多肽类ACE,抑制剂的设计合成及生物活性

周佳琪，马春燕，李晓晖,*

（1.大连理工大学生物工程学院，辽宁 大连 116024；
2.大连理工大学化工学院，辽宁 大连 116024）

高血压是一种高发性心血管疾病，全世界近10 亿人患有高血压，预计到2025 年，高血压患病人数将达到15.6 亿[1-2]。在血压复杂调节网络中，血管紧张素I 转换酶（angiotensin converting enzyme, ACE,EC 3.4.15.1）作为一种关键酶，通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin system, RAS）和激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system, KKS）参与血压调节[3-4]。在RAS 中，ACE 可催化血管紧张素I 转化为能够使血管收缩的血管紧张素II[5]，而在KKS 中，ACE 能够切割缓激肽C-端的二肽残基，导致其失去血管扩张的功能，造成血压升高[6-7]。因此，抑制ACE 一直是治疗高血压的一种有效方法。目前市面上已有降压药，降压效果强，但在服用后往往会对人体产生副作用[8-10]。然而，具备ACE 抑制功效的生物活性肽由于分子量小，易吸收，无毒副作用，安全性高等特点[11-12]，具有研发降压药物的潜力。

ACE 是一种锌金属蛋白酶，具有C-端和N-端两个功能结构域，C-端结构域包括3 个催化活性位点S1、S1’和S2，S1 活性口袋包含Ala354、Glu384和Tyr523；
S2 包含Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520；
S1’包含Glu162，三个位点均具备疏水性特征[13]。大多数ACE 抑制肽都作用于其C-端结构域[14]，ACE抑制肽序列中疏水氨基酸残基的含量，在一定程度上决定了其ACE 抑制活性[15]。ACE 的3 个活性位点有各自亲和的氨基酸残基，S1 亲和Pro 和芳香族氨基酸；
S1’亲和Val、Ala 和Leu；
S2 亲和Ile[16-17]。多肽C-末端3 个氨基酸残基的改变对ACE 抑制活性影响较大[18]。研究表明多肽C-末端第2 个氨基酸为Lys 或Arg 时对ACE 的抑制活性会有所提高[19-20]。此外，当多肽的N-端含疏水性氨基酸Ala、Leu、Ile 和Val 时，能够促进多肽与ACE 催化活性位点的结合。

目前，合成得到的许多多肽类ACE 抑制剂已被证明具有良好的ACE 抑制活性，例如，Ashok 等[21]使用固相合成法合成了水牛初乳蛋白中的ACE 抑制肽GIPLPLI（IC50为74 μmol/L）。Mirzaei 等[13]通过固相合成4 种YR-10（YGKPVAVPAR，来源于酿酒酵母蛋白）的多肽类似物，筛选出较YR-10 ACE抑制活性更高YHR-10（YGKHVAVHAR），并进一步研究了合成肽YHR-10 的结构与功能关系，发现通过除去YR-10 N-末端的Tyr 和C-末端的Arg 得到的GA-8（GKPVAVPA），ACE 抑制活性降低了3.31倍。此外，Deng 等[22]设计了10 种抗氧化肽LWHTH（来源于海鞘组织）的多肽类似物，经过固相合成得到的多肽类似物CWHTH 不仅具备抗氧化活性，还发现其对ACE 表现出了良好的抑制作用。

虽然近年来已有大量动物源ACE 抑制肽被分离鉴定，但大量抑制肽仍具有提升ACE 抑制活性的空间。定向改造多肽不仅能够发掘高活性多肽，也可以了解多肽性质与功能的联系。丙氨酸扫描文库技术是一种有价值的方法，已被广泛应用于多肽的构效关系研究中[23]。同时，随着生物信息学的快速发展，大量的多肽信息被储存于数据库中并且建立了多肽分析及活性预测工具，利用这些工具可以快速筛选生物活性肽。

