PM2.5通过TLR4破坏自噬流加重Raw264.7巨噬细胞炎症反应
时间：2023-06-01 21:25:09 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
黄秋阳，王伟，罗书，郑文武，冯健，叶强，郑舒展△
大气污染是一个全球性的公共卫生问题。空气动力学当量直径小于2.5 µm的细颗粒物（fine particulate matter，PM2.5）是最复杂、最有害的大气污染物，也是心血管疾病的主要诱因［1］。流行病学研究表明，PM2.5的质量浓度每增加10µg/m3，心血管疾病的病死率则上升11%［2］。其机制可能与PM2.5加重炎症反应、促进动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发展有关［3-4］。但PM2.5加重炎症反应的具体机制尚不完全清楚。自噬是一种细胞修复过程。研究发现，在粥样斑块形成过程中存在自噬激活，而进展期的不稳定斑块存在自噬降解受损［5］，可见AS的不同阶段均有自噬参与。而AS的发生发展离不开巨噬细胞［6-7］，巨噬细胞是AS过程的主要效应细胞。因此研究AS中巨噬细胞自噬是有必要的。已有研究发现PM2.5具有诱导肺泡上皮细胞［8］和血管内皮细胞［9］自噬的作用。然而，关于自噬在PM2.5促进AS中的作用以及PM2.5对巨噬细胞自噬的影响的研究甚少。此外，有研究显示PM2.5可直接进入循环系统，被巨噬细胞的Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）识别［3］。因此，本研究拟从自噬的角度探讨PM2.5促进巨噬细胞炎症反应的具体机制，为防治AS提供新的理论基础。
1.1 主要材料与试剂PM2.5样本于2020年3—9月采集于四川省泸州市茜草园艺路（由泸州市环境监测中心站提供）；
Raw264.7细胞株购自上海中乔新舟生物科技有限公司；
磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.1 mol/L，pH=7.4）购自Biosharp Life Science公司；
胎牛血清（FBS）、高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司；
细胞冻存液购自美国ScienCell研究实验室；
自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）、TLR4抑制剂TAK-242、自噬诱导剂雷帕霉素（Rap）购自北京索莱宝科技有限公司；
兔源抗GAPDH抗体购自英国Abcam公司；
兔源抗TLR4、核苷酸结合域样受体蛋白3（NLRP3）、微管相关轻链蛋白3（LC3）、p62抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；
兔源抗溶酶体膜蛋白2（LAMP2）抗体购自Bioss Antibodies公司；
抗组织蛋白酶B（CTSB）抗体购自美国Proteintech公司；
HRP标记的山羊抗兔二抗、Western blot实验主要试剂购自武汉ASPEN公司；
白细胞介素（IL）-1β、IL-18、IL-10酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自武汉科鹿生物科技有限责任公司。透射电子显微镜购自美国FEI公司；
Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒购自上海碧云天生物技术有限公司；
全自动酶标仪购自瑞士Tecan公司；
共聚焦显微镜、荧光显微镜购自日本Olympus公司。
1.2 方法
1.2.1 PM2.5混悬液的制备 用无菌注射用水在超声波洗涤器中溶解PM2.5，每次摇晃洗脱45 min，连续3次，取洗脱液，12 000 r/min离心10 min，将沉淀冷冻干燥得到PM2.5干粉。然后用PBS溶解PM2.5干粉，高温蒸汽灭菌，定容100 mg/L，4℃冰箱冷藏，使用时稀释至所需浓度。
1.2.2 细胞处理Raw264.7巨噬细胞在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。细胞贴壁达90%后，用PBS洗涤2次。用一次性细胞刮轻轻将细胞刮离瓶底，1 000 r/min离心3 min，弃上清液。加入完全培养基并吹打混匀后传代培养。
1.2.3 实验分组 为检测PM2.5对Raw264.7巨噬细胞活性的影响，设置PM2.5浓度梯度分别为0、25、50、75、100 mg/L；
