HPLC法测定3-硝基苄叉基乙酰乙酸乙酯中的有关物质
时间：2023-06-09 14:50:13 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
刘云峰，李 正，孙 晨
(江苏吉贝尔药业股份有限公司，江苏 镇江 212009)
尼群地平为二氢吡啶类药物，化学名为2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1,4-二氢-3,5-吡啶二甲酸甲酯乙酯，为钙通道阻滞剂，临床上主治原发性高血压、继发性高血压及冠心病[1]。其合成路线为两步合成反应，起始原料以间硝基苯甲醛与乙酰乙酸乙酯进行Knoevenagel缩合反应得到3-硝基苄叉基乙酰乙酸乙酯(即尼群地平中间体产物A，简称尼A，下同)，尼A再与β-氨基巴豆酸甲酯进行分子内环合反应得到尼群地平产品[2]。尼A的质量好坏直接关系到最终产品的纯度，尼A在合成过程中可能会引入起始物料间硝基苯甲醛杂质及产生少量的尼A异构体，为控制尼群地平中间体尼A的质量，我们参考相关文献[3-5]，采用HPLC法控制尼A的有关物质，获得了较理想的效果。
1.1 仪器
Waters e2695型高效液相色谱仪，2998PDA检测器；
Agilent 1220型高效液相色谱仪一体机；
Sartorius SQP Quintix型电子天平。
1.2 试药
间硝基苯甲醛对照品，批号：PCL_#_Ni070，含量99.91%，PCL公司；
尼A，批号：20170701，20170702，20170703，江苏吉贝尔股份有限公司生产；
尼A异构体，批号：20170601，江苏吉贝尔股份有限公司生产；
乙腈，批号：JA048930，色谱纯，Merck公司；
四氢呋喃，批号：17020365，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。
2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；
流动相：乙腈-四氢呋喃-水(20:24:56)；
流速：1.0 mL·min-1；
检测波长：271 nm；
柱温：30℃。
2.2 系统适用性试验
2.2.1 间硝基苯甲醛定位溶液的配制
精密称取间硝基苯甲醛对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成10 μg·mL-1的溶液。
2.2.2 尼A异构体定位溶液的配制
精密称取尼A异构体适量，加乙腈溶解并稀释制成10 μg·mL-1的溶液。
2.2.3 尼A定位溶液的配制
精密称取尼A适量，加乙腈溶解并稀释制成10 μg·mL-1的溶液。
2.2.4 系统适用性溶液的配制
精密称取尼A约10 mg至100 mL容量瓶内，分别加入间硝基苯甲醛、尼A异构体定位溶液5、10 mL，加乙腈适量，超声使溶解，用乙腈定容至刻度，摇匀，即得。
2.2.5 色谱图
在2.1项下色谱条件，采用PDA检测器，分别量取空白溶剂、各已知物质定位溶液、系统适用性溶液各20 μL，注入液相色谱仪。结果显示，尼A与可能存在的杂质在波长271 nm附近处有最大吸收，理论塔板数以尼A峰计为11239，尼A与间硝基苯甲醛的分离度为9.8，尼A与尼A异构体的分离度为8.1，尼A与间硝基苯甲醛及尼A异构体均能完全分离，且尼A的峰纯度很好，其他杂质无干扰，色谱图见图1～3。
图1 空白溶剂
图2 系统适用性溶液 出峰顺序依次为间硝基苯甲醛、尼A、尼A异构体
图3 尼A样品溶液
2.3 强制降解试验
将尼A分别进行了酸、碱、氧化、强光破坏试验，取强制降解后的样品适量，加乙腈溶解并稀释制成100μg·mL-1的溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液于2.1项下色谱条件中测定。结果显示，尼A在酸、碱、氧化、强光条件下，都不同程度地发生了降解，其中以强光造成的破坏力最强，酸、碱条件亦能破坏产生新的未知单杂，氧化破坏力最弱，各降解产物均能与尼A达到良好分离，色谱图见图4～7。
图4 酸破坏样品
图6 氧化破坏样品
图7 强光破坏样品
2.4 线性
尼A、尼A异构体、间硝基苯甲醛在10μg·mL-1～200μg·mL-1范围内的线性方程分别为A=117734.8C+1036.15；
A=106299.95C-1250.95；
A=38182.13C-974.13；
相关系数(R2)分别为0.9998、0.9999、0.9999。尼A异构体、间硝基苯甲醛相对于尼A的校正因子分别为1.1、3.1。
2.5 检测限和定量限
将线性中10 μg·mL-1的溶液继续用乙腈稀释，依法进样，按信噪比S/N=3计算，尼A、尼A异构体、间硝基苯甲醛的检测限分别为0.6、0.6、1.0 ng；
按信噪比S/N=10计算，尼A、尼A异构体、间硝基苯甲醛的定量限分别为2、2、2 ng。
2.6 精密度试验
两人平行配制尼A样品溶液和1%自身对照溶液，每人分别配制6份，分别进行重复性试验与中间精密度试验。重复性试验中，6份样品总杂平均含量均低于1.0%，6份样品总杂含量的RSD为1.63%；
中间精密度试验中，6份样品总杂平均含量均低于1.0%，6份样品总杂含量的RSD为1.75%。经过两组试验考察，尼A有关物质检测方法精密度良好。
2.7 准确度
准确度在杂质限度溶液浓度的80%、100%、120%三个水平考察，每个浓度平行配制3份供试品溶液。间硝基苯甲醛回收率在95.83%～99.16%之间；
尼A异构体回收率在99.67%～104.23%之间。间硝基苯甲醛、尼A异构体的9个回收率数据的RSD分别为1.53%、1.76%。
2.8 溶液的稳定性试验
配制尼A样品溶液和1%自身对照溶液，在室温下分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，考察各时间点杂质的增长情况。在12 h内，1%自身对照溶液主峰面积RSD为0.91%，因此1%自身对照溶液在12 h内是稳定的。供试品溶液中，尼A在12 h内异构体的峰面积在缓缓增长，通过计算，表明供试品溶液在避光条件8 h内是基本稳定的，超过8 h后样品应另行现配，更能如实反映尼群地平中间体的品质与质量。
2.9 耐用性
配制系统适用性溶液，通过适当改变柱温、流速、有机相比例、色谱柱品牌来评估，发现尼A有关物质检测方法耐用性良好，适当小范围改动参数后，出峰时间虽有变化，但尼A与间硝基苯甲醛及尼A异构体分离度依旧很好，能达到完全分离，方法耐用性良好。
2.10 样品测定
按2.1项下色谱条件，对三批尼A进行了检测，结果见表1。
表1 尼A有关物质测定结果
结论：三批尼A样品中，检测出少量的尼A异构体，未检出间硝基苯甲醛，单杂均小于规定限度1.0%，总杂均小于规定限度2.0%，符合要求。
本次试验参考中华人民共和国药典2015 年版( 二部)尼群地平有关物质检测方法进行试验。试验过程中，发现样品配制稀释液若含有水，会导致样品水解，不利于检测，所以在试验中稍作改变，将乙腈作为本次试验的稀释液，并取得了理想效果。强制降解过程中，发现样品易受光照影响，所以样品配制及检测均需避光操作。通过溶液的稳定性试验发现，样品最好在配制完成后8小时内进样，在今后生产过程中完全可以做到对中间体实时监控。采用高效液相色谱法测定尼A的有关物质，实验方法准确，可靠，专属性强，可用于尼群地平中间体产物的质量控制。
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