本研究前期从猪血红蛋白源多肽（Pig Hemoglobin Peptide, PHP）中筛选出了2 条ACE 抑制肽：PHP1（VVYPWT）和PHP2（TKTYFPHF），IC50分别为7.42 和5.33 μmol/L[24-25]，具备较高的ACE 抑制活性，但这2 条ACE 抑制肽的构效关系尚未明确。因此，本文以PHP1 和PHP2 作为研究母肽，利用丙氨酸扫描文库技术结合生物活性预测工具对研究母肽进行定向改造，设计新型多肽类ACE 抑制剂，筛选高ACE 抑制活性多肽，研究多肽序列中氨基酸疏水性、带电性及空间位阻等性质对其活性的影响，探索构效关系，同时发掘具备多种生物活性的ACE 抑制肽，为开发多功能性的多肽产品提供新的思路。

1.1 材料与仪器

Fmoc-Thr（tBu）-王树脂、Fmoc-Phe-王树脂、Fmoc-氨基酸、Boc-氨基酸、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（O-Benzotriazole-N,N,N",N"-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate, HBTU）、1-羟基苯并三唑（1-Hydroxybenzotriazole, HOBt）、N，N’-二异丙基乙胺（N,N"-Diisopropylethylamine, DIEA）、三异丙基硅烷（Triisopropylsilane, TIS） 吉尔生化（上海）有限公司；
乙腈 色谱纯，美国TEDIA；
血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE，源自兔肺，酶活力≥2.0 U/mg 蛋白）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰基]-Phe-双甘氨酸（N-[3-（2-furyl）acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine, FAPGG）

Sigma 公司；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-（2-hydroxyethyl） piperazin-1-yl]ethanesulfonicacid, HEPES）

阿拉丁试剂有限公司；
α-葡萄糖苷酶（酶活力1 kU/13.2 mg） 北京索莱宝科技有限公司；
4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,p-NPG） 上海源叶生物科技有限公司；
总抗氧化能力试剂盒 上海碧云天试剂有限公司；
其他试剂均为国产分析纯。

岛津LC-20A 型高效液相色谱仪、岛津LC-20AP制备型高效液相色谱仪 日本岛津公司；
YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×150 mm，粒度5 μm）分析色谱柱日本YMC 公司；
Agilent ZORBAX SB-C18（21.2 mm×150 mm，粒度5 μm）制备色谱柱、Agilent 1260/6130 型液质联用仪 美国Agilent 公司；
HXGL-10-50B 型冷冻干燥机 上海沪析实业有限公司；
Molecular Devices 多功能读板机 美国Thermo 公司；
100 mL G-2 固相合成反应管 日本Cosumosubiido 株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 多肽类似物的设计及生物信息学分析

1.2.1.1 多肽类似物的设计 利用丙氨酸扫描文库技术结合生物活性预测工具PeptideRanker 筛选母肽PHP1 及PHP2 的可突变位点。根据氨基酸的疏水性、带电性和空间位阻，将母肽PHP1 及PHP2 序列中部分氨基酸残基进行替换，设计多肽类ACE 抑制剂类似物序列。

1.2.1.2 多肽类似物的生物信息学分析 多肽的理化性质预测：使用ExPASy（https://www.expasy.org/）的ProtParam 分析工具分析多肽的各项理化参数，包括理论等电点、净电荷、疏水性残基比率、半衰期[26]等。

多肽的生物活性、毒性预测：利用BIOPEPUWM（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/）的Bioactivity prediction 模块中的AHTpin 平台预测设计的多肽类似物是否具备ACE 抑制活性[27]。利用Bioware 生信分析工具（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/）的PeptideRanker 模块预测多肽的潜在生物活性[28]。利用ToxinPred 数据库（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/index.html）预测多肽的毒性[29]。

