基于多重生物信息学预测非酒精性脂肪性肝病与缺血性脑卒中共病的潜在机制

王 维，赵晓东，魏明清，雷华斌，温 豆，薛旭升*

（1.北京中医药大学孙思邈医院，陕西 铜川 727031；
2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在非酒精性或其他特殊肝损伤因素下的一种以肝细胞内脂质沉积过多和肝细胞脂肪变性为特征的疾病，作为目前全球肝病中最常见的类型，其患病率约为25%～45%，并且正在迅速增加，预计在未来5年内将成为肝硬化以及肝细胞癌的首要病因［1］。研究［2］表明NAFLD不仅是心血管疾病的危险因素，还可能对缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）的发生、发展产生重要影响。IS是指因大脑供血不足而导致局部脑缺血、缺氧性坏死，并伴有相应神经功能缺损的临床综合征。全球范围内，IS作为继缺血性心脏病之后的第3大常见死因，严重危及中老年人的健康［3］。NAFLD不仅与IS风险增加独立相关，同时也可能对IS患者病情及预后产生不良影响［4］。因此积极探索NAFLD与IS共病的潜在机制以及推动两者共病诊疗进展是当今研究的热点和重点。

目前有关NAFLD与IS共病机制的研究相对较少，目前未见利用生物信息学探究其共病机制的相关报道。因此，本研究基于多重生物信息学分析的整体思路，拟利用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）等多种生物信息学技术，从基因、微小RNA（microRNA，miRNA）、转录因子（Transcription factors，TF）、信号转导通路以及相关药物等多角度系统性地对NAFLD与IS共病的潜在机制展开分析与探讨，以期为NAFLD与IS共病的相关基础以及临床研究提供借鉴，并为疾病的预防与诊疗提供有益的理论参考。

1.1 数据获取与处理

从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中分别下载NAFLD与IS的基因芯片数据集。NAFLD数据纳入标准：①样本应至少包含3组，分别为健康对照、单纯性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝病；
②样本来源于人体肝组织；
③芯片数据为基因表达谱；
IS数据纳入标准：①样本应至少包含2组，分别为健康对照和IS；
②样本来源于人体外周血；
③芯片数据为基因表达谱。研究选取的NAFLD数据集为GSE126848和GSE63067，共有NAFLD样本42例，健康对照样本21例；
选取的IS数据集包括GSE16561和GSE22255，共有IS样本59例，健康对照样本44例。通过Bioconductor平台中的affy数据包对NAFLD、IS各自的原始数据集进行背景校准、归一化以及基因表达值log2转换的预处理，同时在NAFLD与IS各自组内当多个探针对应一个共同基因时，取平均值作为其表达值。另外运用SVA数据包消除NAFLD与IS各自组内数据集之间的批次效应和其他非必要变异。

1.2 加权基因共表达网络构建以及相关模块筛选

WGCNA是一种分析多个样本基因表达特征的方法，它可以通过相似基因表达特征对基因进行聚类并形成模块，并可分析模块与样本特征之间的关系［5］。本研究将分别对NAFLD与IS各自数据集展开以下分析：①将各自综合数据集中样本间变异超过25%的基因导入WGCNA数据包；
②为保证构建网结果可靠，剔除异常样本；
③通过使用pick-Soft-Threshold函数的共表达相似性计算软阈值以及邻接矩阵；
④将邻接矩阵转化为拓扑重叠矩阵；
⑤通过层次聚类和动态树切割功能检测模块，并将具有相似表达谱的基因聚类到基因模块中；
⑥对于与NAFLD、IS各自临床特征最相关的模块，计算模块隶属度（module membership，MM）和基因显著性（Gene Significance，GS），并将模块中基因保留用于后续分析。

1.3 共病基因的筛选以及富集分析

将NAFLD和IS两种疾病中与自身临床特征最相关模块内的基因取交集，筛选出两者之间潜在共病基因，并对其富集分析。基因本体（gene ontology，GO）功能富集包括以下3项独立类别：生物过程（biological process，BP），细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）；
京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）是用于搜索与已筛选基因相关的通路。使用可视化和集成发现数据库（Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery，DAVID）在线工具，对筛选的共病基因进行GO功能注释和KEGG途径分析，每个项目的基因数≥5并且P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

1.4 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建以及关键共病基因初步筛选

将共病基因上传至STRING（the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING）数据库，以“highest confidence”（＞0.4）作为最低相互作用阈值，并在隐藏断开节点后构建PPI网络。应用网络拓扑分析插件CytoNCA筛选出中间中心性、紧密性中心性、度中心性、特征向量中心性、基于局部平均连通性的方法、网络中心性、子网络中心性、信息中心性均大于中位值的基因初步作为NAFLD与IS之间的关键共病基因。

