亚洲玉米螟几丁质酶的双靶向天然产物抑制剂及其抑制机理
时间：2023-06-03 12:40:31 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
何丹婵, 姜 熙, 杨 青*,,
(1. 中国农业科学院 植物保护研究所，北京 100193；
2. 中国农业科学院 农业基因组研究所 广东岭南现代农业实验室深圳分院 农业农村部基因组分析实验室，广东 深圳 518120)
几丁质是由β-1,4 糖苷键连接N-乙酰葡萄糖胺形成的线性聚合物，是昆虫表皮的重要结构组分，可以保护昆虫抵御环境压力和机械损伤[1-2]。但是刚性的表皮结构限制了昆虫的生长发育，因此昆虫需要周期性蜕皮以满足生长发育的需要[3]，其中旧表皮中几丁质的降解是关键的一步。负责几丁质降解的几丁质酶包括ChtI、ChtII 和Chi-h[4]，它们协同作用可实现对几丁质的高效降解[5]。这些酶同属于糖基水解酶18 家族 (EC 3.2.1.14)，可催化水解几丁质或几丁寡糖中的β-1,4 糖苷键，使其断裂。通过注射dsRNA 降低某个几丁质酶的表达水平，均可导致昆虫因蜕皮异常而死亡，表明每个几丁质酶在昆虫生长发育过程中是不可或缺的[3,6-7]。因此，通过小分子化合物抑制几丁质酶的活性可能是开发新型杀虫剂的有效途径。
几丁质酶抑制剂作为潜在的杀虫剂已经得到了广泛研究。早期发现的几丁质酶抑制剂大多为底物或反应中间态的类似物，例如allosamidin[8]及其衍生物，但这类抑制剂结构复杂，难以人工合成，因而限制了其大规模应用；
而后期通过筛选获得的几丁质酶抑制剂通常作用靶标单一，生物活性不高。近期，药物研发领域采用多靶标抑制策略筛选到的药物具有生物活性高和抗药性低的优点，也同样用于新型农药的创制[9-10]。由于参与昆虫蜕皮的几丁质酶具有相同的催化机理和相似的底物结合位点[11]，因而具有开发多靶标抑制剂的基础。据报道，靶向多个几丁质酶的抑制剂TMG-chitotriomycin[12]和小檗碱[13-14]，虽然对单一靶标酶的抑制活性较弱，但表现出较高的生物活性。
由于几丁质酶参与生物的入侵和防御过程，因此宿主为了抵抗含几丁质生物的入侵而自身合成的天然产物是潜在的几丁质酶抑制剂的来源[15]。本文以结构和功能均已清晰的重要鳞翅目害虫亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis来源的几丁质酶OfChtI[16]和OfChi-h[12]作为抑制剂筛选靶标，通过对已商品化的天然产物库进行高通量筛选，拟获得同时作用于OfChtI 和OfChi-h 的双靶标抑制剂，利用分子对接方法揭示其作用机制，并对其杀虫活性进行评价。旨在为靶向昆虫几丁质降解酶系抑制剂的研究提供新的思路。
1.1 供试材料
化合物：4-甲基伞形酮-N,N’-乙酰几丁二糖(4-methylumbelliferyl-β-D-N,N-diacetylchitobiose，MU-β-(GlcNAc)2) 购自Sigma-Aldrich (上海，中国)。
TargetMol 天然产物库[17](目录编号：L6000，https://www.tsbiochem.com/library/Natural%20Product%20Library%20for%20HTS) 及化合物漆树酸 (anacardic acid)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 (di(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP) 和紫菀酮(shionone) 购自Topscience (上海，中国)。
仪器：全自动蛋白纯化系统ÄKTA start 和蛋白纯化色谱柱购自GE Healthcare；
液体工作站(Freedom EVO) 和酶标仪 (Tecan Infinite 200 Pro)购自Tecan 公司。
酶制剂：亚洲玉米螟的OfChtI (ABB97081.2)和OfChi-h (BAE16587.1) 通过毕赤酵母GS115 表达，均按照文献中报道的方法进行分离纯化，蛋白纯度通过SDS-PAGE 和考马斯亮蓝R-250 染色进行分析[12,16]。
亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis，由中国农业科学院植物保护研究所王桂荣课题组提供。
1.2 天然产物库的高通量筛选