1.2.2 多肽的固相合成及纯化

1.2.2.1 固相合成目标肽 利用固相合成法合成目标肽，多肽链C-末端的氨基酸（amino acid，aa）固定于王树脂（即Fmoc-aa-王树脂），以该氨基酸的氨基端作为合成起点，根据多肽从C-端到N-端的合成顺序，通过氨基酸间的脱水缩合使下一位氨基酸偶联到树脂上，直到目标肽N-末端最后一个氨基酸反应完为止，实现将目标肽链连接到树脂上，随后切割树脂，得到目标肽。具体合成步骤如下：

溶胀Fmoc-aa-王树脂：取1 g Fmoc-aa-王树脂，装入固相合成器中，移取15 mL 二氯甲烷（Dichloromethane, DCM）加入其中等待15 min，使树脂得到充分膨润，随后抽滤除去DCM。

脱除氨基保护基Fmoc：加入15 mL 体积分数为20%的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）搅 拌 反 应30 min 后 抽 滤，用DCM 和异丙醇反复洗涤并抽干，取出微量树脂，通过Kaiser 法检测树脂颜色变化，以此来监测反应进程，若树脂呈现蓝紫色，说明Fmoc 已除去，氨基酸的氨基暴露，可进行下一步反应。

目标肽的产生：将Fmoc-氨基酸（2 eq）和缩合试剂HBTU（2 eq）、HOBt（2 eq）依次溶于DMF 中，加入到固相合成器中，加入氨基酸活化试剂DIEA（4 eq），搅拌反应1.5 h，经DCM 和异丙醇洗涤，参照Kaiser 法[30]监测反应进程，由此实现肽链的延长。重复上述脱除Fmoc 和肽链延长步骤过程，直至接入目标肽N-末端最后一个由Boc/Fmoc 保护的氨基酸，至此侧链及N-端保护的目标肽连接到了树脂上。若最后一个氨基酸由Fmoc 保护，则先脱除Fmoc，再进行下一步操作。

树脂及保护基的切割：将合成完毕的肽链-树脂用15 mL DCM 溶胀后抽滤，加入15 mL 三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）/TIS/H2O（体积比 95:2.5:2.5），常温下反应1.5～2.5 h，取出反应液旋蒸干燥，倒入冰乙醚结晶，待乙醚挥发完全加入甲醇溶解样品，旋蒸干燥后加入冰乙醚再次结晶，取沉淀减压干燥，得到多肽粗品。

1.2.2.2 目标肽的纯化 RP-HPLC 制备精制：ZORBAX SB-C18制备色谱柱，流动相A：0.1% TFA/水，B：0.1% TFA/乙腈；
洗脱条件：流动相B 在0～20 min，梯度变化为30%～80%；
220 nm 波长检测，流速20.0 mL·min-1；
进样0.5 mL，柱温30 ℃。产物经真空冷冻干燥处理后经质谱鉴定分子量。

RP-HPLC 纯度分析：YMC-Pack ODS-A 分析色谱柱，流动相A：0.1% TFA/水，B：0.1% TFA/乙腈；
洗脱条件：流动相B 在0～15 min，梯度变化为30%～80%；
检测波长220 nm，流速1.0 mL·min-1；
进样10 μL，柱温30 ℃。

1.2.3 多肽的体外生物活性测定

1.2.3.1 ACE 抑制活性测定 根据文献[31]的方法测定ACE 抑制活性。首先，FAPGG 用含有300 mmol/L NaCl 的80 mmol/L HEPES 缓冲液（pH8.3）配制成1 mmol/L 的溶液。精确称取多肽样品4 mg，用缓冲液配制成2000 μg/mL，稀释到400、80、16、3.2、0.64 μg/mL 不同浓度，取这6 个浓度梯度的样品溶液进行实验，做3 组平行。取40 μL 样品和50 μL FAPGG 溶液混匀，随后加入10 μL 的ACE 溶液（0.1 U/mL），立即置于340 nm 下检测吸光度，随后放入培养箱，37 ℃下孵育，待反应30 min 后再次检测吸光度。HEPES 缓冲液作为空白对照组，在同等条件下测定反应前后吸光度差值。计算对ACE 的抑制率达到50%时的多肽浓度IC50，ACE 抑制率的计算公式如下：

