产物进行化学修饰难免影响其理化性质，且有些天然产物缺乏合适的修饰位点。因此，近年来涌现出一系列不对天然产物作任何修饰的生物物理蛋白质组学技术，它们利用靶标蛋白与天然产物结合后的理化性质变化来鉴定各类小分子的 互作靶标蛋白。其中，药物亲和反应目标稳定性（Drug affinity responsive target stability,DARTS）和有限蛋白水解质谱（Limited proteolysis-coupled mass spectrometry,LiP-MS）技术，利用蛋白与小分子结合后形成不易被蛋白酶水解的稳定构象，来鉴定天然产物的蛋白质靶标，还能提供结合的界面信息［19-20］。蛋白质氧化速率稳定性分析（Stability of proteins from rates of oxidation,SPROX）利用甲硫氨酸残基的氧化速率差异来显示蛋白质折叠或解折叠的热力学特性，鉴定与小分子相互作用的靶标蛋白，还能量化其结合亲和力［21］。上述两类方法有相似优势，但要求在结合区域有特异性酶切位点或甲硫氨酸残基，而细胞热位移分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）利用靶蛋白与配体结合后的热稳定性提升，能从完整细胞、细胞裂解物中识别药物结合靶标［22］，这项技术随后与等压质量标签定量技术（Tandem mass tag,TMT）结合而成的热蛋白质组学技术（Thermal proteome profiling,TPP），能同时描绘出数千种蛋白质的熔解曲线，用于体外、原位或体内鉴定配体与靶标蛋白的结合及其蛋白的互作［23］。

DARTS/LiP-MS、SPROX 和CETSA/TPP 等生物物理蛋白质组学技术自建立后得到持续改进和完善，已广泛应用于动物细胞和微生物研究，但直到近几年才被陆续用于植物领域，包括用DARTS 验证药物endosidin2 与拟南芥外囊复合物亚基EXO70 之间的相互作用［24］，验证药物endosidin4 与拟南芥ADP-核糖基化因子鸟嘌呤核苷酸交换因子（ARF-GEFs）之间的关联［25］，还有用TPP 技术对拟南芥Mg-ATP 相互作用组进行热蛋白质组学表征以鉴定靶标蛋白［26］。虽然实例较少，但从原理而言，以上3 类技术均能胜任植物细胞研究工作，由于植物细胞与动物细胞的结构和组分存在差异，这些技术还需要经过针对性的优化及改进，但它们无以伦比的高通量、无需对小分子标记的优势已经显示出广泛应用前景。

1.2 以蛋白质为中心寻找互作代谢物

在以蛋白质为中心的互作组学方法中，感兴趣的蛋白被用作“诱饵”来识别与它们相互作用的代谢物。串联亲和纯化（Tandem affinity purification,TAP）是第一种在体内实施的用于系统鉴定代谢物-蛋白质相互作用的方法，它将感兴趣的蛋白与生物素标签在体内融合表达，以便从天然裂解液中纯化代谢物-目标蛋白复合物，随后将结合的代谢物洗脱并使用质谱平台进行分析［27］。TAP 与基于LC-MS/MS 的代谢组学和蛋白质组学相结合，被成功用于鉴定拟南芥中与核苷二磷酸激酶（NDPK）相互作用的多种蛋白质和小分子伴侣，包括一些极性代谢物［28］。类似的策略还被用于系统筛选与START 结构域蛋白相关的内源性小分子，该技术促进了两种尚未确定功能的START 结构域相关蛋白质配体的发现［29］。

