基于网络药理学探讨引火汤防治放射性损伤的作用机制
时间：2023-06-01 13:20:27 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
周立慧，张滢心，窦明杰，卢丹
（吉林大学药学院，吉林 长春 130021）
放射治疗（简称放疗）是治疗恶性肿瘤的方法之一，在肿瘤患者中，约有2/3的患者接受放疗[1]。放射治疗在杀灭肿瘤细胞的同时，所致的放射性损伤（radiation injury,RI）也在不断增加，破环机体免疫功能，抑制骨髓造血功能，影响患者生活质量[2]。放射性损伤的临床症状集中于神经系统、造血系统和消化系统等方面，可表现为神疲乏力、发热、头痛及食欲下降等，因照射部位不同，甚至出现腹胀腹泻和血便等症状[3]。目前，氧化损伤、细胞凋亡、炎症反应和免疫调节被认为是放射性损伤的发病机制[4]。西医治疗多采用大剂量抗生素及糖皮质激素[5]，疗效不甚理想，且毒副作用大[6]。
近年来，诸多研究证明，中医药在防治恶性肿瘤患者的放射性损伤方面具有独特优势。引火汤（Yinhuo Decoction,YHT）又称“傅山引火汤”，原为傅山所创，后传授于陈士铎，首载于陈士铎《辨证奇闻 咽喉门》，原方由熟地黄、麦冬、巴戟天、茯苓和五味子组成，用于治疗阴虚乳蛾[7]。根据中医理论，化疗属热邪[8]，放射性损伤的主要病因为机体“津血亏虚，邪热内生，阴虚则火旺，燥热难耐”[9]。方中熟地黄滋肾养阴，大补肾水；
巴戟天温肾助阳；
麦冬滋阴润肺，清上焦之浮热；
五味子补肾中之阴，收敛上升之阳；
茯苓通利水道及三焦通路，有协调上下阴阳之功效[10]。因此引火汤以清热解毒、凉血散瘀和益气养阴为主要治法，具有独特优势[11]。引火汤作为临床常用方，其疗效已得到临床广泛验证[12]，引火汤全方用药精当，立意明确，通过滋阴以降虚火，引火归元以协调阴阳，可以缓解阴虚火旺导致的诸多证候[13]。李可[12]将引火汤用于晚期肿瘤患者，服用两剂引火汤即能消退放、化疗后所导致的头面生火、面红目赤和口舌生疮。胡凯文[14]常用引火汤治疗不耐手术、放化疗攻伐的恶性肿瘤患者，临床颇具疗效。李自全[15]用引火汤治疗放射性口腔咽部炎症41例，与对照组相比，观察组有效率为92.68%（38/41），而对照组为70.73%（29/41）。可见，引火汤方用于防治放射性损伤临床疗效确切，但其作用机制尚无报道，本文基于网络药理学分析引火汤防治放射性损伤的机制，为其用于防治放射性损伤提供更多理论支持。
1.1 YHT的活性成分筛选及靶点预测
熟地黄、巴戟天、茯苓和五味子的化学成分借助TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php） 数据库检索，麦冬的成分通过BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）进行检索，保留综合评分≥20和P＜0.5的成分。从上述来源收集的药材成分中筛选出口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的活性成分，为YHT的活性成分。此外，结合文献检索补充YHT组方药材中的有效活性成分，并结合文献将不满足筛选条件但公认的具有药效的化学成分进行进一步补充，获得候选化合物。利用Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ）获得活性成分的SMILES结构，并将其上传至SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch） ，限定物种为“Homo sapiens”以置信度阈值（Probility）评估预测结果的可靠性，并设置“Probility≥0.1”为筛选条件，从而获得与潜在活性成分相关的靶点。
1.2 RI疾病靶点的筛选
在GeneCard（shttps://www.genecards.org/）与OMIM数据库（https://omim.org） 中搜索关键词“radiation injury”查找与RI相关的靶点，合并上述数据库的结果并进行去重。利用生物信息学与进化基因组学（Bioinformatics&Evolutionary Genomics）在线软件作图工具平台Venny（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）进行映射，取YHT潜在靶点与RI相关靶点的交集，得到药物与疾病的共同靶点。
1.3“中药 活性成分 作用靶点”网络的构建
将1.1所收集的中药活性成分与1.2所筛选交集靶点导入Cytoscape 3.7.1软件进行拓扑分析，构建中药 活性成分 作用靶点网络。
1.4 蛋白相互作用（PPI）网络的构建
将交集靶点导入STRING数据库（https://cn.stringdb.org）中，种属选择“Homo sapiens”，置信度0.7，将TSV文件导入软件Cytoscape 3.7.1分析节点信息，采用Cytoscape 3.7.1软件插件CytoNCA对蛋白相互作用网络进行拓扑分析，筛选DC、BC、CC及EC均大于中位数的靶点，为核心靶点。
1.5 GO及KEGG通路富集分析
应用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn）进行可视化GO分析，包括生物过程（biological process,BP）、细胞组分（cellular compont,CC）、分子功能（molecular function,MF）以及KEGG通路分析。
1.6 核心活性成分与靶点的分子对接
