胃癌组织中EPAS1的表达及临床意义
时间：2023-06-03 19:35:19 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
贾 茹，王 理
胃癌是常见的消化系统肿瘤。2018年全球癌症数据统计显示，胃癌的发病率居恶性肿瘤第5位，病死率居第3位[1]。缺氧是典型的实体瘤微环境，与肿瘤的发生、发展密切相关[2]。含有内皮PAS结构域的蛋白1(endothelial PAS domain protein 1, EPAS1)，又称为缺氧诱导因子2-α(hypoxia-inducible factor-2α, HIF-2α)，HIF的α亚基，可介导细胞和全身对缺氧的反应[3]。EPAS1在许多缺氧反应基因的转录中具有重要作用，研究显示EPAS1与肿瘤的发生、发展密切相关[4]。因此，本文采用免疫组化法检测胃癌组织中EPAS1的表达，探讨其与胃癌临床病理特征的关系及意义。
1.1 材料从癌症基因组图谱数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获取375例胃癌患者的临床数据，其中男性241例，女性134例；
年龄58～74岁，平均(69.54±5.42)岁；
肿瘤TNM分期：Ⅰ期76例，Ⅱ期111例，Ⅲ期150例，Ⅳ期38例。
选取2019年1月～2020年1月浙江大学医学院附属第二医院收治的95例经术后病理证实的胃癌标本。所有患者通过电话或门诊随访，截至日期2022年1月30日。其中男性67例，女性28例；
年龄28～94岁，平均(62.62±10.23)岁。同时收集上述病例的癌旁组织和50例内镜下腺瘤组织作为对照组。纳入标准：(1)结合术后病理明确诊断为原发性胃癌。(2)行ESD手术或D2胃癌根治术。(3)术后生存时间≥3个月。排除标准：(1)合并其他类型恶性肿瘤。(2)既往罹患肿瘤或自身免疫系统疾病。(3)术前接受新辅助化疗。本实验经我院伦理委员会审核，患者均知情同意。
1.2 主要试剂与仪器10%中性福尔马林、苏木精购自宁波同盛公司，DAB购自北京中杉金桥公司，anti-EPAS1抗体购自赛默飞世尔公司，生物组织包埋机及荧光倒置生物显微镜购自徕卡公司。
1.3 方法
1.3.1生物信息学数据分析 (1)下载后的表达谱数据，使用经Toil流程统一处理的FPKM格式的RNAseq数据log2转化后获得。(2)临床相关性及预后分析：将数据库中HTSeq-FPKM格式的RNAseq数据转换成TPM格式，并进行log2转化后获得。(3)从数据库中获取肿瘤分期、转移及生存情况等临床信息，使用R语言(http://www.r-project.org/)进行操作。
1.3.2临床数据收集 收集患者年龄、性别、体重指数(body mass index, BMI)、基础疾病、HP感染、肿瘤位置、浸润深度、脉管侵犯、N分期、M分期、TNM分期、组织学类型、分化程度、手术方式、住院时间、总生存期(overall survival, OS)、无进展生存期(progression free survival, PFS)。其中TNM分期依据AJCC分期手册(第8版)标准进行[5]，OS是指患者从术后开始至死亡或失访时间。
1.3.3免疫组化 免疫组化染色使用SP法。将5 μm厚石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10 min，置于100%、95%、90%、80%、70%乙醇中各5 min进行脱水，在煮沸的蒸馏水中加热15 min。室温下用含10%血清的封闭溶液封闭1 h，加入EPAS1抗体，4 ℃ 孵育过夜。滴加二抗室温孵育30 min，DAB显色，苏木精复染后脱水封固，显微镜下观察。
标本由2名病理医师对染色强度和染色范围进行半定量评分，根据细胞染色强度进行评分：无着色为0分、弱着色为1分、中度着色为2分、强着色为3分；
根据细胞核阳性染色百分比进行评分：阳性细胞数<5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>76%为4分。两项评分相乘作为最终评分：0～6分为低表达组；