1.5 miRNA-TF-mRNA调控网络构建

运用mirTarBase、Starbase和Targetscan数据库对初步筛选的NAFLD与IS关键共病基因进行相关miRNA预测，为提升预测结果的可靠性，对以上3大数据库各自预测的miRNA取交集，筛选出共同miRNA作为关键共病基因的相关miRNA。利用Enrichr数据库预测关键共病基因的相关TF，并以P＜0.05作为标准进行筛选。根据以上所获信息，运用Cytoscape软件构建关键共病基因的miRNA-TF-mRNA调控网络，通过分析网络以进一步筛选出NAFLD与IS共病的关键生物学分子。

1.6 药物预测

基于NAFLD与IS之间潜在共病基因，运用Enrichr数据库中的药物特征数据库（DSigDB）识别与潜在共病基因相关的药物分子，筛选条件为P＜0.05，并按照P值由小到大的顺序选取前10位药物作为预测结果进行分析与筛选。

2.1 加权基因共表达网络构建以及相关模块筛选

研究将两种疾病中各自基因按方差从大到小排序，选取方差前25%数量基因进行分析（NAFLD含有4 006个，IS含有4 002个）；
应用flashClust工具包分别对NAFLD与IS数据进行聚类分析，在NAFLD中阈值设为120，检测并删除3个异常值样本，在IS中阈值设为50，检测并删除1个异常值样本；
此外，使用WGCNA包中的“pick-Soft-Threshold”功能筛选软阈值（NAFLD为3，图1A；
IS为7，图1E），并在两种疾病中将阈值设置为0.25以合并集群树中的相似模块，最终获得WGCNA模式图（图1B，1F），并获取两种疾病各自临床特征最相关模块：与NAFLD临床特征相关性最高的模块为图1C所示青绿色模块，共包含2 119个基因，r=0.53，P=1e-05；
与IS临床特征相关性最高的模块为图1G所示黑色模块，共包含566个基因，r=-0.48，P=4e-07。对两种疾病各自相关性最高模块中的基因进行MM和GS相关性分析显示，二者MM和GS之间存在显著正相关性（NAFLD的青绿色模块为相关系数为0.78，P＜1e-200（图1D）；
IS的黑色模块为相关系数=0.68，P=4.8e-78（图1H）。

图1 NAFLD与IS加权基因共表达网络构建及相关模块筛选

2.2 共病基因的筛选以及富集分析

研究对NAFLD和IS临床特征相关性最高的基因取交集，共获得NAFLD与IS之间的潜在共病基因86个（图2A）。GO功能富集显示NAFLD和IS潜在共病基因主要参与包括炎症反应、固有免疫反应、适应性免疫反应等生物学过程，细胞外空间、质膜外侧等细胞组成以及细胞因子活性、受体结合分子功能（图2B）。KEGG通路富集分析NAFLD与IS潜在共病基因主要通过细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子信号通路发挥作用（图2C）。

图2 NAFLD与IS共病基因的筛选以及相关功能注释与富集分析

2.3 PPI网络构建以及关键共病基因初步筛选

用Cytoscape3.8.0软件对NAFLD与IS共病基因的PPI网络进行可视化处理，结果显示NAFLD与IS共病基因的PPI网络中共有43个节点和75条边，如图3所示。使用CytoNCA插件通过对PPI网络进行8种中心性分析后筛选关键共病基因，本研究初步筛得13个潜在关键共病基因：B、T淋巴细胞弱化因 子（B and T lymphocytes attenuators，BTLA）、CC族趋化因子受体7（CC chemokine receptor 7，CCR7）、POU2级同源框关联因 子1（POU Class 2 Homeobox Associating Factor 1，POU2AF1）等（图3中黄色椭圆节点）。

图3 NAFLD与IS共病基因的PPI网络

2.4 miRNA-TF-mRNA调控网络构建

mirTarBase、Starbase和Targetscan数 据 库预 测的NAFLD与IS关键共病基因的相关miRNA分别为118个、206个和4 452个，对上述miRNA做交集后获得19个miRNA（图4A），NAFLD、IS关键共病基因的19个相关miRNA与NAFLD、IS关键共病基因自身的mRNA的对应关系（表1）。此外，运用Enrichr数据库预测得到的关键共病基因相关TF共有2个，TF与mRNA的对应关系（表2）。根据NAFLD与IS关键基因及其相关的miRNA与TF信息构建miRNA-TF-mRNA调 控网 络（图4B）。可见 在miRNA-TF-mRNA调控 网 络中has-miR-335-5p与转录因子核受体亚家族1H组成员3（Nuclear Receptor Subfamily 1 Group H Member 3，NR1H3）各调控多个关键共病基因的mRNA，另外分别受多个miRNA调控的关键共病基因有BTLA、CCR7和POU2AF1。通过以上分析，可见NAFLD与IS共病的关键生物学分子主要有作为关键基因的BTLA、CCR7、POU2AF1，作 为 关 键miRNA的hsa-miR-335-5p以及作为关键TF的NR1H3。