参考文献中的抑制剂筛选方法[18]，使用Freedom EVO 液体工作站对TargetMol 天然产物库进行几丁质酶抑制剂的高通量筛选。抑制剂筛选的反应体系为100 μL，在含有适量酶的20 mmol/L磷酸钠缓冲液 (pH 6.0) 中加入2 μL 化合物 (溶剂为二甲基亚砜 (DMSO) )，于30 ℃下孵育5 min后加入10 μL 底物 (OfChtI 和OfChi-h 的底物为MU-β-(GlcNAc)2)，开始反应。将底物换成等体积的去离子水，其他条件不变，作为阴性对照组；
将化合物换成等体积的DMSO，其他条件不变，作为阳性对照组；
将化合物换成等体积的DMSO，底物换成等体积的蒸馏水，其他条件不变，作为空白对照组。反应20 min 后，加入100 μL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液终止反应。使用酶标仪在激发和发射波长分别为360 和450 nm 条件下对几丁质酶水解底物后释放出的MU 进行荧光定量。试验组荧光强度记做FE，不含底物的阴性对照组荧光强度记做FN，不含化合物的阳性对照组荧光强度记做FP，空白对照荧光强度记做FB，抑制率记做I。通过公式 (1)[19]计算抑制活性。
1.3 抑制常数测定
为了确定抑制模式和抑制常数 (Ki)，在3 种底物浓度[8、4 和2 μmol/L MU-β-(GlcNAc)2]下测定不同浓度的抑制剂对OfChtI 和OfChi-h 的抑制活性。通过Dixon plots 法[20]计算抑制剂的Ki值。
1.4 分子对接
利用PRODRG2 生成并优化了化合物的三维结构[21]。对接网格的中心放置在OfChtI (PDB ID:3WQW) 和OfChi-h (PDB ID: 5GQB) 活性位点的中心。使用MGLTools 添加极性氢原子和Gasteiger电荷[22]。利用AutoGrid4 计算OfChtI 60 Å × 60 Å ×70 Å (2.52 × 10-25m3),OfChi-h 50 Å × 50 Å × 50 Å(1.25 × 10-25m3) 的网格能量[23]。分子对接由AutoDock4使用遗传算法进行，共进行了2 500 万次能量评估和27 000 代。合理的对接模型从构象最丰富的结合能最低的聚类中选择。所有结构图均使用PyMOL(DeLano Scientific LLC) 制作。
1.5 杀虫活性测定
亚洲玉米螟饲养条件为温度26 ℃，光照 : 黑暗=16 h : 8 h，相对湿度60%。以3 龄第1 天的亚洲玉米螟幼虫作为抑制剂杀虫活性的评价对象[24]。将人工饲料与抑制剂 (溶剂为DMSO) 混合, 抑制剂终浓度为2 mmol/L (抑制剂浓度 = 抑制剂摩尔量/饲料体积，饲料体积按照饲料密度1 g/mL 进行估算)，待相对湿度达60%左右后饲喂试虫。饲料的相对湿度是由人工气候培养箱调控的。试验组幼虫饲喂含有抑制剂的饲料，对照组幼虫饲喂与试验组含有相同DMSO 浓度的饲料，每组15只，饲养5 d。在此期间，每天记录活虫数量，按(2) 式计算死亡率。
式中：M为死亡率；
NC为对照组剩余活虫个数；
NT为试验组剩余活虫个数。
2.1 昆虫几丁质降解酶抑制剂的高通量筛选
天然产物仍然是新型杀虫剂的重要来源。已商品化的TargetMol 天然产物库包括1 680 种从植物、动物和微生物中分离出的天然产物，包括30 多个类型的化学物质，如生物碱、柠檬苦素类、二萜类、五环三萜类和甾醇类等，以及其他多种代表性物质[17]。高通量测定了TargetMol 天然产物库中的化合物在100 μmol/L 浓度下对OfChtI和OfChi-h 的抑制活性 (图1A, 图1B)。结果发现：对OfChtI 抑制活性超过80% 的化合物有20 个，对OfChi-h 抑制活性大于80%的化合物有61 个，化合物类型主要为生物碱类、萘醌类、酰胺类、甲酯类和萘酚类等。对OfChtI 和OfChih 的抑制活性同时超过80%的化合物有3 个，分别为漆树酸、DEHP 和紫菀酮 (图1C)，其对OfChtI 的抑制率分别为99.88% ± 0.20%、99.02% ±1.72%和94.42% ± 1.79%，对OfChi-h 的抑制率分别为99.68% ± 0.24%、98.72% ± 0.37%和82.00%± 1.02%。
图1 天然产物库化合物在100 μmol/L 下对OfChtI (A)和OfChi-h (B)的抑制活性及漆树酸、DEHP 和紫菀酮的结构式 (C)Fig. 1 Inhibitory activities of compounds from natural product library against OfChtI (A) and OfChi-h (B) at 100 μmol/L and structural formula of anacardic acid, di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and shionone (C)