选取度排名前5位的核心靶点与度值较高的中药活性成分，使用基于Autodock Vina内核在线分子对接工具CB-Dock（http://clab.labshare.cn/cb-dock/）对核心靶点和作用于这些靶点的成分进行分子对接。靶点蛋白的晶体结构从PDB数据库（http://www.rcsb.org/pdb/）获取，保存为.pdb格式，化合物的2D结构，格式为.SDF。
2.1 YHT活性成分及作用靶点
通过TCMSP数据库和BATMAN-TCM数据库检索，共得到YHT活性成分423个，其中熟地黄76个、巴戟天174个、麦冬22个、茯苓21个以及五味子130个，按OB≥30%和DL≥0.18，经筛选、剔除无靶点成分及文献进行补充后共得到活性成分34个，其中熟地黄3个、巴戟天14个、麦冬3个、茯苓11个以及五味子5个，得到所有潜在活性成分预测靶点612个，YHT活性成分靶点排名前5的核心活性成分信息见表1，结构式见图1。
表1 YHT核心活性成分信息Table 1 YHT core active ingredient information
图1 YHT核心活性成分结构式Fig.1 Structural formula of YHT core active ingredients
2.2 RI疾病靶点
通过GeneCards搜索得到5 833个，按score≥2倍中位数得到与RI有关的靶点数目为1 460个，OMIM搜索得到11个，合并去重后共得到1 462个RI疾病靶点。运用Venny图将潜在活性成分作用靶点与RI疾病靶点合并后取交集，最终获得248个YHT防治RI的靶点，见图2。
图2 YHT防治RI的交集靶点Fig.2 Intersection targets of YHTfor preventing and treating of RI
2.3 中药 活性成分 作用靶点网络分析
利用Cytoscape 3.7.1软件构建中药 活性成分作用靶点图，共得到287个节点，1 058条作用关系，结果见图3。其中活性成分以“degree”值来表示，中药活性成分排名前5位的有五味子醇乙（Gomisin-A,degree=61）、五味子酯乙（Schizandrer B，degree=58）、五味子丙素（Wuweizisu C，degree=57）、啤酒甾醇（Cerevisterol，degree=57）和戈米辛G（Gomisin G，degree=55）。
图3 YHT“中药 活性成分 作用靶点”图Fig.3 YHT diagram of"Traditional Chinese Medicines Active ingredients Action targets"
2.4 PPI蛋白互作网络
将蛋白靶点导入STRING数据库，将结果导入Cytoscape软件中，利用CytoNCA分析，根据各参数中位值进行筛选，分别为DC＞11、BC＞110.161 33、CC＞0.399 67和EC＞0.026 08，发现关键靶点43个，取排名前10的靶点，见表2，筛选策略见图4。排名前5的靶点预测为核心靶点，包括SRC、HSP90AA1、STAT3、EGFR和AKT1。
图4 核心靶点的筛选Fig.4 Screening of core targets
表2 PPI互作网络核心靶点Table 2 PPI interaction network core targets
2.5 GO及KEGG富集分析
GO富集分析得到1 127个条目，根据P＜0.01筛选出588条GO分析结果，分别根据靶点富集数目的多少进行排序，筛选出排名前10个结果，见图5。包括434个BP条目，主要涉及蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）、凋亡过程的负调节（negative regulation of apoptotic process）、药物反应（response to drug）、正向调节细胞增殖（positive regulation of cell proliferation）和肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）；
53个CC条目，主要涉及等离子体膜（plasma membrane）、胞液（cytosol）、质膜的组成部分（integral component of plasma membrane）、细胞表面（cell surface）和胞质核周区（perinuclear region of cytoplasm）；
101个分子功能MF条目，主要涉及蛋白结合（protein binding）、ATP结合（ATP binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、酶结合（enzyme binding）和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）。
图5 GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis
同时，以P＜0.01作为条件进行筛选，共富集到121条KEGG通路，并筛选出靶点富集数目排名前20的结果，见图6。将通路与成分及靶点结合起来，进行了可视化，绘制了成分 靶点 通路图，见图7。分析结果表明，YHT防治RI的靶点主要涉及的通路有癌症通路（Pathways in cancer）、PI3K-Akt通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌症蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、粘着斑（Focal adhesion）、前列腺癌（Prostate cancer）、Rap1信号通路（Rap1 signaling pathway）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B）和HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）等。
