数据挖掘联合网络药理学探索莫文教授中药治疗颈椎病用药规律及机制
时间：2023-06-08 19:05:11 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
姜彬，张亚运，方仪德，许金海，叶洁，莫文
1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032；
2.同济大学附属杨浦医院，上海 200090
颈椎病是指由于颈椎区域脊柱结构退化，累及周围结构(神经、血管等)，并出现与影像学改变相符的临床表现的疾病[1-2]。在中医古籍中虽未记载此病名，但中医理论和临床对于本病已积累了丰富的经验。该病在中医学中可归为“项痹”。《素问·逆调论》曰：“肾不生则髓不能满”[3]。《灵枢·五癃津液别》中曰：“五谷之精液，和合而为膏者……补益脑髓”[4]；
古代医家认为本病与督脉、肾、脾关系密切。龙华医院骨伤科主任莫文教授是石氏伤科第五代传人，师从国医大师施杞教授，继承其“从痹论治颈椎病”的学术观点，临床上长期坚持使用中医药辨证论治颈椎病，并进行一系列临床研究[5-6]。本文收集了莫文教授门诊中治疗颈椎病患的中药处方，通过数据挖掘的方式探索颈椎病的遣方用药规律，总结学术思想，对筛选出的核心药对“黄芪-川芎-甘草”进行网络药理学分析，探索其治疗颈椎病的通路及机制。
1.1 一般资料 病例资料来源于2020 年1 月至2021年6月上海中医药大学附属龙华医院莫文教授特需、专家门诊的病例记录。通过回顾医院门诊病例系统记录，共计收集到符合颈椎病相关诊断的中药处方108例[7]。
1.2 纳入标准 (1)收集病例诊断符合颈椎病的分型、诊断及非手术治疗专家共识(2018)；
(2)病例中患者处方用药完整；
(3)接受中药治疗后患者症状都较前有明显改善。
1.3 排除标准 (1)合并心、脑、肾等其他严重原发疾病患者[8]；
(2)数据收集不准确者。
1.4 数据库建立与核对 由双人分别进行相关病例筛选，将符合要求的病例录入Excel2016 软件的表格，建立数据库。若纳入的为同一患者的多次就诊病例，不同诊次使用处方药物不同，则记为多个处方纳入。为防止录入过程中产生的误差，录入完毕后两人分别检查是否存在处方重复、错字或缺漏，减少对最终结果的影响[7]。
1.5 相关信息的规范化 方剂组成药物及其加减药物均予统计，中成药所含中药不明者不纳入统计；
中药名及其功能分类、归经分类标准参照《中华人民共和国药典》[9]进行校正，功能分类参照《中药学》[10]。
1.6 研究方法 利用TCMSP数据库查询“川芎、黄芪、甘草”药对中药活性化合物及对应的靶点信息，通过Cytoscape3.8.0软件构建成分-靶点网络图。再以“Vertebral artery type cerbical spondylosis、Nerve Root Cervical Spondylopathy、Cervical spondylotic myelopathy、Mixed cervical spondylosis”为关键词检索，采用GeneCards（http://www.genecards.org/)、OMIM 数据库（https://www.omim.org/)收集颈椎病相关的靶点，之后通过在线平台和STRING 数据库进行“药物—疾病靶点”韦恩图和PPI网络的构建与分析，最终将潜在靶点代入Metascape数据库进行KEGG通路和GO富集分析。
1.7 统计学方法 运用Excel2016软件计算方药的频数、频率；