式中：A 为样品组反应前后的吸光度差值；
B 为空白对照组反应前后吸光度差值。

1.2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定采用优化的Xu 等[32]的方法。精确称取多肽样品4 mg，用PBS 缓冲液配制成2000 μg/mL，稀释到1000、100、10、1、0.1 μg/mL 不同浓度，取这6 个浓度梯度的样品溶液进行实验，做3 组平行。取20 μL p-NPG 溶液（9 mmol/L）与20 μL样品溶液混匀，37 ℃下孵育10 min，随后加入20 μLα-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL），37 ℃下反应20 min，反应结束后立即加入150 μL Na2CO3溶液（0.1 mmol/L）终止反应，于405 nm 处测定吸光度。采用下方公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率：

式中：A1为样品、酶和p-NPG 混合液的吸光值；
A2为缓冲液代替样品溶液的吸光值；
A0为缓冲液代替酶溶液后混合物的吸光值。

1.2.3.3 抗氧化活性测定 采用ABTS 法[22]表征多肽样品的抗氧化活性，具体操作方法参照总抗氧化能力试剂盒的说明。储备溶液包括ABTS 溶液和氧化剂溶液，将两者等量混合，室温避光存放16 h 得到ABTS 工作母液，用80%乙醇稀释得到ABTS 工作液，于734 nm 下测定吸光度（工作液吸光值-空白对照吸光值=0.7±0.05）。用80%乙醇将多肽样品配制成1 mg/mL 的溶液。将200 μL ABTS 工作液加入96 孔板的检测孔中，随后加入10 μL 样品溶液并混匀，室温孵育2～6 min，测定A734。蒸馏水作空白对照，Trolox 作阳性对照。ABTS 自由基清除率计算公式如下：

式中：A 为加入样品和ABTS 的吸光值；
B 为不加样品，加入ABTS 的吸光值。

1.2.4 多肽与ACE 的分子对接 从PDB 数据库中下载ACE-Lisinopril 复合物的晶体结构（PDB ID：1O8A），使用Pymol 软件对其进行预处理，删除Lisinopril 配体，去水，加氢，得到ACE 蛋白分子。使用ChemBioDrawUltra 14.0 绘制多肽分子，之后利用ChemBio 3D Ultra 14.0 对多肽进行能量最小化处理，得到多肽小分子空间构象。利用AutoDock Vina 软件打开处理过的ACE 大分子和多肽小分子，将其分别设置为受体和配体，设置对接盒子，选择半柔性对接方式，进行20 次对接。分析对接结合能，选取对接结果中的最佳构象，使用Pymol 软件和Protein-Ligand Interaction Profiler 在线工具进一步分析。

1.3 数据处理

采用软件SPSS 16.0 对实验数据进行分析处理，数值用均值±标准差表示，每个试验平行三次。

2.1 多肽类似物的设计

以ACE 抑制肽PHP1 和PHP2 为研究母肽，对PHP1 和PHP2 进行丙氨酸扫描，即用丙氨酸逐一替换多肽序列中的非丙氨酸残基，构建丙氨酸扫描文库。得到的14 种多肽片段通过PeptideRanker 进行生物活性预测，发现PHP1 序列第3、4、5 位的Tyr、Pro、Trp 和PHP2 序列第4、5、6、8 位的Tyr、Phe、Pro、Phe 分别用Ala 替换后，预测活性明显降低，说明母肽序列中处于这些位置的原氨基酸残基改变可能会导致其活性的降低甚至丧失。因此，本研究在设计新型多肽类ACE 抑制剂时，保留母肽序列中这些位置的氨基酸残基，改变其他位置的氨基酸残基，设计的19 个多肽类似物见表1。

