不同传染性法氏囊病病毒株感染对CCL19-CCR7轴系表达量的影响
时间：2023-06-08 11:10:13 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
王秋霞，张 新，楚富茗，王明明，王 芳，卢 浪，魏小兵，余 燕，张艳红，马金友，姜金庆，欧长波，刘兴友,2
(1. 河南科技学院动物科技学院，河南 新乡 453003 ；
2. 新乡学院生命科学与基础医学学院，河南 新乡 453003)
传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)是禽类传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)的病原体，主要攻击禽类的中枢免疫器官——法氏囊，从而引起育成鸡的病理损伤和免疫抑制，若同时混合其他病原感染，往往会引起鸡只的大批死亡，给养禽业带来严重的经济损失。
有研究显示，在IBDV感染过程中，法氏囊组织受到攻击，导致前B淋巴细胞凋亡[1-2]，大量的外源T细胞迁移至法氏囊[3]，浸润法氏囊的T细胞活化后，释放Th1细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)，可刺激巨噬细胞进一步产生促炎细胞因子，如白细胞介素IL-6、IL-1β和趋化因子CXCLi2等[4]，在IBDV感染后的炎症过程、病毒清除和法氏囊损伤发展以及恢复过程中发挥了重要作用，也造成了周围组织的病理损伤[5-7]。高通量测序结果显示，IBDV CJ801株感染早期，部分趋化因子及其受体的表达量明显上调，其中以趋化因子CCL19的表达量变化最为明显[8]。
T细胞趋化至法氏囊发挥T细胞免疫应答受宿主基因型和毒株毒力的影响，有研究显示，宿主基因型和毒株毒力能够影响IBDV感染后产生的病变程度、细胞浸润状态、细胞因子表达水平及信号通路的激活[4,9]。但是，不同毒株感染对趋化因子表达量的影响是否存在差异尚不清楚，为了进一步了解不同毒力毒株感染后对CCL19及其受体基因表达水平的影响，本试验选取IBDV经典毒株CJ801株和新乡本地分离毒株HN-1株进行攻毒试验，比较分析CCL19及其受体CCR7基因表达情况，以期为后续的研究提供数据支撑。
1.1 材料
1.1.1 病毒 IBDV CJ801株，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所刘爵研究员馈赠；
IBDV HN-1株，由本实验室自新乡本地病禽体内分离获得。
1.1.2 试验动物 SPF种蛋，购自北京梅里亚维通利华实验动物技术有限公司，孵化后于隔离器中饲养，21日龄进行攻毒试验。
1.1.3 试剂 总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒，均购自Omega公司；
M-MLV反转录酶，购自Promega公司；
Real Master Mix (SYBR Green I)，购自Invitrogen公司；
其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 动物攻毒试验 将53只SPF鸡随机分成3个组，分别为HN-1感染组、CJ801感染组和对照组，感染组每组20只，对照组13只。分别通过点眼、滴鼻的方式感染，按103EID50/0.1 mL的剂量，给予感染组每只鸡0.2 mL IBDV病毒液，对照组每只鸡以同样方式给予0.2 mL PBS。不同组鸡只分别饲养在不同的隔离器中，自由饮水、进食，光照、黑夜各12 h。在病毒感染后第1、3、5天和第7天，每组随机挑选3只鸡，麻醉致死，收集法氏囊备用。
1.2.2 RNA提取与反转录 分别取感染组和对照组鸡的法氏囊组织，经液氮研磨后，按照试剂盒说明书提取总RNA后进行反转录，合成cDNA。
1.2.3 引物设计与合成 根据GenBank上已登录IBDVVP2、禽源CCL19和CCR7基因序列，分别设计1对引物，同时针对β-actin基因设计1对引物作为内参，进行荧光定量PCR(qPCR)检测。所设计引物见表1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
1.2.4VP2基因PCR扩增 以反转录合成的cDNA为模板，使用VP2基因的引物进行PCR扩增。反应程序：95 ℃预变性1 min；
95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30个循环；
72 ℃延伸10 min。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外照射下观察条带并拍照。
1.2.5 序列比对分析 PCR扩增呈阳性的HN-1株IBDVVP2片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，利用DNASTAR 5.0软件，将测序结果与GenBank中登录的不同毒力IBDV毒株(表2)的VP2基因序列进行比对，通过MEGA软件做进化分析。