运用SPSS25.0 软件对数据库中的高频药物采用Q 型聚类方法进行聚类分析；
运用SPSS Modeler 18.0软件中的Apriori算法和网络对高频药物进行关联规则分析。
2.1 患者一般资料 本研究共纳入108 例患者，男性46例，女性62例，平均年龄(68.55±9.67)岁。其中神经根型颈椎病32 例，脊髓型颈椎病45例，混合型颈椎病31例。
2.2 用药频数及频次统计 根据统计，治疗颈椎病的中药共计149味，累计出现频次1 961次。其中频率大于1%的药物共计34 味，其中频数最高的药物是炙甘草(95 次)，但莫文教授认为炙甘草为常规配伍用药，对疾病没有针对性，故在排除甘草的基础上，频数最高的是川芎(83次)，其次是黄芪(83次)、白芍(74次)、桂枝(66 次)、柴胡(64 次)、葛根(60 次)、当归(59 次)、大枣(56次)，见表1。
表1 颈椎病常用中药频数、频率表(频数＞1%)
2.3 药物功效 药物类别中占比最重是补虚药(28 味)，尤以补气药及补血药为重，由此可见，补气养血是治疗颈椎病的基本治法，在此基础上可配合清热解表、活血化瘀、祛风利湿等治法，见表2。
表2 颈椎病常用中药功用类别表(降序排列)
2.4 药物的四气、五味、归经情况 温类和热类药物在总数中占比最多，共计65味，其次是寒类和平类药物，可见，莫文教授用药总体是以温热为主，但用药时注重阴阳平衡，会适量加入寒凉药物，且注重使用平类药物固护脾胃(图1)。五味中以辛味(69 味)及苦味(74 味)药物为主，《脏气法时论》曰“辛散、酸收、甘缓、苦坚、咸耎”[3]217，辛味与苦味合用，具有“辛开苦降”的特点，可调节患者气机，如《六微旨大论》所言：“非升降，则无以生长化收藏，是以升降出入，无气不有”[3]568，调畅气机是中医治疗的重要思想。排第三的甘味药(61 味)，除了本身可以缓解颈椎病患者疼痛症状，也体现出《素问·阴阳应象大论》“辛甘发散为阳”[3]56的用药原则。药物归经方面，以肝经(74 味)和脾经(65 味)为主，肝主筋，脾主肌肉，肝脾同治，符合石氏伤科“筋骨并调”的理论思想。
图1 药物的性、味、归经分布雷达图
2.5 高频药物聚类分析 将Excel中收集的中药数据后，使用数据透视表汇总，然后转换为SPSS25.0软件可识别矩阵。对出现频率＞1.00%的32 味高频中药进行系统聚类分析，聚类方法选则组间联接、度量标准区间选Pearson 相关性，将度设为24，可聚为3 类(图2)：第1 类包括熟地、砂仁、桑枝、地龙、乌梢蛇、川芎、黄芪、白芍、当归、炙甘草、香附、白术、瓦楞子，为补阳还五汤与圣愈汤加减，适用于气虚血瘀的患者，扶正祛邪，补气化瘀；
圣愈汤中加入香附、桑枝和乌梢蛇，可增强其理气活血通络之力。第2类包含秦艽、五灵脂、葛根、蔓荆子、桂枝、麻黄、大枣、干姜、鲜地黄；
小药对中，秦艽与五灵脂都可止痹痛，葛根与蔓荆子皆为轻扬升发之品，可升阳举陷[11]，引药上行；
麻黄、桂枝配伍温通经脉，干姜、大枣调和营卫，诸药合用，可温经散寒、升阳止痛。第2 类药物为葛根汤与身痛逐瘀汤加减，适用于气滞血瘀兼有风寒的患者。第3 类包括荷叶、升麻、天麻、姜半夏、陈皮、茯苓、莪术、柴胡、黄芩、太子参、半夏、牡蛎。柴胡、黄芩、太子参、半夏，构成小柴胡汤，用以和解少阳，升麻、荷叶皆可引经上行、清利头目，配合天麻可息风止眩，陈皮、姜半夏、茯苓燥湿化痰；
诸药并用，可疏解少阳、化痰息风。第3 类药物为小柴胡汤、清震汤、二陈汤加减，适用于伴有眩晕的患者[12]，莫文教授所用清震汤以葛根、升麻、天麻、荷叶为主方，更兼平抑肝阳。