为了验证其抑制活性，同法测定了化合物对OfChtI 和OfChi-h 的抑制活性。结果表明，3 个化合物均表现出浓度依赖的抑制活性，在10 μmol/L下，漆树酸、DEHP 和紫菀酮对OfChtI 的抑制率分别为98.81% ± 0.88%、95.29% ± 5.39% 和80.68%± 5.52%，对OfChi-h 的抑制率分别为96.84% ± 0.12%、87.16% ± 3.29%和33.03% ± 5.09%。
2.2 抑制常数测定
为进一步评价3 个化合物对OfChtI 和OfChi-h的抑制效果，分别测定了其对靶标酶的抑制常数(Ki)。结果表明，3 个化合物对OfChtI 的Ki值分别为0.57、0.53 和3.95 μmol/L，对OfChi-h 的Ki值分别为0.48、1.42 和27.33 μmol/L (图2)。其中，漆树酸对OfChtI 和OfChi-h 的抑制活性最高；
DEHP 稍弱；
紫菀酮则表现出较弱的抑制活性，且对两个靶标酶的活性存在差异。抑制常数测定的曲线交点位于第二象限，表明3 个化合物属于OfChtI 或OfChi-h 的竞争性抑制剂[19]。
图2 漆树酸、DEHP 和紫菀酮对OfChtI 和OfChi-h 的Ki 值Fig. 2 Ki values of anacardic acid, DEHP, and shionone against OfChtI and OfChi-h
2.3 化合物构效关系分析
在本文中，几丁质酶的结合位点采用Davies等的命名规则[25]：-n 位点代表底物几丁质非还原端在几丁质酶中的结合位置， +n 位点代表底物几丁质还原端在几丁质酶中的结合位置。催化反应中，几丁质的β-1,4 糖苷键的断裂发生在 -1 位和+1 位的糖单元之间。
为了揭示化合物对昆虫几丁质酶的抑制机理，分别将其对接到OfChtI 和OfChi-h 晶体结构中。结果显示，3 个化合物均占据OfChtI 和OfChi-h的底物结合位点，这与抑制动力学曲线表现出的竞争性抑制剂特征相符 (图3)。在OfChtI 的对接结果中，漆树酸的苯环基团插入由Tyr217、Trp223、Tyr149 和Trp372 侧链芳香族基团形成的疏水凹槽中，与 +1 位Trp107 侧链吲哚基团形成π-π 堆积作用；
其脂肪链尾部与Trp34、Phe61 和Phe309侧链芳香族基团形成疏水相互作用。漆树酸的1 位羧基氧原子作为氢键受体，与OfChtI 的Arg274侧链胍基上的氢原子形成氢键。在DEHP 与OfChtI的对接结果中，其苯环基团可以与 +1 位Trp107和 +2 位Trp223 侧链吲哚基团形成π-π 堆积作用。DEHP 的羰基和烷氧基氧原子作为氢键受体，与OfChtI 的Arg274 侧链胍基上的氢原子形成氢键。紫菀酮通过与Trp372、Phe309、Tyr272、Tyr217、Trp107、Phe61 和Trp34 侧链芳香族基团形成疏水相互作用结合在OfChtI 的活性位点。在催化反应中，OfChtI 的Trp34、Trp107、Trp223和Trp372 用于结合底物几丁质的糖单元，因此漆树酸、DEHP 和紫菀酮与这些氨基酸形成的π-π 堆积作用或疏水相互作用可以有效抑制几丁质酶活性。在化合物与OfChi-h 的分子对接结果中，漆树酸的苯环基团与 +1 位Trp268 侧链吲哚基团形成π-π 堆积作用，其脂肪链与底物结合位点的Tyr437、Trp532、Trp160 和Phe184 侧链芳香族基团形成疏水相互作用。漆树酸的1 位羧基氧原子作为氢键受体，与Arg439 侧链胍基上的氢原子形成氢键。DEHP 的苯环基团与OfChi-h 的 +1 位Trp268 吲哚基团形成π-π 堆积作用，与Tyr383 和Trp389 侧链芳香族基团形成疏水相互作用。DEHP 的烷氧基氧原子作为氢键受体，与Arg439 侧链胍基上的氢原子形成氢键。紫菀酮与OfChi-h 的Trp532、Tyr383、Trp268 和Trp160 侧链芳香族基团形成疏水相互作用。由于OfChi-h 亲水性氨基酸Gln466的存在，减弱了紫菀酮与OfChi-h 的疏水相互作用，导致紫菀酮对OfChi-h 的抑制活性较弱。在化合物的对接结果中，漆树酸与DEHP 均能与OfChtI和OfChi-h 形成额外的氢键相互作用，因此，比紫菀酮表现出了更高的抑制活性。