时间梯度分别为6、12、18、24、36、48 h，筛选最佳的作用浓度和时间。将传代培养24 h后的细胞随机分为以下6组进行处理：对照组（等体积PBS）、PM2.5组（PM2.550 mg/L）、Rap组（Rap 100µg/L）、HCQ组（HCQ 40 mg/L）、PM2.5+HCQ组（PM2.550 mg/L+HCQ 40 mg/L）和PM2.5+TAK-242组（PM2.550 mg/L+TAK-242 40µmol/L）。
1.2.4 细胞活性检测 对数期细胞接种在96孔板中，根据设定的浓度梯度，加入等体积的PM2.5混悬液与巨噬细胞共同孵育24 h；
另一孔板加入等体积的50 mg/L PM2.5悬浮液，按照上述时间梯度孵育不同时间。然后每孔加入10µL CCK-8溶液，在37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，同时设置对照孔组（含细胞、CCK-8而无PM2.5）和空白孔组（不含细胞）。用酶标仪测量450 nm处光密度（OD）值，再根据以下公式计算各组细胞活性：细胞活性=（PM2.5组OD-空白孔组OD）/（对照孔组OD-空白孔组OD）×100%。
1.2.5 透射电子显微镜显像 细胞离心后弃去培养液，加入电镜固定液4℃固定3 h，PBS漂洗3次，每次15 min，用1%的锇酸固定2 h，PBS漂洗3次，每次15 min，用乙醇进行梯度脱水（50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%），每次15 min，按照丙酮∶812包埋剂1∶1混合液渗透过夜，纯812包埋剂渗透过夜。60℃聚合48 h进行包埋，用超薄切片机切成60～80 nm的超薄切片；
2%醋酸铀饱和水溶液、枸橼酸铅染液各染色15 min，切片置于室温中干燥过夜。透射电子显微镜观察，采集图像并分析。
1.2.6 Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染细胞 在96孔板中接种Raw264.7细胞并添加新鲜培养基。当每个孔中的细胞占孔板的50%时，更换新鲜培养基。将Ad-mCherry-GFPLC3B分别加入Rap组和PM2.5组。同时设置无病毒细胞孔作为对照。感染约24 h后，除去含有病毒的培养基，每孔加入新鲜的完全培养基，继续培养24 h后观察细胞生长状态和荧光蛋白表达情况。mCherry是一种单体红色荧光蛋白，当它与绿色荧光蛋白（GFP）共标记LC3B时，GFP的绿色荧光被溶酶体的酸性环境淬灭，mCherry的红色荧光保留。因此，mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的表达可有效追踪自噬过程。Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染细胞后，细胞中没有自噬发生或只有低水平的自噬发生时，mCherry-GFP-LC3B在荧光显微镜下以主要以弥散黄色荧光（mCherry和GFP的联合效应）的形式存在于细胞质中；
当细胞中有较高水平自噬发生时，自噬小体形成，mCherry-GFP-LC3B在荧光显微镜下以黄色斑点的形式聚集在自噬体膜上；
当自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体时，由于GFP部分绿色荧光被溶酶体的酸性环境淬灭而以红色斑点的形式出现。
1.2.7 Western blot检测炎症及自噬相关蛋白表达 收集各组贴壁细胞和悬浮细胞后，用RIPA冰上裂解30 min，4℃、13 000×g离心5 min，收集上清液。BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。SDS-PAGE后转膜，用5%脱脂牛奶封闭。加入稀释的一抗：GAPDH抗体、TLR4抗体、NLRP3抗体、LC3抗体、p62抗体、LAMP2抗体、CTSB抗体，在4℃的水平振荡器上缓慢摇动孵育过夜。然后加入稀释的二抗，室温孵育2 h。使用电化学发光溶液进行发光显影，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标条带的OD值。
1.2.8 ELISA检测炎性因子分泌 按照ELISA试剂盒说明书，先将标准品梯度稀释后用于绘制标准曲线，再取细胞培养上清液，在4℃、3 500 r/min离心10 min后取上清液，适当稀释后用于检测IL-1β、IL-18、IL-10浓度，酶标仪检测波长450 nm处OD值，并通过标准曲线回归方程计算样本细胞因子浓度。
