UGT2B15,在胃癌细胞中的表达及影响
时间：2023-06-02 14:00:17 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
陈选民 周伟伟 谭芳芳 宾玉玲 胡光胜
作者单位：421001 湖南衡阳，南华大学附属第一医院消化内科
胃癌是高度恶性的消化系统肿瘤，根据2018 年全球癌症统计数据显示，胃癌的病死率已位居恶性肿瘤第二位，全球每年因胃癌死亡的人数超过78 万名［1］。我国是胃癌高发国家，尽管诊疗技术不断进步，分子靶向药物也被不断开发及应用，但胃癌患者的5 年生存率仍然很低［2］。因此，揭示胃癌发生发展的分子机制，寻找新的潜在治疗靶点，对提高胃癌患者的生存率具有十分重要的临床意义。
生物信息学在医学研究中科学高效，该方法采用大数据高速算法，减少小样本带来的误差，使结果更加科学合理，也为肿瘤的研究提供了新的方向。本研究前期对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中胃癌mRNA高通量数据GSE54129、GSE79973 及GSE56807 进行生物信息学分析（包括126 例胃癌组织及36 例癌旁组织），共筛查出118 个差异表达mRNA，进一步通过基因聚类分析（gene ontology，GO）、基因信号通路分析（Kyto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG pathway）及蛋白间相关性分析（protein and protein interaction，PPI），筛选处可能调控胃癌发生发展的葡糖醛酸转移酶2家族B15（glucuronsyltransferase family 2 member B15，UGT2B15）［3］。
UGT2B15 是UGT2 家族成员，主要在肝脏或肝外组织中表达，在雄激素葡萄苷酸化中具有重要作用［4］。有研究表明，UGT2B15 的基因多态性导致个体对药物或激素代谢存在差异［5］。前列腺癌中UGT2B15 高表达可导致去势术后患者化疗耐药［6］；
乳腺癌中UGT2B15 表达增高能减弱莫西芬的化疗效果，导致乳腺癌患者获得性耐药［4］。但UGT2B15在胃癌中的研究报道比较少见，本研究前期分析人类癌症基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，结果表明UGT2B15 在胃癌患者体内高表达，且其表达与胃癌患者的临床分期及预后密切相关。本研究旨在分析UGT2B15 在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞的作用，从而为胃癌的分子治疗寻求新的分子标记物，现将结果报告如下。
1.1 资料收集 收集2015 年1 月—2019 年12 月在本院就诊并行胃癌根治术的胃癌患者的226 份临床标本（包括肿瘤组织和癌旁组织标本），其中136 份制成石蜡切片，另外90 份制作冰冻组织提取RNA。所有手术标本均在离体30 min 内收集，且术后经病理科确诊为胃癌。本研究符合医学伦理学标准，并经本院伦理审查（审批号：2018110102008），所有患者均知情同意。
1.2 仪器与试剂 荧光倒置相差显微镜购自中国北京博瑞斯科技有限公司，免疫组化试剂盒购自武汉谷歌生物科技有限公司，UGT2B15（ab89274）和FOXA1（ab170933）以及β-actin（ab179467）单克隆抗体均购自美国abcom 公司；
实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative PCR，qRTPCR）试剂盒、反转录试剂盒及CCK-8 试剂盒均购自上海翊圣生物科技有限公司；
TRizol 试剂购自美国赛默飞世尔科技有限公司；
siRNA 及PCR 引物由武汉赛维尔生物公司设计合成，序列见表1。
表1 qRT-PCR 引物及siRNA 序列
1.3 免疫组化检测 将所收集的病理组织制成石蜡切片后经60 ℃烤片溶蜡，二甲苯及梯度乙醇脱蜡脱水后置于95 ℃水浴锅中静置20 min，用3%过氧化氢（H2O2）溶液浸泡孵育，去除内源性抗原，并在4 ℃冰箱加一抗孵育过夜。使用磷酸盐缓冲液清洗3 次，每次约5 min，然后孵育二抗1～2 h 后，DAB显色。苏木素溶液复染并利用1%乙醇反蓝，封片后干燥。由3 名有经验的病理科医师分别阅片后进行评分。
1.4 qRT-PCR 及siRNA 转染 采用TRizol 法提取组织或细胞中RNA，经仪器测定RNA 浓度及纯度无误后，利用DNA 去除和反转录步骤制备cDNA。采用qRT-PCR 检测相对表达量，进行PCR 反应。反应条件为：95 ℃预变性5 min，1 个循环；
