郴州市2,509例新生儿听力与耳聋基因联合筛查结果分析*
时间：2023-06-04 11:00:22 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
李阳艳 刘淼,2 张昊晴 李彩云 侯帅 雷冬竹
1 南华大学附属郴州医院产前诊断中心(郴州 423000)；
2 郴州市第一人民医院产科；
3 郴州市第一人民医院中心医院产前诊断中心
先天性聋是人类最常见的出生缺陷之一，目前我国每年大约有3万例重度听力障碍新生儿出生[1]，其中超过60%的先天性聋是由遗传因素导致[2]。导致遗传性聋最常见的致聋基因为GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA和GJB3基因，而不同种族及地域的突变热点存在差异[3-5]。本研究拟通过分析郴州地区2 509例新生儿听力与上述4个耳聋基因联合筛查结果，了解郴州地区耳聋基因突变携带率及主要突变类型，为本地区耳聋防治提供依据。
1.1研究对象 选择2019年7月至2020年12月在郴州市第一人民医院分娩的2 509例新生儿为研究对象，筛查前家属均被告知听力和耳聋基因联合筛查的相关知识，理解同意后填写知情同意书。本研究已通过郴州市第一人民医院伦理委员会审查。
1.2方法
1.2.1听力筛查及诊断方法 新生儿出生72小时后采用畸变产物耳声发射(DPOAE)进行听力初筛，未通过者42 天龄时行DPOAE复筛, 复筛未通过者，转诊至郴州市新生儿听力筛查检测及诊断中心, 3月龄左右行听性脑干反应(ABR)检测进行听力诊断。
听力损失程度分级:轻度听力损失为31～50 dB nHL, 中度听力损失为51～70 dB nHL, 重度听力损失为71～90 dB nHL, 极重度听力损失为≥91 dB nHL。
1.2.2耳聋基因检测方法 新生儿出生72小时后，由工作人员用滤纸采集卡统一编号，采集新生儿足跟末梢血3滴，每个血斑直径不小于8 mm，室温下自然晾干，利用高通量测序技术对4个常见致聋基因的20个位点进行检测，包括:GJB2(c.35delG、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT),SLC26A4(c.281C>T、c.589G>A、IVS7-2A>G、c.1174A>T、c.1226G>A、c.1229C>T、IVS15+5G>A、c.1975G>C、c.2027T>A、c.2162C>T、c.2168A>G),mtDNA12SrRNA(m.1095T>C、m.1494C>T、m.1555A>G)和GJB3(c.538C>T、c.547G>A)。
检测流程：对干血斑进行基因组DNA提取，利用多重PCR技术扩增富集人基因组DNA中靶序列并同时引入用于样本识别的样本标签序列。多重PCR技术扩增目的片段进行纯化后进行物理打断，然后在多种DNA聚合酶、连接酶、磷酸酶作用下对PCR产物进行末端补平、3"端加“A”，完成特殊接头在PCR产物两端的连接，经过磁珠纯化完成文库的制备;进行文库质检，文库pooling。高通量测序，严格执行BGISEQ-2000的操作规范，获取序列碱基信息;进行信息分析，测序下机后将数据上传至大型机，信息分析人员根据样本信息及其对应的样本标签信息、接头信息等使用4个基因20个位点信息分析流程进行分析。
1.2.3全外显子测序方法 重新采集耳聋基因筛查阴性且确诊听力损失患儿的外周血，利用全外显子测序技术检测。全外显子测序流程：①首先目标序列捕获与测序：抽取静脉血5 ml，提取基因组DNA，经过LM-PCR扩增并纯化后，完成文库构建，文库进行pooling、定量及单链环化。环化后的文库经过make DNB后利用高通量测序仪MGISEQ-2000进行测序，测序类型为PE100+10，得到原始测序数据。②序列分析用BWA软件(Burrows Wheeler Aligner)与HG19/HG20进行序列比对，用GATK软件进行SNV(single nucletide variant)和Indel(insertion and deletion)的查询，生成目标区域碱基多态性结果，随后进行数据库(NCBI dbSNP, HapMap, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)的比对，并对找出的可疑突变进行注释、筛选。③最后使用Sanger法进行验证。
2.1新生儿听力筛查结果 2 509例新生儿中，初筛未通过69例(2.75%，69/2 509)，复筛未通过33例(47.83%，33/69)，其中3例新生儿为GJB2基因杂合突变。确诊听力损失患儿5例，其中双耳轻度听力损失2例，双耳中度听力损失1例，右耳轻度听力损失1例(左耳正常)，左耳极重度听力损失1例(右耳正常)，这5例耳聋基因筛查均为阴性。
2.2耳聋基因筛查结果 2 509例新生儿中共有100例检出耳聋基因突变,携带率为3.99%(100/2 509)。其中GJB2基因杂合突变55例(2.19%,55/2 509),SLC26A4基因杂合突变31例(1.24%,31/2 509),mtDNA12SrRNA基因突变5例(0.20%,5/2 509),GJB3基因杂合突变8例(0.32%,8/2 509),GJB3/SLC26A4双基因杂合突变1例(0.04%,1/2 509)。在检测的20个位点中，排在前五位的突变位点依次为c.235delC、IVS7-2A>G、c.299_300delAT、c.1229C>T、c.547G>A(表1)。