虽然TAP 方法的准确性较高，但由于涉及在植物体内表达融合蛋白导致通量很低。另一种技术——天然质谱法（Native MS）无需在植物体内表达融合蛋白，便可以检测与目标蛋白质结合的配体，从复杂的化合物库中筛选蛋白底物。其原理大致为将目标蛋白与天然粗提物一起孵育，随后进行快速凝胶过滤以纯化蛋白质-代谢物复合物，在天然质谱分析时，利用一级质谱（MS1）选取完整的蛋白质-配体复合物，通过多级碰撞诱导解离（MSn）对配体进行释放、片段化和分析，将谱图与代谢组数据库比对以实现鉴定。由于多个配体在同一位点竞争结合靶标，因此更容易发现具有最高亲和力或浓度的化合物，这一原理表明天然MS 不但能用于胞内PMI 的分析，还能从众多植物天然产物中高通量地筛选先导化合物，此外，天然MS 还可以提供相互作用的组成、化学计量、热力学和动力学常数等重要信息［30］。Nguyen 等［31］从来自红洋葱皮、红三叶草、欧芹、桉树叶和橙皮的数千种天然产物粗提物中筛选出碳酸酐酶（CA）同工酶的14 种小分子结合物，它们大部分属于黄酮类化合物，其中有12 种曾被报道为一种CA 同工酶的抑制剂，还鉴定了一种新的CA 同工酶配体Ambocin。在蛋白与配体结合前对混合天然产物进行液相分离有助于降低天然产物库的复杂度，而在实际应用中，由于UHPLC 流动相的酸性条件和高有机溶剂含量，不利于蛋白质与配体的非共价结合，是天然MS 应用的一大瓶颈。Daniel Petras 团队近期对这一方法进行了改进，首先通过低pH、高有机溶剂含量的液相条件对混合的天然化合物库进行分离，随后增加柱后流动相的pH、值和水含量，并在ESI 源前注入待测结合蛋白，结合并行的非靶向代谢组学分析，可以对这些结合的天然代谢物进行鉴定，他们利用这一技术从海洋蓝藻群落中鉴定糜蛋白酶的天然抑制剂，实现了一个高效蛋白酶抑制剂家族的靶向分离和结构阐析，并将该抑制剂家族命名为Rivulariapeptolides［32］。

1.3 全局互作组分析（Global analysis of all proteinmetabolite interactions,PROMIS）

上述两类方法仅限于围绕某个指定的感兴趣小分子或蛋白质为中心展开分析，因此不适用于对相互作用组进行全局范畴的研究。针对这一限制，Ewelina 等提出一种名为PROMIS（Proteinmetabolite interactions using size separation）的新策略，用于拟南芥的互作组学分析发现了多种新的相互作用，且得到AP-MS（Affinity purification mass spectrometry）的验证［33］。PROMIS 方法旨在对天然裂解物内的蛋白质-蛋白质和蛋白质-代谢物复合物进行全局分析，且无需对任何小分子或蛋白质进行修饰，其原理大致为：将蛋白质-蛋白质和蛋白质-小分子复合物通过尺寸排阻色谱法进行分馏，对各馏分分别进行代谢组学和蛋白质组学定性定量分析，以色谱共流出作为依据来推定相互作用关系。但“共流出”仅是存在相互作用的线索而非证据，通常每种代谢物会与数百种蛋白质共流出，而实际上可能只与其中一种蛋白真正地结合，因此PROMIS 应被视为一种发现工具，用于绘制相互作用组图，但还必须结合正交方法来定义复合物的确切组成。这与基因表达研究类似，多个PROMIS 数据集的整合具有更高的可信度，如将尺寸过滤与离子交换色谱相结合，首先根据尺寸排阻色谱法分离蛋白质-代谢物复合物，取得一组PROMIS 数据集，随后将感兴趣代谢物所在的馏分经离子交换进行进一步分离，取得正交的PROMIS 数据集，二者组合可用于蛋白质配体的高可信度鉴定。

蛋白质很少单独发挥作用，而是与其他蛋白质组成复合物或相互作用来发挥大部分生物学功能［34］。一般来说，PPI 大致可以分为两种类型，即构成型和调节型［35］。构成型PPI 非常牢固，主要形成永久性复合物的亚基，很容易通过体内和体外的方法检测。而调节型PPI 作为生化级联反应的一部分，仅发生在特定的细胞或环境状态下，通常对调节刺激非常敏感，在大多数情况下是弱和短暂的，对这类相互作用的研究更具挑战性［36］。

2.1 亲和纯化质谱（Affinity purification mass spectrometry,AP-MS）

AP-MS 是一种快速、选择性和灵敏的工具，用于检测近生理条件下感兴趣的蛋白（诱饵）和相互作用伙伴（猎物）之间的相互作用［37］。与免疫沉淀（IP）相似，AP-MS 可以使用抗体靶向诱饵蛋白，从而在天然条件下从细胞裂解物中捕获蛋白质复合物。然而，靶向植物蛋白的抗体有限，还存在屏蔽诱饵蛋白相互作用位点的风险，因此，基于亲和力的AP-MS 技术将诱饵蛋白与亲和标签融合，利用亲和富集的方法将诱饵与其相互作用的复合物一起纯化，洗涤除去非特异性结合的蛋白，蛋白质复合物被洗脱进行LC-MS/MS分析［38］。最初的AP-MS 采用单步纯化法，导致大量与固相支持物、亲和试剂或表位标签相互作用的假阳性猎物蛋白被鉴定，为提高准确性，需要大量统计测试和阳性对照［39-40］。针对这一问题，最新的串联亲和纯化质谱（TAP-MS）技术利用2个不同的表位标签与诱饵蛋白融合，通过在接近生理条件的两步亲和纯化以更大限度地去除假阳性蛋白［37］。