95 ℃变性10 s，60 ℃退火，延伸30 s，30 个循环；
95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，1 个循环。取对数期生长的AGS 和MGC-803 胃癌细胞接种到6 孔细胞培养板，加入无抗菌药物培基培育12～24 h，待细胞融合度为约50%时进行转染，继续培养48 h 后进行转染效率检测和后续实验。
1.5 细胞增殖、凋亡及侵袭能力检测 利用胰酶消化并制备细胞悬液，在细胞计数板中计数后，将细胞接种于96 孔板，每孔接种约2 000 个细胞，每5 个副孔设置为一组。检测各组细胞5 d 的生长情况，使用酶标仪检测450 nm 处吸光度值（A），以各组胃癌细胞的A值表示细胞增殖水平。FITC/PI 双染法收集处理转染后的细胞，并利用流式细胞术检测细胞凋亡；
将各组细胞转染后接种至Transwell 小室，继续培养48 h，清洗小室后以结晶紫染色并于显微镜下观察各小室穿过的细胞，计算细胞数量以测定各组细胞的侵袭能力。
1.6 Western blotting 检测 利用RAPA 裂解液将细胞在冰上裂解约30 min 后，高速离心，收集上清蛋白液，变性后低温保存，上样80 V 恒压电泳，恒流转膜后孵育抗体，并利用显影液显影后观察蛋白条带。
1.7 统计学分析 采用SPSS 25.0 软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验；
计数资料以百分比表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 胃癌组织中UGT2B15 的表达 免疫组化结果显示，UGT2B15 在胃癌组织中呈深黄色或褐色，而在癌旁正常腺体组织中，UGT2B15 呈淡黄色或无染色，表明UGT2B15 在癌组织中表达明显高于癌旁组织。qRT-PCR 检测结果也显示UGT2B15 的mRNA在癌组织中表达水平明显高于癌旁组织。见图1。2.2 UGT2B15 表达与胃癌患者临床病理及预后的关系 UGT2B15 在胃癌中的表达与肿瘤浸润深度、脉管侵犯和TNM 分期密切相关（均P＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、神经侵犯以及远处转移无关。见表2。Kaplan-Meier 生存分析显示，UGT2B15 高表达患者的特定疾病生存率（disease-specific survival，DSS）和总生存率（overall survival，OS）均明显低于低表达患者（DSS：Log Rank＝8.425，P＝0.004；
OS：Log Rank＝9.776，P＝0.009）。
图1 免疫组化检测UGT2B15 在胃癌组织（1A）及癌旁正常腺体组织（1B）中的表达
表2 UGT2B15 表达与胃癌临床病理因素的关系
2.3 siRNA 干扰胃癌细胞UGT2B15 表达抑制胃癌细胞增殖、侵袭并促进凋亡 UGT2B15 在AGS 和MGC-803 细胞中的表达水平明显高于胃黏膜上皮细胞GES1，因此利用siRNA 荧光标记UGT2B15 后干扰AGS 和MGC-803 中UGT2B15 的表达。采用CCK-8 法检测转染后的各组细胞增殖能力，结果显示，抑制组的AGS 和MGC-803 细胞增殖能力均明显低于对照组（AGS：0.67±0.25 比1.75±0.43，MGC-803：0.82±0.33 比1.86±0.47，均P＜0.05）。FITC/PI 双染实验和Teanswell 实验结果显示，抑制组的细胞凋亡率明显高于对照组〔（17.2±6.4）%比（8.7±3.4）%，P＜0.05〕，A值明显低于对照组（AGS：472.0±36.5 比700.3±82.2，MGC-803：487.2±18.2比638.5±21.3，均P＜0.05）。见图2。
2.4 siRNA 抑制UGT2B15 表达并下调FOXA1 表达 生物信息学分析表明，FOXA1 在胃癌中表达升高，且与UGT2B15 的表达密切相关，为进一步明确二者关系，采用免疫组化方法检测FOXA1 在胃癌中的表达，结果显示FOXA1 在癌组织中的表达明显高于癌旁组织；
Western blotting 及qRT-PCR 结果也显示siRNA 抑制胃癌细胞UGT2B15 后可明显降低FOXA1 的蛋白及RNA 表达（蛋白表达：0.091±0.0182 比0.045±0.0124，RNA 表达：AGS：1.000±0.000 比0.582±0.124，MGC-803：1.000±0.000 比0.724±0.157，均P＜0.05）。见图3～4。