1.3 统计学方法 使用SPSS 28.0软件进行数据分析，GraphPad Prism 8进行绘图。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey检验，2组间均数比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 PM2.5对巨噬细胞活性的影响CCK-8检测结果显示，PM2.5分别为0、25、50、75、100 mg/L时，Raw264.7巨噬细胞的活性分别为100.0±1.6、86.8±3.2、74.5±1.9、59.7±2.4、45.9±2.6，PM2.5对Raw264.7巨噬细胞的活性影响具有浓度依赖性（F=231.916，P＜0.01）。浓度为50 mg/L PM2.5分别作用Raw264.7细胞6、12、18、24、36及48 h后，PM2.5暴露时间越长，巨噬细胞活性越低，见表1。后续选取最佳PM2.5浓度为50 mg/L，作用时间为24 h。
Tab.1 Comparison of the effect of PM2.5 on macrophage activity at different times between the two groups表1 2组不同时间PM2.5对巨噬细胞活性影响的比较（n=3，%，±s）
Tab.1 Comparison of the effect of PM2.5 on macrophage activity at different times between the two groups表1 2组不同时间PM2.5对巨噬细胞活性影响的比较（n=3，%，±s）
＊P＜0.05。
组别对照组PM2.5组t 0 h 100.0±1.1 100.0±1.6 0.292 6 h 99.0±1.2 91.0±2.0 1.345＊12 h 101.0±1.1 82.3±3.2 3.363＊18 h 100.0±1.4 67.0±2.4 4.178＊24 h 100.0±1.3 52.0±2.3 4.765＊48 h 100.0±1.2 41.0±2.8 5.193＊
2.2 PM2.5对巨噬细胞自噬的影响 与对照组相比，PM2.5组除可见自噬空泡（绿圈）外，还可见较多双膜自噬小体（红圈），其间可见未消化的胞浆成分及细胞器，而自噬溶酶体（蓝圈）较少见。见图1。
Fig.1 Observation of autophagy structure under transmission electron microscope(×8 000)图1透射电镜下观察自噬结构（×8 000）
2.3 荧光显微镜下PM2.5对巨噬细胞自噬流的影响Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染细胞结果显示，Merge后对照组细胞质中主要表现为黄色弥散荧光，Rap组中部分绿色荧光淬灭，Merge后黄色点状荧光少于红色点状荧光；
而PM2.5组绿色荧光淬灭不明显，Merge后黄色荧光点多于红色荧光点，见图2。PM2.5组黄红荧光比值（9.39±2.20）高于对照组（7.16±0.91）和Rap组（1.71±0.39，n=3，F=23.784，P＜0.01）。
2.4 PM2.5对巨噬细胞自噬相关蛋白的影响Western blot结果表明，与对照组相比，PM2.5组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB表达上调，而LAMP2表达下调（P＜0.05），见图3。
Fig.2 Changes of autophagy in Raw264.7 cells transfected with Ad-mCherry-GFP-LC3B图2 Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染后Raw264.7细胞内自噬情况的变化
Fig.3 Western blot detection of LAMP2,LC3,CTSB,p62 protein expression in each group图3 Western blot检测各组LC3、CTSB、p62、LAMP2蛋白表达
2.5 PM2.5及自噬对巨噬细胞炎症反应的影响HCQ组LC3Ⅱ/Ⅰ、p62表达高于对照组（P＜0.05），且NLRP3、IL-1β、IL-18表达增加，IL-10表达下降（P＜0.05）。而PM2.5抑制自噬的同时，也可促进巨噬细胞内NLRP3表达和IL-1β、IL-18的分泌，抑制IL-10分泌（P＜0.05）。当HCQ和PM2.5共同作用于巨噬细胞后，NLRP3、IL-1β、IL-18的增加和IL-10的下降较其他3组都更为显著（P＜0.05）。见表2、图4。