表1 miRNA-TF-mRNA调控网络中mRNA与miRNA的对应关系

表2 miRNA-TF-mRNA调控网络中TF与mRNA的对应关系

图4 NAFLD与IS关键共病基因的相关miRNA筛选以及相关miRNA-TF-mRNA调控网络构建

2.5 药物预测

基于研究筛选所得NAFLD和IS的潜在共病基因，研究利用DSigDB数据库对靶向NAFLD和IS潜在共病基因的药物进行了分析，结果如表3所示，维生素D3、阿托伐他汀可能作为针对NAFLD与IS共病的主要治疗药物。

表3 NAFLD与IS共病的药物预测

与既往关于疾病共病机制的生物信息学研究相比，本研究主要具有以下几点优势：首先，本研究利用R语言多项数据包对数据进行了严格的背景校准、归一化、消除批次效应以及剔除异常值等规范化处理，尽可能地保证了研究结果的可靠性；
其次，本研究主要围绕WGCNA分析疾病相关模块基因以展开后续分析。WGCNA的主要优点在于既可识别高度相关基因并将其聚类为基因模块，同时所得模块还可显示与临床特征的相关系数以供后续分析［6］；
此外，本研究联合多类生物学分子从多重生物信息学的角度对共病机制进行分析，以求更加全面、深入地探索NAFLD与IS共病的潜在机制。

通过WGCNA分析获得与NAFLD、IS临床特征最相关的模块，据此进一步筛选出NAFLD与IS共病基因并开展富集分析。研究［7］显示NAFLD在炎症反应方面的主要发病机制为胰岛素抵抗可致肝细胞内三酰甘油蓄积过多致使肝脏发生炎症反应并造成肝脏受损；
NAFLD患者由于肝细胞蓄积脂肪过多可引起线粒体功能受损，引起内质网通透性改变并引发一系列生化反应，导致炎性因子大量产生进而加重肝脏受损；
肠道菌群紊乱会导致肠道屏障受损，微生物及其促炎产物将通过肠肝循环进入肝脏，导致肝细胞发生炎症坏死等病理学变化。炎症反应同样贯穿IS的整个发病过程，IS发生初期时缺血区域将有大量细胞发生坏死，受到激活的小胶质细胞将释放大量炎症因子以及炎症介质，并因此造成神经元损伤；
IS再灌注后，外周中性粒细胞以及炎症因子等将进入缺血区域并释放大量炎症介质，促使炎症级联反应加速发展［8］。此外，由炎性介质激活的有害物质将对血脑屏障造成损害，引起炎症介质等穿越并进一步损害脑细胞［9］。炎症反应在NAFLD与IS共病中的影响可能极其复杂，目前研究［4］表明NAFLD产生的全身性炎症可能改变血管张力并促进斑块形成，进一步造成内皮功能受损，并最终影响IS的发生与发展。

NAFLD和IS均与固有免疫反应以及适应性免疫反应关系密切，短时间内的固有免疫反应往往是组织修复的必备条件，若其过度激活则将导致机体受损。在NAFLD中，固有免疫反应被认为是引发及加重NAFLD炎症的关键因素，相关免疫细胞可通过其模式识别受体识别损伤相关分子模式以及病原体相关分子模式，进而启动信号级联反应损伤肝脏［10］。肝脏的适应性免疫应答主要由T细胞与B细胞介导，研究［11］指出T细胞中的Th22和Treg细胞可减缓NAFLD病情进展，而Tc细胞却可能促进肝脏脂肪变性进程，并且Th17和Tc细胞都可能加速肝损伤以及肝纤维化，另一方面B细胞可能通过适应性免疫机制促使肝脏炎症与纤维化发生。IS引发的固有免疫反应过程与其炎症反应相似，主要为由小胶质细胞的过度激活及其引发的一系列有害反应，不同的是在固有免疫反应中星形胶质细胞会分泌神经营养因子来保护受伤部位［12］。主要由T细胞与B细胞参与的适应性免疫反应需在IS发生后较长时间才可发挥作用，多种辅助性T细胞可能造成严重脑损伤以及不良预后，然而有研究通过动物实验发现B细胞可能是IS的保护因素［13］。此外，细胞因子和细胞粘附分子都是免疫系统的重要组成成分，而免疫系统通常介导炎症反应，NAFLD与IS共病中的炎症、免疫反应常需细胞因子以及细胞粘附因子参与［14］。