>6分为高表达组[6]。
1.3.4细胞培养 人胃癌细胞AGS、HGC-27、MGC-803、SGC-7901和人正常胃黏膜GES-1细胞系均由消化肿瘤中心赠送，并储存在我院临床实验室。实验均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5%CO2环境中培养。
1.3.5qRT-PCR法 按照qRT-PCR试剂盒操作说明书配置PCR反应体系。使用HiScript III RT SuperMix将1 μg总RNA逆转录为互补DNA(cDNA)，所有引物均由北京擎科生物公司设计和合成。通过定量实时RCR扩增目标cDNA，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行实时PCR。循环条件：95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，合计40个循环；
95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。用actin作为内参。使用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对mRNA表达。EPAS1引物序列：上游5′-CGGAGGTGTTCTA TGAGCTGG-3′；
下游5′-AGCTTGTGTGTTCGCAGG AA-3′；
actin引物序列：上游5′-CATGTACGTTGCT ATCCAGGC-3′；
下游5′-CTCCTTAATGTCACGCAC GAT-3′
1.3.6Western blot法 将组织加入含1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，冰上裂解30 min，在4 ℃ 下12 000g离心10 min，取上清液转移至新1.5 mL EP管中；
将20 μg的待测蛋白和10 μL蛋白marker加入上样孔，在配置好的10%SDS PAGE凝胶中进行电泳分离，随后在200 mA、1 h条件下，冰盒内将蛋白样品电转移到PVDF膜上，Western blot封闭液室温下摇床封闭1 h，4 ℃下anti-EPAS1抗体孵育过夜，IgG二抗在室温下摇床上孵育1 h，使用敏感的ECL试剂盒测量免疫反应条带。
2.1 胃癌中EPAS1的表达及与预后的关系通过TCGA数据库分析显示：胃癌组织中EPAS1 mRNA表达显著高于正常胃黏膜组织(P<0.05，图1A)，EPAS1 mRNA低表达组患者的OS和PFS均高于EPAS1高表达组，表明患者预后较好，差异有统计学意义(P<0.05，图1B、C)。
图1 胃癌中EPAS1的表达以及预后分析：A.TCGA数据库分析胃癌组织中EPAS1 mRNA的表达，*P<0.05；
B.TCGA数据库分析EPAS1表达与患者总生存期的关系；
C.TCGA数据库分析EPAS1表达与患者无进展生存期的关系
2.2 胃癌和癌旁组织中EPAS1的表达免疫组化及免疫荧光结果显示：EPAS1主要定位于细胞质和细胞核中，胃癌组织中EPAS1的免疫组化表达得分显著高于癌旁、腺瘤组织，差异均有统计学意义(t=6.213、10.691，P<0.05)。癌旁组织中EPAS1的免疫组化表达得分亦显著高于腺瘤组织，差异有统计学意义(t=7.187，P<0.05，表1，图2)。通过qRT-PCR和Western blot实验检测胃癌细胞中EPAS1 mRNA和蛋白表达也证明，胃癌细胞系中EPAS1 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常胃黏膜细胞GSE-1(图3)。
图2 胃癌、癌旁和腺瘤组织中EPAS1的表达：A.腺瘤组织中EPAS1不表达；
B.癌旁组织中EPAS1不表达；
C.胃癌组织中EPAS1高表达；
D.胃癌组织中EPAS1低表达，SP法
图3 转录(A)和翻译(B)水平验证EPAS1在不同胃癌细胞系中的表达水平：**P<0.01；