2.6 PM2.5通过TLR4影响巨噬细胞自噬和炎症反应 相较于对照组，PM2.5组TLR4表达增高（P＜0.05）。而在抑制TLR4后，相较于PM2.5组，PM2.5+TAK-242组LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB等自噬相关蛋白表达降低，LAMP2表达增加，并且NLRP3炎性小体和促炎因子IL-1β、IL-18分泌也有减少，抗炎因子IL-10表达增加（P＜0.05），见表3、图5。
Tab.2 Comparison of expressions of inflammatory factor levels between the four groups表2各组炎性因子表达水平比较（n=3，ng/L，±s）
Tab.2 Comparison of expressions of inflammatory factor levels between the four groups表2各组炎性因子表达水平比较（n=3，ng/L，±s）
＊＊P＜0.01；
a与对照组比较，b与PM2.5组比较，c与HCQ组比较，P＜0.05。
组别对照组PM2.5组HCQ组PM2.5+HCQ组F IL-1β 25.47±8.70 156.79±13.77a 124.09±11.46a 205.55±29.13abc 55.819＊＊IL-18 25.32±5.79 129.71±9.75a 106.57±9.13a 218.54±11.56abc 217.096＊＊IL-10 45.59±7.55 24.31±3.82a 19.32±3.40a 7.24±2.52abc 61.207＊＊
Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels after inhibition of TLR4 between the three groups表3抑制TLR4后各组炎症因子水平比较（n=3，ng/L，±s）
Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels after inhibition of TLR4 between the three groups表3抑制TLR4后各组炎症因子水平比较（n=3，ng/L，±s）
＊＊P＜0.01；
a与对照组比较，b与PM2.5组比较，P＜0.05。
组别对照组PM2.5组PM2.5+TAK-242组F IL-1β 25.54±8.70 157.19±11.84a 74.54±6.47ab 129.037＊＊IL-18 24.99±5.81 130.21±9.65a 72.56±7.53ab 132.806＊＊IL-10 46.11±7.56 23.10±4.12a 86.92±10.13ab 52.373＊＊
Fig.4 Western blot detection of expression levels of autophagy and NLRP3 protein图4 Western blot检测自噬蛋白、NLRP3蛋白表达
Fig.5 After inhibiting TLR4,the expression of autophagy and inflammation-related proteins detected by Western blot assay图5抑制TLR4后Western blot检测各组自噬和炎症相关蛋白表达
一些流行病学研究证据表明，PM2.5可增加心血管病的发病率和死亡率，人们长期暴露在PM2.5环境中，心血管疾病病死率可升高22%［10-11］。Gold等［12］研究发现，短期暴露于大量PM2.5中所导致的心血管疾病死亡率（69%）高于由其导致的呼吸系统疾病死亡率（28%）。而AS作为心血管疾病的病理基础，发病机制至今尚未完全阐明。研究表明，除已知的高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟等因素外，PM2.5也是导致AS发生的独立危险因素，并可影响粥样硬化斑块的稳定性［3］。但是PM2.5对AS的影响机制有待进一步完善。现有研究表明PM2.5致AS作用与其致炎效应有关［4,13-14］。巨噬细胞是AS的主要炎症细胞，且巨噬细胞的自噬能力与AS斑块的稳定性呈正相关［15］。因此，本实验从自噬的角度，以Raw264.7巨噬细胞为实验对象，从细胞及分子水平探讨PM2.5加重炎症反应的机制，为AS的防治提供新的理论基础。