表1 PHP1、PHP2 及其类似物的序列Table 1 Sequence of PHP1, PHP2 and their analogues

优化PHP1 第1、2、6 位氨基酸残基：将母肽PHP1 序列中第1 和2 位Val 残基替换为带巯基的Cys，分别得到多肽类似物PHP1A-1 和PHP1A-2；
将母肽PHP1、PHP1A-1 和PHP1A-2 序列中的C-端Thr 残基替换为强疏水性的芳香族氨基酸Phe，分别得到PHP1A-3、PHP1A-4 和PHP1A-5；
在PHP1A-3 基础上，将序列中第1、2 位的Val 残基，分别用空间位阻小的Gly 和Ala 替换，得到PHP1A-6 和PHP1A-7。

优化PHP2 第1、2、3、7 位氨基酸残基：将母肽PHP2 序列中第3 位的Thr 残基变为疏水性强的Leu，得到PHP2A-1；
将PHP2A-1 中的第1 位Thr 残基替换为疏水性强的Ile 和Ala，分别得到PHP2A-2 和PHP2A-3；
在PHP2A-2 和PHP2A-3 基础上，将序列中第2 位带正电荷的Lys 残基替换为不带电荷且具有疏水性的Ala，得到PHP2A-4 和PHP2A-5；
将PHP2A-5 序列第7 位带正电荷的His 替换为不带电荷的Leu，得到PHP2A-6；
将PHP2A-3 序列第3 位的Lue 替换为Ala，第7 位的His 残基用带有胍基的Arg 替换，得到PHP2A-7；
将PHP2A-3～PHP2A-7 中的Ala 残基替换为侧链更小的Gly，得到PHP2A-8～PHP2A-12。

2.2 多肽的理化性质

PHP1 和PHP2 及多肽类似物的各项理化性质如表2 所示。PHP1 系列的等电点均在5.5 左右，PHP2 系列的等电点在5.5～10 之间。总平均亲水性指数（GRAVY）是多肽中氨基酸残基亲水值总和的平均值，正值越大疏水性越强，负值越大亲水性越强，PHP1 及类似物都是疏水性多肽，PHP2 系列中，PHP2A-12 亲水性最强，PHP2A-6 疏水性最强。脂肪族氨基酸指数（Aliphatic index）可作为多肽的热稳定性指标，指数越高热稳定性越高，PHP1、PHP1A-3、 PHP2A-2、 PHP2A-4、 PHP2A-6、 PHP2A-9 及PHP2A-11 的热稳定性相对较高。非稳定性指数（Instability index）是多肽稳定性的参考数值，指数＜40 被定义为稳定性多肽，除PHP2A-11 外，其余序列均为稳定性多肽。半衰期（Half-life）预测结果表明N-端氨基酸残基的改变对多肽在细胞内的半衰期影响较大，C-端氨基酸残基改变对其影响较小。

PeptideRanker 预测得出的生物活性分数代表了多肽具备生物活性的可能性大小，阈值为0.5，即任何预测超过0.5 阈值的多肽都被认为具备潜在的生物活性，预测结果显示多肽类似物均具有潜在的生物活性，且绝大多数肽具有较高的活性分数，结果见表2。此外，AHTpin 平台预测设计的多肽类似物均具备ACE 抑制活性，ToxinPred 预测所有设计的多肽均没有毒性。

表2 PHP1、PHP2 及其类似物的理化性质Table 2 Physicochemical properties of PHP1, PHP2 and their analogues

2.3 多肽的合成纯化与体外生物活性

如表3 所示，通过多肽固相合成法合成了母肽及其类似物，并通过反相高效液相进行了分析及纯化，目标多肽经纯化后的纯度均在95%以上。经质谱确定目的多肽分子量与理论分子量一致。

母肽PHP1、PHP2 及其多肽类似物的ACE 抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性结果如表3 所示。