1.2.6 qPCR检测 qPCR使用SYBR Green Master Mix试剂盒，在7500 Real-time PCR仪中进行。qPCR程序：95 ℃ 1 min；
95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40个循环；
72 ℃ 10 min。qPCR以β-actin为内参基因。所有样品重复3次确保扩增重复性。使用2-ΔΔCt方法对基因表达水平进行相对含量计算。
1.2.7 数据处理与分析 执行t检验分析，利用 Graphpad Prism 7.0 软件对处理数据生成图片和分析，将对照组基因表达水平设置为1，评价感染组目的基因表达水平。结果记为“平均值±标准误”，P<0. 05 表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0. 05 表示差异不显著。
表2 比对和进化分析所用参考序列Table 2 Reference strains used in the sequence alignment and phylogenetic analysis
2.1 动物攻毒试验 感染组SPF鸡攻毒后自第1天开始便出现精神沉郁症状，随着时间的推移，CJ801感染组和HN-1感染组鸡只均出现羽毛蓬乱、腹泻等症状。2个感染组剖检症状无明显差异，均可见胸肌、腿肌的明显出血，法氏囊呈明显的“紫葡萄”状(图1)；
但与CJ801感染组相比，HN-1感染组鸡只死亡时间稍延后，感染后期可见胸腺严重萎缩。对照组无明显临床症状，剖检未见明显病理变化。攻毒试验结果表明，感染组SPF鸡成功感染IBDV。
图1 IBDV攻毒SPF鸡引起的病理变化Fig.1 Macroscopic lesions in SPF chicken after inoculation with IBDVA: 感染组鸡法氏囊；
B: 对照组鸡法氏囊；
C:感染组腿肌和胸肌；
D:对照组腿肌和胸肌A: Bursal tissues from infection group SPF chicken; B: Bursal tissues from control group SPF chicken; C: Leg muscles and chest muscles from infection group SPF chicken; D: Leg muscles and chest muscles from control group SPF chicken
2.2VP2基因PCR扩增 为了进一步证实攻毒试验成功，分别取感染组和对照组鸡只法氏囊样品，提取总RNA，以反转录合成的cDNA为模板，对IBDV的VP2基因进行PCR扩增。凝胶电泳结果如图2所示，无论是CJ801感染组还是HN-1感染组，扩增产物条带大小均与预期大小一致，对照组未见明显条带。
图2 VP2片段的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of VP2 geneM:DL2 000 Marker；
1:对照组；
2:CJ801感染组；
3:HN-1感染组M:DL2 000 Marker; 1:Control group; 2:CJ801 infection group; 3:HN-1 infection group
2.3 序列比对分析 扩增的VP2片段测序后经BLAST分析，与GenBank上登录的IBDVVP2基因序列一致，进一步证实本次感染成功。为进一步了解本地分离株HN-1的进化关系及其与CJ801株之间的遗传距离，使用测得的HN-1VP2基因序列与GenBank上登录的不同毒力IBDV毒株VP2基因序列进行比对，利用MEGA软件构建进化树，结果显示，HN-1株VP2基因序列与UK661、Harbin-1、OKYM、D6948等超强毒株VP2基因序列高度同源，而与CJ801株的VP2基因序列不在同一个小分支上(图3)。
图3 CJ801株和HN-1株IBDV VP2序列进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of VP2 nucleotide sequences from IBDV CJ801 strain and HN-1 strain●：本试验毒株●：Strains in this study
2.4 感染早期法氏囊组织中CCL19基因表达 分别取感染组和对照组鸡法氏囊组织，液氮研磨后提取总RNA，反转录后进行qPCR扩增，检测IBDV不同毒株对鸡T细胞趋化因子CCL19基因表达量的影响。结果如图4和图5所示，尽管CJ801株感染鸡CCL19基因的表达要早于HN-1株，达到最高峰的时间也早于HN-1株，但感染后，无论是CJ801组，还是HN-1组，CCL19基因的表达水平均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。
图4 CJ801株IBDV感染SPF鸡后法氏囊组织中CCL19 mRNA的表达Fig.4 Chicken bursal CCL19 mRNA expression levels after infection with IBDV CJ801 strain与对照组相比，*：P<0.05,**：P<0.01；