图2 药物聚类树状图
2.6 高频药物关联规则分析 由于炙甘草在处方当中出现频率高，在处方中无特殊作用，故在删除炙甘草的基础上对出现频率＞1.00%的高频中药进行关联规则分析。设置支持度为40%、置信度为80%，将药物组合按照支持度降序排列，16 条核心药物组合见表3。设置弱链接上限15，强链接下限30，对关联规则进行可视化，构建出18 味核心中药组成的中药网络图(图3)。本次研究中，两味药组合中支持度最高(65.87%)的是川芎与黄芪组合，其后是白芍和桂枝与川芎或黄芪的组合，还涉及葛根、当归。川芎为活血化瘀药，黄芪为补气药，两者组合，符合石氏伤科“以气为主、以血为先”的思想。此外大部分为引经药，川芎属太阳、少阳，葛根属阳明、桂枝因其自然特征可引药至四肢，这可以体现伤科疾病重视引经药的特点。再加黄芪、当归补气养血，但最终都需要健脾补虚。三味药的组合可归结于炙甘草、川芎、黄芪、白芍四种药，可见此为莫文教授治疗颈椎病的核心。
表3 药物关联规则表(按支持度降序排列)
图3 核心药物关联规则网络图
2.7 核心药物模式“川芎、黄芪、甘草”治疗颈椎病的作用机制
2.7.1 川芎、黄芪、甘草活性成分及靶点筛选 采用OB≥30%和DL≥0.18 的标准在TCMSP 数据库中进行活性成分筛选，得到119种活性成分。119种化合物在TCMSP 数据库中预测得到潜在靶蛋白4 116 个，并使用Uniprot数据库转换为基因名称，删除重复后最终获得339 个潜在靶基因。通过Cytoscape3.8.0 软件构建成分-靶点网络图，见图4。根据网络Degree值结果，位居前三的成分依次为槲皮素(Quercetin)、山柰酚(kaempferol)、芒柄花素(formononetin)。
图4 核心药物核心成分-靶点网络图
2.7.2 颈椎病疾病相关靶点 采用GeneCardsOMIM数据库收集颈椎病相关的靶点1 921个。将获取的药物靶点与颈椎病差异表达基因进行匹配映射，并利用在线平台绘制韦恩图，见图5。得到药物-疾病共同靶点50 个。将交集基因输入至STRING数据库，得到PPI 网络图，得到相关蛋白质的结构和功能与基因之间的相互作用关系，见图6。
图5 药物-疾病靶点韦恩图
图6 蛋白质互作网络图
2.7.3 KEGG 通路富集分析 将50 个潜在靶点代入Metascape 数据库进行通路富集分析，设置P＜0.01，得到353 个信号通路，主要涉及IL-17 等信号通路，根据LogP排名靠前的16个信号通路，见图7。
图7 KEGG热图
2.7.4 核心药物治疗颈椎病靶点功能通路富集分析 将50个潜在靶点代入Metascape数据库进行靶点功能通路富集分析，GO富集结果分别从BP(biological process，生物过程)、CC (cellular component，细胞组分)和MF(molecular function，分子功能)三个方面进行生物学过程分析，设置P＜0.01，BP主要涉及apoptotic signaling pathway 等；
CC 主 要 涉 及 membrane raft等；
MF主要涉及kinase binding等，见图8。