本研究对NAFLD与IS共病机制相关的关键生物学分子进行了筛选，BTLA可在大多数淋巴细胞中检测到，主要通过抑制T细胞和B细胞增殖、活化来诱导免疫抑制［15］，NAFLD和IS的适应性免疫反应均主要由B细胞和T细胞介导，BP分析中BTLA也富集在适应性免疫条目内，因此推测BTLA可能通过适应性免疫在NAFLD与IS共病机制中发挥关键作用。另外有国外学者［16］在斑马鱼实验中发现敲除BTLA基因会显著促进肝脏炎症，又有研究［17］通过小鼠实验发现BTLA的诱导激活可能抑制脑内炎症反应。CCR7存在于树突状细胞以及T细胞与B细胞，具有诱导细胞迁移的作用，研究［18］证明在使用药物降低CCR7的mRNA表达与蛋白水平后，NAFLD动物模型的肝脏炎症得到了遏制。另外相关分析［19］表明CCR7在IS患者血清中表达显著上调，可能对病情变化产生重要影响。POU2AF1是一种B细胞特异性转录激活蛋白，研究发现POU2AF1过表达可促进间充质干细胞脂肪生成，并推断其可能成为抑制脂肪生成与蓄积的新靶点［20］。NAFLD与IS的发病机制与脂肪代谢异常密切相关，可见POU2AF1在NAFLD与IS共病机制中可能具有重要地位。

国内学者通过监测NAFLD外泌体miRNA的表达，发现hsa-miR-335-5p在NAFLD患者血清外泌体中显著上调，并可能成为NAFLD的生物标志物［21］。另外有研究［19］指出hsa-miR-335可能是重要的神经调控因子，其异常表达可能引起神经系统疾病，并指出hsa-miR-335-5p的发现可能有助于IS的早期诊断以及治疗靶点开发，此外该研究发现CCR7可能作为hsa-miR-335-5p的预测靶点，此与本研究结果相符。作为核受体转录因子超家族成员，NR1H3不仅在肝脏主要表达，同时在大脑中也有表达，其可通过调节靶基因的转录而广泛参与炎症反应、免疫反应以及脂类代谢等生理或病理学过程［22］，因此推测NR1H3可能是NAFLD与IS共病机制中的关键TF。此外，调控网络中NR1H3的靶基因V-Set Pre-B细胞替代轻链3（v-set pre-B cell surrogate Light Chain 3，VPREB3）、淋巴毒素β（lymphotoxin beta，LTB）以及B细胞受体CD22主要在淋巴细胞中表达，另一靶基因髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）则主要在中性粒细胞中表达，结合淋巴细胞以及中性粒细胞特性推测NR1H3在NAFLD与IS共病机制中的作用可能以调节炎症反应或免疫反应为主［23］。

结合文献对药物预测结果进行分析验证后发现除维生素D3与阿托伐他汀外，其余化合物均未显现出与NAFLD以及IS明显相关的治疗作用。有研究［24］通过临床随机对照试验发现口服补充维生素D3可显著改善NAFLD患者的代谢及炎症等相关指标，并推测潜在机制可能与维生素D可减少各类炎症细胞因子有关，同时建议将补充维生素D作为针对NAFLD患者的辅助治疗。另外有研究［25］发现通过肌注维生素D3可有效地改善NAFLD患者的纤维化评分以及相关生化指标，并且发现维生素D缺乏可能与NAFLD发病风险之间存在显著相关性。一项横断面研究［26］发现较低水平的血清维生素D3与IS发病呈正相关，并推测维生素D3可能通过诱导抗氧化反应以及抑制炎性细胞因子发挥重要神经保护作用。国内学者研究［27］发现阿托伐他汀可能通过降脂以及调节炎症、免疫反应等机制显著改善NAFLD患者肝脂肪变，并且显现出较好的安全性。在IS方面，研究［28］发现大剂量阿托伐他汀可能通过调脂、抗炎以及减小斑块面积而保护急性IS患者的神经功能，且安全性较高。

综上所述，本研究基于多重生物信息学对NAFLD与IS共病机制以及相关药物进行分析，通过分析得出NAFLD与IS共病机制主要涉及炎症反应与免疫反应两大方面，同时根据miRNA-TF-mRNA调控网络筛选出了NAFLD与IS共病的关键生物学分子-BTLA、CCR7、POU2AF1、hsa-miR-335-5p以及NR1H3等，并对发病机理进一步展开分析与探讨。此外，本研究经过筛选与分析，发现维生素D3与阿托伐他汀两种药物对于治疗NAFLD与IS共病很可能具有广阔的应用前景。

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