表3 合成肽的生物活性Table 3 Bioactivity of synthetic peptides

ACE 抑制活性结果表明PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4、PHP2A-7 的抑制活性最高，IC50分别为3.87、3.33、2.86 和4.58 μmol/L，PHP1A-6、PHP2A-7 与母肽活性相比差异显著（P＜0.05），PHP2A-3、PHP2A-4 与母肽活性相比差异极显著（P＜0.01），它们的抑制活性比母肽高2～3 倍；
PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1 和PHP2A-10 具有同母肽相当的抑制活性。多肽类似物改变N-端氨基酸残基会导致抑制活性发生较大变化，Liu 等[33]指出多肽N-端氨基酸的改变会影响食物来源ACE 抑制肽的活性。在PHP1 系列设计肽中，N-端使用疏水性更弱的Cys 替换Val（PHP1A-1、PHP1A-2），衍生肽活性与母肽相比显著降低；
在PHP2 系列设计肽中，N-端Thr 和Lys 替换成疏水性更强的Ile 或Leu 或Ala得到的PHP2A-1、PHP2A-3、PHP2A-4 有较高的ACE 抑制活性。表明疏水性对不同多肽ACE 抑制活性会产生不同的影响，在多肽序列N-端含有Val、Leu、Ala、Ile 等疏水性氨基酸时，多肽与ACE 活性中心的结合效率有所增强，从而增加了对ACE 的抑制活性[34]。

PHP1 系列设计肽中，N-端氨基酸Val 用空间位阻小的Gly 或Ala 替代后具有高ACE 抑制活性；
而在PHP2 系列设计肽中，N-端氨基酸Thr 或Lys 用空间位阻小的Gly 或Ala 替代后仍能够保持良好的ACE 抑制活性，体现了多肽中氨基酸空间位阻的变化对ACE 抑制活性有影响[35]。PHP2 系列多肽带电性与ACE 抑制活性没有明显的相关性。

多肽C-端氨基酸的改变也会对活性产生影响。当酪蛋白和羊奶乳清提取多肽的C-端三个氨基酸中存在Pro 时，会提高其ACE 抑制活性[36]，芳香族氨基酸Phe、Tyr、Trp 的存在也会增强多肽对ACE 的抑制作用[37]。本研究设计多肽的C-端三肽中保留了原有的Pro 或将C-端的Thr 替换为Phe 后，设计肽仍能保持与母肽相当的活性。此外，PHP2 序列中的His 替换为Leu 会降低ACE 抑制活性，PHP2A-7 中Arg 的引入对其活性产生了积极影响。本研究发现C-端第二位为His 或Arg 时对多肽的ACE 抑制活性有着非常重要的作用，原因可能是His 的咪唑环和Arg 的侧链胍基的存在会更有利于多肽与ACE 的结合[13]。

综上所述，多肽序列中氨基酸残基的疏水性、空间位阻及其序列中位置对其ACE 抑制活性影响较大。

α-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，母肽及其多肽类似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性与PeptideRanker预测活性接近。母肽PHP1 的α-葡萄糖苷酶抑制作用不明显，PHP2 的抑制活性IC50为296.79 μmol/L。PHP1 系列多肽类似物抑制活性较母肽都有明显提高，其中，PHP1A-3 和PHP1A-7 的IC50分别为3.09，9.51 μmol/L，它们具备高活性的原因分析是肽段C-端含有的Phe 增加了多肽的疏水性，因此增加了α-葡萄糖苷酶抑制活性。与PHP1A-3 比较发现，PHP1A-7的序列N-端用Ala 替代序列中的Val 后，多肽的活性降低了，这与研究发现的高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽往往是高度疏水的，多肽中的强疏水性氨基酸Val、Ile、Leu 及Phe、Pro、Ala 等疏水氨基酸残基更易与α-葡萄糖苷酶的氨基酸残基结合，从而发挥对α-葡萄糖苷酶抑制的结论一致[38-40]。分析认为多肽N-端疏水性强具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