AP-MS 可用于研究相关生物环境中的植物特定器官的生长发育，如花、叶和根，提供蛋白质复合物组成信息［41-43］，此外，AP-MS 可以深入了解由翻译后修饰所调节的空间或时间依赖性相互作用［44］。一种用于拟南芥植物细胞培养系统的 TAP 技术可以在较低样品量下对蛋白质复合物进行高通量鉴定［37］。也有TAP 技术将黄色荧光标签与链霉亲和素结合肽标签相结合，除能鉴定蛋白复合物外，还可以确定蛋白在体内的亚细胞定位，扩大了双亲和标签的用途［45］。TAP-MS可助力植物激素信号转导的研究工作，如鉴定茉莉酸途径中的NINJA 及RING E3 连接酶的相关蛋白［46-47］、油菜素类固醇信号传导的转录因子BZR1 的相关蛋白［48］、生长素转运调节磷酸酶2A 的相关蛋白ROTUNDA3 等［49］。最近的工作将AP-MS 与非标（Label-free）定量蛋白质组学相结合，以解析拟南芥中独脚金内酯途径的动态性质，证明该方法以时间分辨率表征蛋白质伙伴交换的潜力［50］。

2.2 邻近标记法（Proximity labeling mass spectrometry,PL-MS）

植物信号通路中各组分之间的调节型PPI 往往是瞬时和动态的［51］。了解这些瞬时和动态PPI是研究植物信号网络的主要挑战之一。Co-IP 和AP-MS 需要在细胞裂解后捕获PPI，这会导致一些瞬时的、弱的相互作用被破坏，另外，在全细胞裂解液中，一些处于不同亚细胞区室的蛋白会产生生理条件下不存在的相互作用，从而产生假阳性结果［52］，导致经典PPI 技术在植物胁迫响应系统研究中的进一步应用受到很大阻碍。

适用于体内PPI 分析的邻近标记技术（PLMS）已成为一种新的替代方法，可以克服上述问题并保留有关相互作用的空间信息［52］。例如，在邻近依赖性生物素标记（BioID）中，诱饵蛋白与非特异性生物素连接酶（如BirA）在胞内融合表达，这种酶可以在10 nm 半径内对接近诱饵（相互作用）的蛋白质进行共价生物素化修饰，由于该反应仅发生在活细胞中，故排除了在细胞裂解后发生的生理条件下不存在的相互作用，生物素化的互作蛋白可被链霉亲和素富集，以便免疫印迹或质谱鉴定［52］。

PL-MS 已在哺乳动物细胞和微生物的PPI 研究中有大量应用案例，但在植物中的应用较为滞后。主要难点在于邻近标记使用的大多数酶最适温度为37 ℃，而这一温度不利于大部分植物的生长［53］。另一方面，虽然植物细胞能合成生物素，但其丰度不足以进行酶促的生物素化标记，因此生物素连接酶蛋白表达水平、外源生物素浓度和孵育时间等都需要优化，第1 种在植物中建立的PL-MS 技术基于BioID，被应用于水稻原生质体，鉴定与植物营养生长有关的转录因子OsFD2 的相互作用蛋白和邻近蛋白［54］，以及控制籽粒大小的GS3 蛋白的互作蛋白［55］。Zhang等用新一代TurboID 识别植物免疫受体N 的相互作用子，发现一种新的泛素蛋白连接酶E3 的组件N-Recognin 7 充当调节剂，它直接与免疫受体N 相互作用，介导免疫受体导对植物病原体的免疫［56］。类似技术还被应用于识别气孔特异性转录因子FAMA 的伙伴，并帮助获得拟南芥幼苗幼小保卫细胞的核蛋白质组，为未来开展空间分辨相互作用组学研究提供关键的技术框架［57］。迄今，PL-MS 已成功应用于水稻、番茄、烟草和拟南芥细胞悬浮培养物的多个相互作用蛋白质组研究，还能有效捕获膜相关蛋白的相互作用［58］。