图 2 抑制UGT2B15 的表达可明显促进细胞凋亡并降低胃癌细胞侵袭能力
图3 Western blotting 检测siRNA 抑制UGT2B15 后FOXA1 的蛋白表达水平
图4 qRT-PCR 检测siRNA 抑制UGT2B15 后FOXA1 的RNA 表达水平
胃癌是危害社会公共健康的难题，虽然诊疗技术的不断完善使胃癌诊治方法有了较大进展，但由于其侵袭转移能力强，且早期症状不明显，胃癌治疗仍然十分困难［7］。随着精准医学的不断发展，从基因层面寻找治疗靶点一直是胃癌研究的热点和重点，因此寻找有效的分子标志物十分迫切。近年来，随着第三代基因测序及生物信息学的飞速发展，越来越多的研究者将两者结合，分析和筛选出大量参与胃癌调控的分子标志物，也从各层面进一步揭示了胃癌的发展规律，为临床治疗提供新思路［8-9］。
本课题组前期通过对GEO 数据集中GSE54129、GSE79973、GSE56807 纳入126 例胃癌组织及36 例癌旁组织的差异表达基因进行分析，筛查出它们共有118 个差异表达mRNA，并利用基因聚类分析、基因信号通路分析和蛋白间相关性分析等方法最终筛选发现UGT2B15 可能是参与胃癌发生发展的关键分子。目前对UGT2B15 的研究主要集中在其对药物代谢的影响以及在肿瘤耐药等方面的作用［10-11］。但本研究后续实验表明，在136 例胃癌组织中检测UGT2B15 的蛋白表达，同时采用qRT-PCR 方法检测另外90 例胃癌及癌旁组织中UGT2B15 的RNA表达水平，其表达明显高于癌旁组织。因此推测UGT2B15 可能是参与胃癌发生的重要分子。另外，通过分析其在胃癌中的表达及其与临床病理的关系，结果表明UGT2B15 在胃癌组织中的阳性表达与肿瘤浸润深度、脉管浸润及TNM 分期密切相关。TNM 分期以及脉管侵犯都是胃癌不良预后的独立危险因素［12］。通过对136 例患者进行追踪随访，进一步发现UGT2B15 阳性表达组患者的总体病死率和疾病特定死亡率明显高于UGT2B15 阴性表达组患者，因此推动UGT2B15 可能成为胃癌不良预后的分子标志物。另外，由于UGT2B15 与胃癌肿瘤侵犯深度密切相关，提示UGT2B15 可能参与胃癌肿瘤浸润发展，因此利用siRNA 抑制UGT2B15 在胃癌细胞系AGS 和MGC-803 中的表达后，检测其对胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，结果表明与对照组比较，UGT2B15-siRNA 组细胞的增殖能力和侵袭能力明显下降，且细胞凋亡率上升，也进一步证实UGT2B15 对调控胃癌发展具有重要意义。为进一步研究UGT2B15 促进胃癌发展的分子作用机制，结合前期生物信息学研究，结果表明UGT2B15在胃癌中的表达与FOXA1 存在明显关系，FOXA1是Hippo-YAP 信号通路骨架蛋白，并调控其信号活性。有研究证实，肿瘤细胞通过高表达FOXA1活化Hippo-YAP 信号通路促进肿瘤发生发展及耐药［13-14］。在胃癌、卵巢癌及乳腺癌患者中已经证实，FOXA1 活化Hippo-YAP 信号通路并上调YAP 表达，促进肿瘤细胞增殖及迁移［15-16］。YAP1 蛋白进入细胞核为Hippo 信号通路的关键事件。在YAP1 进入细胞核后，特异性与转录增强相关结构域（transcriptional enhanced associate domain，TEAD）等蛋白结合，共同发挥转录增强子作用，促进DNA 的转录，从而影响肿瘤增殖及发展［17］。本研究也进一步通过Western blotting 和qRT-PCR 等实验证明，在胃癌细胞中抑制UGT2B15 的表达可明显降低FOXA1 的蛋白和RNA 表达水平，因此推测，UGT2B15 可能通过调控FOXA1 表达活化Hippo-YAP 信号通路，从而促进胃癌细胞增殖，但更深层的分子机制及调控方式还有待进一步研究。
综上所述，UGT2B15 在胃癌组织中表达水平升高，且与肿瘤浸润深度、脉管侵犯、TNM 分期以及不良预后密切相关；
UGT2B15 可能参与胃癌细胞增殖、侵袭以及凋亡；
抑制胃癌细胞中UGT2B15 的表达后可降低FOXA1 的表达。因此UGT2B15 有望成为胃癌诊疗的有效分子标志物。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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