研究表明，高α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽的净电荷多为0 或+2[41]，本研究中PHP2 系列设计肽中除PHP2A-7 和PHP2A-10 外，其余净电荷为0 或+2的多肽活性较母肽均有显著提高，表明净电荷可能与PHP2 系列设计肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性有关。与PHP2A-3 相比，Ala、Arg 替换Leu、His 得到的PHP2A-7 降低了多肽疏水性，可能是导致其α-葡萄糖苷酶抑制活性降低的原因；
同样的，与PHP2A-9 相比，用Gly 替换Ile 得到的PHP2A-10 抑制活性也较母肽有所降低。

多肽类似物PHP2A-6、PHP2A-11 和PHP2A-12 表现出了最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分别为5.58、2.35 和3.98 μmol/L，较母肽有极显著性提高（P＜0.01），三种多肽类似物均具有潜在的降血糖活性。Arise 等[42]发现多肽中Leu 含量高可能会增加α-葡萄糖苷酶抑制活性，PHP2A-6、PHP2A-11 序列中含有2 个Leu 可能是其具备高活性的原因。多肽序列中氨基酸空间位阻的变化与其α-葡萄糖苷酶抑制活性没有相关性。

综上所述，多肽序列中氨基酸的疏水性、净电荷及其序列中位置对其α-葡萄糖苷酶抑制活性影响较大。

抗氧化活性表明，多肽浓度为1 mg/mL 时，含有Cys 的多肽类似物PHP1A-1、PHP1A-2、PHP1A-4 和PHP1A-5 的ABTS+·清除率均较高，与母肽相比差异极显著（P＜0.01），这是因为Cys 上的巯基使得多肽具备强的抗氧化能力[43]，本研究发现当Cys 残基处于肽链N-端第1 位比在2 位时具有更好的抗氧化能力，可能是由于Cys 处于末端时，多肽巯基基团更易与自由基接触产生反应。研究表明多肽序列中存在Leu、Pro、Phe、Ala 等疏水性氨基酸有利于提高抗氧化活性，可能是疏水性氨基酸作为供氢体与ABTS+·反应，提高了多肽的自由基清除能力[44]。PHP2A-5 和PHP2A-6 的抗氧化活性较母肽有所提高，这可能与Ala 替换了Thr、Lys，Leu 替换了His，保留了序列中的Pro、Phe，提高了多肽的疏水性有关。

2.4 ACE 抑制肽-ACE 的分子对接

ACE 抑制活性 较高的PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 分别与ACE 进行分子对接，对接结果经Pymol 软件分析抑制肽与ACE 的氨基酸残基之间形成的氢键情况（如图1）。经Protein-Ligand Interaction Profiler 分析抑制肽与ACE 疏水相互作用、π-π堆积及盐桥。

图1 ACE 与多肽类似物的复合物模型Fig.1 The models of ACE in complex with the peptide analogues

PHP1A-6 与ACE 的Asn277（2.9 Å）、Ala354（3.2 Å）、Glu376（2.8 Å）、Glu376（2.9 Å）、Asp377（2.9 Å）、Glu384（3.0 Å）、Asp453（2.7 Å）、Lys454（3.0 Å）之间形成8 个氢键，其中，Ala354、Glu384在ACE 的S1 活性口袋中，PHP1A-6 进入ACE 活性口袋，C-端和N-端氨基酸残基都与ACE 产生了氢键相互作用，其中N-端Gly让出了更大的空间使得肽链中其余氨基酸残基与ACE 产生了氢键。PHP1A-6 与ACE 的Thr166、Trp279、Glu376、Val379、His383、Phe512、Val518、Tyr523之间存在疏水相互作用。PHP1A-6 中Trp 的吲哚基与His383的咪唑环之间形成了π-π堆积作用。PHP1A-6 的C-端羧基与His383、His387之间形成了盐桥。

PHP2A-3 与ACE 的Glu162（3.0 Å）、Gln281（3.1 Å）、Thr282（2.7 Å）、His353（3.1 Å）、Glu376（2.9 Å）、His513（2.7 Å）、Tyr523（2.7 Å）之间形成7 个氢键。PHP2A-3 与 Ala354、 Trp357、 Val379、 Val380、 His383、 Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之间产生疏水相互作用。PHP2A-3 中Tyr 的芳香环与His387之间形成了π-π堆积作用。