2.3 交联质谱法（Cross-linking mass spectrometry,XL-MS）

由于AP-MS 和PL-MS 都需要将感兴趣的蛋白与标签或酶进行融合表达，导致分析通量受限，这意味着要想实现对蛋白质组范围PPI 网络的剖析，需要对大量诱饵蛋白进行迭代标记，工作量非常繁重。为了在全细胞范围表征PPI，新兴技术交联质谱（XL-MS）显示了广阔的应用前景，该方法利用小分子交联剂将相互作用蛋白质的近端氨基酸（～30 Å）进行共价连接，使得质谱能同时鉴定相互作用的蛋白质和交联位点［59］。XL-MS 代表一种在全局层面定义PPI 拓扑网络的高通量方法，其结果除用于PPI 映射外，获取的接触位点信息还可用于验证和微调现有蛋白质复合物的结构信息［60］。从问世至今，XL-MS 在多个方面得到增强。首先是MS 可裂解交联剂及不断革新的演算法［61-62］，允许使用多级MS（MSn）有效选择交联肽对，以便通过MS3可靠识别每个交联肽，快速准确鉴定交联肽，使其能够应用在组学级别的PPI 映射中，且更有利于阐明蛋白质复合物的结构；
其次是具有富集能力的交联剂显著提高了复杂混合物中低丰度交联肽的可检测性［63］，具有膜通透性的交联剂使得XL-MS 被成功应用于获得活体细胞中PPI 全局景观［64］以及超高效交联剂［65］等。目前最先进的交联剂Azide-A-DSBSO 和Alkyne-A-DSBSO 兼具膜渗透性、可富集性和MS 可裂解性，均带有一个小生物正交反应基团，允许以“点击化学”进行生物素缀合以富集交联肽；
还具有两个对称的含亚砜的MS 可裂解键，可实现稳健的交联分离和鉴定；
此外，通过去除生物素手柄、加入酸可裂解位点，提高了交联恢复和识别，这种方法可用于在体内外对任何生物体和样品开展蛋白质组范围的PPI研究［64］。另外，XL-MS 技术可以与基于TMT 的标记技术或无标记方法进行定量交联分析，用于探测PPI 在不同生理条件下或时程中的变化。

虽然XL-MS 已广泛应用于哺乳动物系统，但其在植物中的应用因细胞壁的存在而受到一定限制，近年来随着交联剂种类的增多，植物活体XL-MS 研究成为可能，如高渗透性、酸可裂解的叠氮标签修饰二琥珀酰亚胺庚二酸酯（AMDSP）实现了拟南芥植物XL-MS 定量蛋白质组分析，识别出354 种独特的交联肽［66］。最近有研究将体外交联与磷酸蛋白质组学分析相结合，以在空间上解析拟南芥TOR 途径的244 种底物，这种XL-MS 与PTM 的结合分析将为绘制植物系统基本信号网络提供新的强大工具［67］。

蛋白质-代谢物相互作用（PMI）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的发现和表征为研究特定代谢物、蛋白质的生物活性提供了非常有价值的信息，有助于我们深入了解生命活动的调节过程。组学技术和质谱仪的应用先后建立了多种表征不同类型相互作用的技术，它们在植物研究领域也展现出极大的应用潜力，本文对这些蛋白质互作组学分析技术的原理和优缺点作了介绍。在实际应用中，研究人员可根据实验需求选择适宜的分析技术，有以下几个因素可供参考：首先是考虑相互作用的类型，有较稳固的结合，也有弱的、瞬态的相互作用，研究者可根据所研究的互作类型选择合适的方法；
其次，除对相互作用伙伴进行鉴定外，相互作用的其他特征（时空信息、互作模式、结合序列、亲和力等）对功能研究也同样很重要，也应根据这些信息需求选择适宜的分析方法；
最后，有些研究有预先确定的感兴趣代谢物或蛋白质，有些研究旨在绘制全局性的相互作用网络，研究者需要在鉴定的准确性、通量和规模之间做出取舍。

对于未来的植物蛋白质互作组学研究的发展，一些关键技术瓶颈仍有待克服：一是鉴于各类植物组织的异质性，应重视样品制备程序，如合适的缓冲液、pH 水平、表面活性剂、辅因子、处理条件等，以确保蛋白质质量和正确构象；
二是目前的活性提取方法均较为温和，大多数膜结合蛋白被排除在外，应尽可能多地纳入膜结合蛋白，这能增加相互作用组的覆盖范围和深度；
三是迄今为止，大多数非模式植物的数据库尚未建立或注释严重不足，应积极共享各类植物的蛋白质及代谢物数据库；
四是在多种植物体系建立融合蛋白表达技术体系，这在很多相互作用分析技术中都是重要环节；
五是生物体内验证和功能评估对于排除假阳性互作至关重要，但相关实验较为繁琐和低通量，是随着效率提升的一大瓶颈。

相信在不久的将来，蛋白质互作组学技术准确性、效率、通量的提升，将极大地增加PMI、PPI 的鉴定数目，越来越多地应用于植物研究中，推动新型信号转导及代谢调控通路的解析、新型除草剂或杀虫剂研发、分子设计育种等基础研究的开展。

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