3.1 PM2.5对巨噬细胞自噬的影响 自噬是细胞在自噬相关基因的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子的高度保守过程，主要过程包括吞噬泡-双膜自噬体-自噬溶酶体。自噬双层膜形成到自噬溶酶体降解的整个动态过程称为自噬流（通量）。LC3和p62被广泛用于自噬的基础研究。自噬形成时，LC3Ⅰ（胞浆型）向LC3Ⅱ（膜型）转化，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值可反映自噬小体形成的数量和自噬水平。自噬溶酶体形成障碍时，p62降解受阻而堆积，因此细胞内p62表达水平与自噬活性呈负相关。LAMP作为溶酶体膜的主要构成蛋白，可反映自噬小体与溶酶体的融合。有研究认为LAMP2缺失可阻碍自噬体与溶酶体的融合［16］。CTSB作为溶酶体的标志性酶蛋白，可反映溶酶体水解功能。既往研究表明，PM2.5可以诱导自噬的发生［17-18］，但是缺少PM2.5对自噬过程影响机制的研究。本实验以Raw264.7巨噬细胞为实验对象，探讨空气污染物PM2.5对巨噬细胞自噬的影响机制。结果显示，PM2.5对Raw264.7巨噬细胞的活性影响具有浓度和时间依赖性。且PM2.5刺激后的Raw264.7巨噬细胞内出现较多的自噬空泡及自噬小体，提示PM2.5可能诱发了巨噬细胞自噬的保护机制，但其中自噬溶酶体较少见，同时使用Ad-mCherry-GFP-LC3B转染巨噬细胞后，Rap组的绿色荧光淬灭较PM2.5组明显，Merge后PM2.5组黄红荧光比值高于对照组和Rap组，进而提示PM2.5虽然触发了巨噬细胞自噬，但下游自噬小体与溶酶体融合障碍，自噬流异常。Western blot结果也提示反映自噬水平的LC3Ⅱ/Ⅰ、p62以及反映溶酶体功能的CTSB表达增高，但是反映自噬小体与溶酶体结合的LAMP2表达下降。进一步说明PM2.5诱发巨噬细胞自噬，但阻断了自噬小体与溶酶体的融合。以上结果表明PM2.5对巨噬细胞自噬的影响机制是通过阻断自噬小体与溶酶体的融合，从而使自噬通量下游阻断，自噬流不完整，从而导致自噬功能障碍来实现的。
3.2 PM2.5影响下巨噬细胞自噬与炎症的相互作用NLRP3可在AS的病变中检出，抑制NLRP3可以抑制泡沫细胞的形成，其活化可造成粥样斑块的不稳定［19］。有研究发现Toll样受体（TLRs）与AS的形成密切相关［20］，而PM2.5可通过TLR4/MyD88/NFκB通路激活NLRP3炎症小体，促进泡沫细胞的产生和易损斑块的形成，从而促进AS的发生发展［3］。既往研究表明，自噬和炎性小体均参与了AS的发生发展［3,17］。炎性小体与自噬存在相互调节作用，自噬功能障碍可导致NLRP3炎性小体的激活，是炎性小体的重要调节器［21］。同时，炎性小体也可在自噬启动、LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化等方面调节自噬［22-23］。但目前尚无对PM2.5影响下巨噬细胞自噬与炎症相互影响的相关研究。
本实验结果显示，与对照组相比，PM2.5组TLR4、NLRP3和促炎因子IL-1β、IL-18表达增加，IL-10表达下降。这与现有的研究结果基本一致［24］，表明PM2.5可增加巨噬细胞炎症反应。但PM2.5增加炎症反应的具体机制不完全明确。本实验结果还显示，与对照组相比，PM2.5组和HCQ组的NLRP3、IL-1β和IL-18表达均增加，IL-10表达下降，提示PM2.5在抑制自噬的同时促进炎性小体和促炎因子的表达、抑制抗炎因子的表达；
表明PM2.5加重巨噬细胞炎症反应与其抑制自噬有关。进一步表明PM2.5作为致病因素进入循环系统后，影响巨噬细胞活性并诱发炎症反应，从而促发机体产生自噬这一保护机制，但阻断了下游自噬小体和溶酶体融合，从而影响巨噬细胞自噬通量及自噬功能，使包括炎性小体在内的自噬内容物降解受阻，进而加重巨噬细胞炎症反应。同时，与对照组、PM2.5组和HCQ组相比，PM2.5+HCQ组的NLRP3、IL-1β和IL-18的增加及IL-10的下降更显著，提示PM2.5和HCQ对巨噬细胞炎症反应的促进作用有叠加效应，暴露于PM2.5后进一步抑制自噬可加重巨噬细胞炎症反应。且PM2.5组TLR4表达高于对照组；
而与PM2.5组比较，PM2.5+TAK-242组TLR4、NLRP3、IL-1β及IL-18表达均下降，IL-10表达增加，而自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB表达也降低，LAMP2表达增加，表明抑制TLR4后PM2.5对自噬的抑制作用减弱，提示PM2.5抑制自噬的机制可能是由TLR4介导的。
综上，本实验结果表明，PM2.5可降低Raw264.7巨噬细胞活性，并具有浓度和时间依赖性；
PM2.5进入循环系统后可触发炎症反应诱导巨噬细胞发生自噬，但阻碍自噬小体与溶酶体融合，破坏自噬通量，从而使自噬内容物降解受阻，进而促进炎性小体活化和促炎因子的表达，诱发加重炎症反应，且该过程可能由TLR4所介导。由此，笔者推测PM2.5抑制自噬、加重巨噬细胞炎症反应可能是AS的发病机制之一，诱导自噬可能削弱PM2.5的致炎效应而对AS起保护作用。