PHP2A-4 与ACE 的Glu162（2.8 Å）、Thr282（2.8Å）、His353（3.2 Å）、His513（2.9 Å）、Tyr523（2.8 Å）之间形成5 个 氢 键。PHP2A-4 与Ala354、Asp358、Tyr360、Val379、Val380、His383、Phe391、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之间产生疏水相互作用。PHP2A-4 中Tyr 的芳香环与His387之间形成了π-π堆积。

PHP2A-7 与ACE 的Glu162（3.1 Å）、Thr282（2.8 Å）、His353（3.1 Å）、Glu376（2.9 Å）、Asp377（3.0 Å）、His513（2.7 Å）、Tyr523（2.7 Å）之间形成7 个氢键。PHP2A-7 与 Trp279、 Thr282、 Ala354、 Trp357、 Val379、 Val380、His383、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之间产生疏水相互作用。PHP2A-7 中Tyr 和Phe 的芳香环与His383、His387产生了π-π堆积作用。肽链中的Arg与Glu162、Glu376、Asp377作用形成了盐桥。

PHP2A-3、PHP2A-4 及PHP2A-7 主要与S1 活性口袋中的Tyr523，S2 的His353，His513，S1’形成了氢键相互作用。PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 主要是其N-端高疏水性氨基酸残基与ACE 之间产生了疏水相互作用，C-端氨基酸与ACE 的部分氨基酸残基之间产生了氢键、肽链中的Tyr 和Phe 与ACE的His387形成了π-π堆积，PHP2A-7 的Arg 还与ACE之间产生了盐桥，从而发挥较强的ACE 抑制作用，因此，证明了PHP2 系列多肽N-端氨基酸残基疏水性强会增加对ACE 抑制活性，并且保留C-端的Phe和Pro 及引入Arg 对ACE 的抑制起到了积极的作用。

本研究以ACE 抑制肽PHP1 和PHP2 为母肽，经丙氨酸扫描诱变结合生物活性预测筛选出了母肽序列中的可突变位点并对其进行氨基酸替换，设计了19 个新型ACE 抑制肽类似物。生物信息学分析结果显示，多肽类似物均具备潜在的生物活性且无毒性。通过固相合成法合成了母肽及其类似物，产物经RP-HPLC 纯化和分析后的纯度均在95%以上。ESI-MS 鉴定目的多肽分子量与理论分子量一致。通过验证新型多肽的体外生物活性，表明氨基酸残基的疏水性、空间位阻及其序列中位置对ACE 抑制活性影响较大，多肽的N-端疏水性越强，ACE 抑制作用越强，当N-端氨基酸替换为空间位阻小的Gly 和Ala 时，多肽的ACE 抑制活性变强。对新型多肽分子和ACE 进行分子对接，多肽抑制剂与ACE 之间形成多个氢键、疏水相互作用、π-π堆积和盐桥，增加了对ACE 的抑制作用。综上，本研究设计的多肽类似物均具有较高的ACE 抑制活性，其中，PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 的ACE 抑制活性较母肽有显著性提高（P＜0.05），PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1 和PHP2A-10 具有同母肽相当的抑制活性，其余多肽类似物的ACE 抑制活性较母肽有所降低，IC50介于10～60 μmol/L 范围内。绝大部分多肽类似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性与母肽相比均有明显提高，PHP1A-3、PHP1A-7、PHP2A-6、PHP2A-11 和PHP2A-12 的α-葡萄糖苷酶抑制作用最强。其中，PHP1A-3 和PHP1A-7 具备较强的ACE 抑制和α-葡萄糖苷酶抑制双重活性，具有进一步研究价值。多肽类似物中含有Cys 的片段具有较高的ABTS+·清除率，具备潜在的抗氧化活性。

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