下图同Compared with the control group,*：P<0.05,**：P<0.01. The same as below
图5 HN-1株IBDV感染SPF鸡后法氏囊组织中CCL19 mRNA的表达Fig.5 Chicken bursal CCL19 mRNA expression levels after infection with IBDV HN-1 strain
2.5 感染早期法氏囊组织中CCR7基因表达CCR7基因的qPCR检测结果与CCL19基因呈一致的趋势(图6、图7)。感染早期，CCR7基因的表达量明显升高，HN-1株感染鸡CCR7基因的表达和达到高峰的时间均晚于CJ801株。但感染后，2个感染组CCR7的mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.01)。
图6 CJ801株IBDV感染SPF鸡后法氏囊组织中CCR 7 mRNA的表达Fig.6 Chicken bursal CCR 7 mRNA expression levels after infection with IBDV CJ801 strain
图7 HN-1株IBDV感染SPF鸡后法氏囊组织中CCR 7 mRNA的表达Fig.7 Chicken bursal CCR 7 mRNA expression levels after infection with IBDV HN-1 strain
IBDV主要侵袭鸡法氏囊组织，破坏其中枢免疫器官法氏囊，导致鸡的免疫反应性降低，长期处于免疫抑制状态，因此，IBD也被称为鸡的“艾滋病”，当合并其他细菌或病毒感染时，极易造成鸡只的死亡，给养禽业带来严重危害。有研究显示，当IBDV侵染法氏囊组织后，IBDV在法氏囊内大量增殖，造成B细胞和巨噬细胞损伤[4,10]，T细胞渗入，最终导致法氏囊组织中T细胞达到65%，而B细胞仅占7%[3]。浸润法氏囊的T细胞活化后，释放Th1细胞因子IFN-γ，发挥抗病毒作用；
同时上调促炎因子，介导炎症反应，损伤法氏囊，延缓组织修复。升高的CD4+CD25+T细胞还可能参与IBDV诱导的免疫抑制[6]，而IBDV诱导的免疫损伤也与法氏囊的炎症、凋亡和炎性细胞因子失衡有关[11]。通常认为，趋化因子与受体结合参与了T细胞迁移的调节作用[12-14]。
在前期研究中，本团队发现，经典毒株CJ801感染SPF鸡后，感染组法氏囊样品与对照组样品差异表达基因很多。在感染早期，许多与免疫相关的基因，如炎性反应基因、抗病毒相关基因等，表达水平明显升高。在炎性反应相关基因中，趋化因子往往通过趋化免疫细胞，参与人和动物许多疾病进程。在对高通量测序结果分析过程中，本团队发现趋化因子CCL19及其受体CCR7的表达量变化比较明显，推测CCL19及其受体的相互作用可能在T细胞迁移过程中发挥着非常重要的作用。进一步的研究结果也证实，CCL19是T细胞迁移至法氏囊的主要驱动力[15]。但是这个结果是否具有代表性？不同毒株感染后，趋化因子CCL19及其受体的变化趋势是否相同？从本试验的结果来看，无论是经典毒株CJ801还是本地分离毒株HN-1，感染后，尽管引起趋化因子CCL19及其受体CCR7基因表达量达到最高的时间有所差异，但二者都能够引起趋化因子CCL19及其受体CCR7基因表达量的明显上升。但是本试验也观察到一个奇怪现象：进化分析的结果显示，本地分离毒株HN-1株VP2基因序列与UK661、Harbin-1、OKYM、D6948等超强毒株VP2基因序列高度同源，而与CJ801株VP2基因序列进化关系较远。进化分析结果表明HN-1株与CJ801株毒力上存在一定的差异，但感染试验的结果表明二者毒力相近；
HN-1感染后趋化因子CCL19及其受体CCR7表达量的升高要晚于CJ801株，持续时间也偏长。VP2是IBDV的主要保护性抗原基因，其高变区通常能够影响毒株的毒力，因此，许多学者将其作为分子流行病学和进化研究的指标[16-17]。本试验也选取了VP2基因序列进行进化分析，但从分析结果和感染试验结果比对来看，仅使用VP2基因来做进化分析是不够的。前期研究中，对本地分离株HN-1的B片段进行了比对分析，显示其B片段与超强毒株存在较大差异，与一些重组毒株具有近的亲缘关系[18]。这些结果提示B片段的来源在一定程度上影响了HN-1株的毒力，Lu等[19]、Gao等[20]和Abou El-Fetouh等[21]学者的研究结果，均证实了IBDV B片段对其毒力具有一定的贡献。因此，推测是由于重组造成毒株的毒力下降，出现了上述情况。
本试验结果证实，不同毒力IBDV毒株感染均能引起趋化因子CCL19及其受体CCR7基因表达呈一定程度的升高，而IBDV毒株毒力强弱也能够影响CCL19和CCR7基因表达变化趋势。这为进一步探究是否可以通过调控CCL19或CCR7基因表达水平，减轻IBDV感染后细胞因子风暴对法氏囊组织的影响提供了数据支撑。
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