***P<0.001
表1 胃癌、癌旁、腺瘤组织中EPAS1的表达
与癌旁组织、腺瘤组织相比，*P<0.001
2.3 胃癌组织中EPAS1表达与临床病理特征及预后的关系胃癌中EPAS1高表达58例，低表达37例，分析EPAS1表达与临床病理特征的关系显示：EPAS1表达与患者年龄、性别、BMI、基础疾病、肿瘤位置、脉管侵犯、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、组织学类型、手术方式无关(P均>0.05，表2)。浸润深度T3、T4以及低分化组EPAS1的表达水平显著增高(t=3.138、2.275，P<0.05，图4)。高表达组侵犯浆膜及浆膜下结缔组织的比例显著高于低表达组(χ2=9.63，P=0.022)，且低分化的比例显著高于低表达组(χ2=4.25，P=0.039)，且EPAS1高表达组的OS均显著低于EPAS1低表达组(t=7.149，P<0.001，图5)。Cox单因素及多因素分析结果显示：EPAS1表达(HR：2.095，95%CI：1.019～4.307，P<0.001)是OS的独立预测因子(表3)。
图4 EPAS1表达与胃癌临床病理特征的相关性：A.不同T分期胃癌中EPAS1的表达，**P<0.01；
B.不同分化程度胃癌中EPAS1的表达,***P<0.001
图5 EPAS1不同表达组胃癌患者的预后分析
表2 EPAS1表达与胃癌临床病理特征的关系[n(%)]
表3 Cox单因素及多因素回归分析
转录复合物HIF作为氧稳态的主要调节器，不同靶点的HIF-α异构体可以通过多个基因的转录激活，调节肿瘤对缺氧的反应[7]。其中EPAS1在细胞对长时间低氧的反应中起关键作用，不仅可以参与铁代谢，还通过对糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白的调节降低耗氧量[8]。尽管最近研究发现EPAS1在消化道肿瘤的发展过程中发挥作用[9]，但在胃癌中的研究较少。因此，本实验拟通过TCGA数据库和临床标本分析EPAS1表达以及与预后和临床病理特征的相关性。
本实验结合TCGA数据库和临床样本的免疫组化分析发现，与腺瘤组织相比，胃癌组织中EPAS1显著高表达，并且表达多位于细胞核与细胞质中。与HIF-1α在所有细胞中普遍表达不同，EPAS1具有一定的组织特异性，仅在特定组织类型中表达，如内皮细胞或肿瘤细胞中[10-11]。当发生缺氧时，EPAS1的α亚基稳定并转移到细胞核，与HIF-1β形成异源二聚体，并结合靶基因调控元件内的缺氧反应元件识别缺氧反应。因此，既往研究也证实EPAS1在缺氧诱导时主要位于细胞核或细胞质中[12]。
为进一步探索EPAS1与胃癌患者预后的相关性，本组分析TCGA数据库结果显示：EPAS1表达上调与胃癌患者预后不良相关，临床数据也进一步证实EPAS1高表达胃癌患者的总生存率显著低于EPAS1低表达组，这些结果均表明EPAS1可能是胃癌患者的预后标志物。多项研究报道肿瘤组织中EPAS1的mRNA和蛋白质水平均高表达，并且与不同肿瘤类型的发生、进展和预后相关[13-14]。在肿瘤微环境中，由于不规则毛细血管的形成，血流缓慢，但由于肿瘤细胞的快速增殖，肿瘤细胞需氧量增加导致肿瘤内部缺氧，通过激活基因表达程序，诱发EPAS1启动细胞对缺氧环境的适应性反应[15]。此外，EPAS1可能会招募SP1转录因子和其他辅因子形成“EPAS1增强分子”，诱导转录发生[16]。EPAS1表达与胃癌临床病理特征相关性分析显示：EPAS1高表达与原发灶深度浸润和低分化程度显著相关。
综上，EPAS1可能是胃癌患者的预后标志物，并且与原发灶浸润和分化程度显著相关。同时本研究存在一些局限性：首先，本实验为单中心回顾性研究，样本量相对较少，仍需进一步扩大研究证实该结论。其次，本研究中仅使用了石蜡切片，检测EPAS1 mRNA表达水平的能力有限，仍需收集新鲜组织标本进行验证。
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