表1 100例检出耳聋基因突变新生儿基因筛查位点阳性例数分布及听力筛查结果
2.3全外显子测序结果 5例耳聋基因筛查阴性且确诊为听力损失的患儿中，全外显子测序检出4例GJB2基因c.109G>A纯合突变，其中双耳轻度听力损失2例，右耳轻度听力损失(左耳正常)1例，双耳中度听力损失1例；
1例左耳轻重度听力损失(右耳正常)患儿未检出基因突变。
GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA以及GJB3基因是我国常见的致聋基因，约占70%[6],本组2 509例新生儿中这4个常见耳聋基因携带率为3.99%(100/2 509)，稍低于此前文献报道的4.01%～7.88%[7],可能与本研究样本量较少及地域差异性有关。本研究中阳性携带率排在前两位的耳聋基因为GJB2和SLC26A4，与文献[4,8]报道的一致。
GJB2基因纯合突变或复合杂合突变可导致先天性听力损失，本组对象GJB2基因突变携带率最高，为2.13%，突变位点携带率由高到低排列依次为c.235delC、c.299_300delAT和c.176_191del16，其中c.235 delC位点携带率为1.55%，明显高于其他位点，与文献[4,5,8]报道一致。c.35delG是GJB2基因在欧洲、美国和伊朗等地区最常见的致病变异位点[9]，在本组对象中未检出；
本研究检出47例GJB2基因杂合突变新生儿，其中3例新生儿未通过听力筛查，2例为c.235delC杂合突变，1例为c.299_300delAT杂合突变，不排除这3例新生儿可能携带GJB2基因其他位点突变，构成复合杂合突变而导致听力筛查未通过，曾建议完善耳聋基因检测及听力学诊断，但均已失访。
SLC26A4 基因又名PDS基因，纯合突变或复合杂合突变可导致大前庭水管综合征、Pendred 综合征等[10,11]，是仅次于GJB2突变而引起感音神经性聋的遗传学病因。本组对象检出SLC26A4基因突变21例，携带率为1.24%，低于其他研究报道的1.29%～3.68%[7]，其中IVS7-2A>G位点突变携带率为0.76%，为本组对象的第二大热点突变位点。SLC26A4 基因又称“一巴掌致聋基因”，携带该基因突变的患儿在成长过程中，头部受到外力撞击或使颅内压增高等诱发因素都可能导致听力损失的发生，通过及早预警和生活指导可预防或延缓听力损失的发生。本研究中21例SLC26A4基因突变新生儿均为杂合突变，且听力筛查通过，故建议听力随访。
本组对象中mtDNA12SrRNA和GJB3基因突变携带率分别为0.20%和0.32%，与文献[4,7]报道一致。mtDNA12SrRNA基因突变可引起药物性聋，为母系遗传;本研究中5例mtDNA12SrRNA基因m.1555A>G突变新生儿均通过了听力筛查，对其及母系家族成员进行用药指导,终生禁用氨基糖苷类药物, 可有效避免药物性聋的发生。GJB3 基因突变可导致常染色体显性或隐性遗传性聋，主要表现为迟发性高频听力下降[12]。本研究检出6例GJB3基因杂合突变和1例GJB3/SLC26A4双基因杂合突变新生儿，听力筛查均通过，应定期复查听力，及时诊治。
本研究对5例耳聋基因筛查阴性但确诊听力损失的患儿进行全外显子测序，检测出4例GJB2基因c.109G>A位点纯合突变者。GJB2基因c.109G>A位点突变在亚洲地区携带率较高，中国汉族人群携带率为6.2%[13]；
研究发现c.109G>A位点纯合突变或复合杂合突变可表现出极重度听力损失至听力正常等多种表型，以轻度至中度听力损失为主[14～16]。本研究4例c.109G>A纯合突变新生儿于3月龄时确诊听力损失，其中2例为双耳轻度听力损失，1例为右耳轻度听力损失，左耳正常，1例为双耳中度听力损失，可见以轻度听力损失为主。GJB2基因c.109G>A位点突变与迟发性听力损失密切相关，随着年龄的增长，听力损失逐渐出现[14～17]；
本研究中4例c.109G>A纯合突变患儿随着年龄增长，听力损失是否会逐渐加重，需要继续听力随访。
耳聋基因筛查能及时发现迟发性、渐进性及药物性聋高危患儿，弥补单一听力筛查的不足[18]，在张娇等[19]新生儿听力与基因联合筛查的系统评价和Meta分析研究中，新生儿听力筛查通过而基因筛查未通过率为0.22%，其中线粒体基因筛查未通过率占0.20%。文中结果显示，耳聋基因筛查出耳聋基因突变新生儿100例，其中97例新生儿均通过听力筛查，可见单一的听力筛查将会漏筛大部分耳聋高危新生儿，而听力和耳聋基因联合筛查可扩大随访人群，实现早发现早干预，有助于预防或延缓听力损失的发生。
本研究结果显示GJB2和SLC26A4基因是郴州地区新生儿耳聋基因突变的主要类型，虽然对4个耳聋易感基因的20个位点筛查未包括c.109G>A位点，但对5例确诊为听力损失患儿的全外显子测序检出GJB2基因c.109G7A位点纯合突变者4例；
在此前郴州市育龄女性的耳聋基因突变研究中，120例配偶耳聋基因检测结果显示，c.109G>A检出率居首位，达11.67%[20]，提示本地区c.109G>A携带率较高。GJB2基因c.109G>A位点突变听力表型具有多样性，人群携带率高，重视GJB2基因c.109G>A位点突变的致病性，可将其纳入本地区新生儿耳聋基因筛查范围内。