颈椎病是颈椎间盘或椎间关节退变性疾病，在国内发病率为10%～20%[13]。根据临床症状及相应影像表现的不同，颈椎病可分为神经根型、脊髓型、颈型和其他型颈椎病[14]。大部分颈椎病无需手术，通过保守治疗即可改善患者症状，而中医药治疗方式以其疗效显著、副作用小而受到关注。莫文教授长期致力于研究中医药辨证论治脊柱退行性疾病，提出了“气血为纲，脏腑为本，法宗调衡，中西结合”的观点。这在本研究中得到充分体现。莫文教授用药的特点是处方常为经方之间的组合，很少纯粹以药对叠加。莫师认为，先贤留世处方往往匠心独运，配伍得宜，或急治其标，或缓图其本，须抽丝剥茧，体会个中意。临诊辨证清楚，就能如臂使指，思过半矣。在此基础上再增减药物以突出某一方面的功效，方能收效颇丰[15]。莫师组方时还善用引经药。伤科疾病往往部位明确，故引经药运用十分广泛。如细辛通督脉，故可治疗脊柱疾病；
羌活祛上身风湿，独活祛下身风湿等。本次聚类分析，第一类队列中圣愈汤及补阳还五汤中加用桑枝，为上行引经药；
第二类药物队列中加用蔓荆子；
第三类药物中则含有升麻、荷叶等升提清阳的药物，足见引经药在颈椎病治疗中的重要。然而，患者常表现为一侧上肢麻木疼痛，却未有明确可分人身左右之引经药。张锡纯在《医学衷中参西录》曾提及，病在左者宜用鹿茸、鹿角或鹿角胶作引；
病在右者宜用虎骨或虎骨胶作引[11]，这一点有待进一步研究。最后，临床中骨伤科患者常会伴随焦虑或抑郁情绪，莫师善从少阳及厥阴二经辨证论治颈椎病。《伤寒论》曰：“少阳之为病，口苦，咽干，目眩也”，颈椎病患者常伴有头晕目眩、口干口苦等表现，此时可用小柴胡汤为底。还有患者常见身热汗出，心烦不眠，又兼手足冷，脉沉，这与厥阴病“脉微，手足厥冷，烦躁”相符，证见寒热错杂，此时可用乌梅丸为底，寒热并用，辛开苦降[16]。
颈椎间盘慢性炎症是颈椎病发病的主要原因，巨噬细胞/小胶质细胞通过释放TNF、IF-1、IL-6、IL-10和IFN等参与到继发的脊髓病理炎症反应，炎症反应对脊髓损伤早期有修复作用，但在后期阻碍了神经生长[17]。
本研究发现的核心药物发挥治疗颈椎病作用的成分可能为槲皮素、芒柄花素、山奈酚。槲皮素、芒柄花素都属于黄酮类药物，研究显示黄酮类成分具有较强的抗氧化活性和抗炎作用[18]，可以改善血液循环及抑制炎性物质渗出[19]；
王业杨等[20]通过给予大鼠脊髓损伤模型术后每日槲皮素注射治疗发现槲皮素可抑制TLR4/NF-κB 介导的炎症反应和细胞凋亡从而减轻脊髓损伤，而山奈酚抑制炎症细胞因子IL-6、IL-1β的表达。
富集分析发现核心中药主要通过调控IL-17通路影响颈椎病，研究显示IL-17 通路过度表达可加速炎症因子分泌及中性粒细胞聚集，激活炎症反应，参与到脊髓损伤后炎症反应[21]。而中药单体如姜黄素、川芎嗪等可调控炎症因子，降低炎症反应严重程度，促进脊髓损伤的修复[22]。
BP 分析发现，核心中药治疗颈椎病涉及细胞凋亡过程。中药中如人参皂苷Rg1、芍药苷可以抑制脊髓神经元细胞凋亡，对受损的脊髓细胞起到保护作用[23]。川芎嗪则可以抑制血管内皮凋亡，从而改善受压脊髓局部的微循环，增加血供[24]。
CC 分析发现，核心药物主要影响颈椎病的膜筏部分。膜筏是细胞膜上一种非均一性富集固醇和鞘脂的高动态小型域[25]。研究显示，在脊髓损伤后，一些阻断轴突再生或促进细胞死亡的受体被定位在膜筏中，通过在膜筏中聚集不利的蛋白质，阻碍脊髓损伤后的运动恢复[26]。
MF 分析发现，核心药物治疗颈椎病与其调节激酶结合有关。徐同虓等[27]研究证明，氨酸激酶结合蛋白可介导小胶质细胞，抑制其过度活化，从而抑制炎症反应，起到保护神经的作用。
综上所述，核心药物可以通过抑制细胞凋亡、减少神经炎症反应、膜筏、激酶结合等过程发挥作用[28]，这为之后的基础研究提供了理论依据。
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