图6 KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis
图7 YHT“成分 靶点 通路”图Fig.7 YHT"compound target pathway"diagram
2.6 分子对接验证
为了验证YHT核心活性成分对其干预疾病潜在靶点作用的可能性，选取核心靶点SRC、HSP90AA1、STAT3、EGFR和AKT1与作用于核心靶点的小分子配体进行分子对接，靶点蛋白与分子的结合能力用Vina对接分数衡量，值越低，表明受体和配体亲和力越高。可见，对接分数均小于 5.0，其中啤酒甾醇（FL4）与HSP90AA1（PDB ID:3o0i），对接分数为 9.8，戈米辛G（WWZ4）与HSP90AA1（PDB ID:3o0i），对接分数为 8.8，结果见表3。
表3 核心活性成分与靶点分子对接分数Table 3 Docking fractions of core active ingredients and target molecules
通过分子模拟分析推测核心活性成分与靶点相互作用情况，见图7。可见，化合物与靶点之间存在氢键-相互作用和疏水堆积等分子间结合力。啤酒甾醇与天冬酰胺-51（N51）残基形成氢键，结合能力强，对稳定小分子配体有着重要作用；
戈米辛G与亮氨酸-107（L107）残基和酪氨酸-139（Y139）形成氢键，与苯丙氨酸-138（F138）的苯环形成了-相互作用，其余的氨基酸残基与化合物的疏水环形成强的相互作用，这些氢键及疏水作用的存在可以使化合物与靶蛋白形成稳定的结合。
图8 化合物与HSP90AA1的分子对接模拟Fig.8 Molecular docking simulation of the compound with HSP90AA1
通过“中药 活性成分 潜在作用靶点”分析表明，五味子醇乙、五味子酯乙、五味子丙素、啤酒甾醇和戈米辛G可能是引火汤防治放射性损伤的核心活性成分。五味子醇乙、五味子酯乙、五味子丙素和戈米辛G属于木质素类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌及抗纤维化等活性[16]。五味子丙素和五味子醇乙还可以通过上调巨噬细胞炎症蛋白-1和粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子，发挥免疫调节作用[17]。戈米辛G通过降低Akt的磷酸化水平，抑制PI3K-Akt信号通路，抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡[18]。啤酒甾醇可降低促炎性细胞因子（如TNF-、IL-6）的表达及抑制MAPK/NF-B/AP-1通路来减轻炎症[19]。因此，木质素类化合物在防治放射性损伤方面的活性值得关注。
综合分析，推测SRC、HSP90AA1、STAT3、EGFR和AKT1是引火汤防治放射性损伤的核心靶点。SRC是第一个被确认的原癌基因[20]，调节细胞增殖、生长、迁移、分化和死亡。SRC抑制剂通过抑制SRC可以保护小鼠免受辐射诱导的损伤[21]，并诱导细胞周期停止来持续抑制细胞增殖，达到抗肿瘤的作用[22]。HSP90AA1是热休克蛋白家族的分子伴侣之一，可以调节雌激素受体的活动，参与细胞凋亡，发挥免疫调节作用，保持细胞稳态[23]，同时参与调节PI3K-Akt信号通路，调节生物修复过程的功能，提高细胞对辐射应激的耐受性，发挥抗辐射作用[24]。在各种类型的DNA损伤中，DNA双链断裂是最危险的因素[25]，EGFR通过激活DNA-PKcs促进造血干细胞DNA修复和造血再生[26]。STAT3是信号转导与转录因子家族成员之一，已经证明与细胞自噬有关，通过诱导KAP1的降解，激活STAT3使BRCA1的表达上调，从而促进骨髓造血细胞修复辐射引起的DNA损伤[27]。抑制STAT3能够减少抗凋亡蛋白的表达，导致细胞死亡，增加肿瘤的放射敏感性[28]。AKT1是AKT激酶之一，激活AKT1的突变体可使辐射后耐受性增加，提高辐射后的细胞生存率，并加速DNA修复，促进电离辐射的抵抗力[29]。上述靶点均可作为引火汤防治放射性损伤的核心作用靶点。
通过KEGG通路分析，可以看出，引火汤防治放射性损伤的作用机制是通过多通路的协同作用。引火汤防治放射性损伤的通路相关性最高的是癌症通路、PI3K-Akt通路和HIF-1信号通路等。AKT1是PI3KAkt通路中的重要蛋白，PI3K-Akt通路在肿瘤细胞中异常激活，具有促进肿瘤细胞恶性增殖和侵袭转移能力，并且在肿瘤的化学治疗耐药和放射治疗抗拒中起着非常重要的作用[30]。PI3K-Akt依赖性途径对辐射损伤后有保护作用或促进再生，AKT途径的失活会减少细胞增殖，使细胞的DNA修复能力下降，导致辐射诱导的细胞凋亡增加，而AKT途径的激活则产生了相反的结果[31,32]。HIF-1是缺氧诱导因子，HIF-1或其下游转录物能够对辐射诱导的血管损伤提供保护，或促进其恢复[33]。
综上所述，引火汤中的五味子醇乙、五味子酯乙和五味子丙素等活性成分作用于SRC、HSP90AA1和STAT3等靶点，通过调控PI3K-Akt和HIF-1等信号通路防治放射性损伤。本研究采用网络药理学方法初步阐述了引火汤防治放射性损伤的潜在活性成分、作用靶点和发挥药效的关键生物学通路，从分子水平揭示了可能的作用机制。为以引火汤方为基本方进行放射损伤防治提供了更多理论支持，也为开发利用引火汤方提供理论依据。
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