图3 漆树酸、DEHP 和紫菀酮与OfChtI 和OfChi-h 的结合模式Fig. 3 Modeled structures of anacardic acid, DEHP, and shionone in complex with OfChtI and OfChi-h
2.4 杀虫活性评价
选择亚洲玉米螟幼虫作为研究对象，初步测试3 种化合物的杀虫活性。分别在人工饲料中加入终浓度为2 mmol/L 的待测化合物，在玉米螟幼虫3 龄第1 天开始喂食。喂食5 d 后发现：对OfChtI和OfChi-h 抑制活性较高的漆树酸和DEHP 可以导致33.3%的幼虫死亡，死亡的幼虫躯体出现显著皱缩，生长发育出现异常；
紫菀酮对玉米螟幼虫则未表现出显著的杀虫活性 (图4)。
图4 漆树酸、DEHP 和紫菀酮的杀虫活性Fig. 4 Insecticidal activities of anacardic acid, DEHP, and shionone against O. furnacalis
由于化合物对昆虫的体内活性不仅与其与靶标酶的结合力相关，还与化合物的溶解度、体内吸收和代谢能力等有关，因此对漆树酸、DEHP和紫菀酮的理化性质进行了分析。通过计算3 个化合物的clogP数值发现，紫菀酮的clogP值(13.35) 显著大于漆树酸 (9.19) 和DEHP (8.71)，推测紫菀酮在昆虫体内的吸收和生物利用率较差，较高的脂溶性导致其与代谢酶的亲和力较高，在受试昆虫体内被快速代谢清除[26]，这可能是紫菀酮杀虫活性较弱的原因。因此，在下一步的结构衍生化研究中，降低化合物的脂溶性是需要重点考虑的因素。
天然产物来源于自然界，具有较好的环境代谢能力和物理化学特性，是绿色农药的重要来源[27-28]。本文以亚洲玉米螟几丁质酶OfChtI 和OfChi-h 为靶标，对已商品化的天然产物库进行高通量筛选，获得了双靶标抑制剂漆树酸、DEHP和紫菀酮。漆树酸是一种来自Amphipterygium adstringens天然的组蛋白乙酰转移酶抑制剂，可作为肿瘤血管生成抑制剂[29]和抗真菌剂[30]，防止稻瘟病菌Magnaporthe oryzae侵染植株。紫菀酮是菊科植物紫菀(Aster tataricusL.)的主要三萜成分，具有广泛的药理作用，如抗炎[31-32]、抗癌[33]。经过长期应用，已证明漆树酸和紫菀酮对人类是安全的[34-35]，因此它们具有被开发为绿色农药的潜力。DEHP 可以从细菌Brevibacterium mcbrellneri中分离得到，对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性，对埃及伊蚊具有杀虫活性[36]。但是化学合成的DEHP常被用作增塑剂或塑化剂，对人和环境有害，用于害虫防治则需要对化合物的结构进行改造，屏蔽有害作用基团，以降低其对人和环境的危害性。
分子对接研究发现，抑制剂通过疏水堆积作用结合在OfChtI 和OfChi-h 的底物结合位点。此外，漆树酸和DEHP 均可以与OfChtI 和OfChi-h形成氢键相互作用，因此表现出高于紫菀酮的抑制活性。在杀虫活性评价中，漆树酸和DEHP 对亚洲玉米螟3 龄幼虫表现出较弱的杀虫活性，而紫菀酮则未表现出明显的杀虫活性。鉴于几丁质酶抑制剂具有昆虫生长调节剂的潜在活性，因此在杀虫活性评价中，可进一步延长饲喂试验时间，详细观察并记录受试幼虫的生长发育情况和蜕皮过程。通过计算抑制剂的clogP数值发现，亲脂性较高可能是导致抑制剂杀虫活性较差的原因，这为后续的结构优化提出了方向。综上所述，本研究结果为靶向几丁质酶的新型绿色农药创制提供了参考结构。
谨以此文庆贺中国农业大学农药学学科成立70 周年。
Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.
作者简介：
何丹婵，女，2019.9—2022.6 在中国农业科学院农药学专业学习，获硕士学位，研究方向为农药靶标蛋白质的重组表达与分离纯化，以及靶向昆虫几丁质酶的新型抑制剂开发和抑制机理研究。毕业后在北京生物公司从事生物相关领域的技术支持工作。
杨青，女，研究员，博士生导师。2002 年获大连理工大学生物化学工程博士学位后，分别在瑞典乌普萨拉大学、美国哈佛大学和加州大学伯克利分校进行博士、博士后与访问学者研究。2019 年至今在中国农业科学院从事科研工作，主要研究方向为：1) 昆虫表皮及外骨骼形成的分子机制；
2) 农业有害生物关键蛋白的结构生物学及抑制剂设计；
3) 病虫害的小分子调控。先后主持国家杰出青年基金、NSFC-DFG 中德国际合作项目、国家自然科学基金重点项目和国家重点研发计划项目子课题等。现任《农药学学报》编委。
