茶多酚对长顺绿壳蛋鸡血清脂质、蛋黄胆固醇及肝脏脂质的影响*
时间：2023-05-30 08:00:26 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
刘 宁，张柏林 ，郝美林，宋培勇，周 鸿，黄姗姗，秦仁海，冯华华
(遵义师范学院 生物与农业科技学院，贵州 遵义 523006)
长顺绿壳蛋鸡2009 年被列入地方遗传资源保护品种[1]，是贵州省优良地方蛋肉兼用型品种，具有体型紧凑、蛋质量较小(约45 g/枚)、产蛋率较低(35%～45%)等特点。其所产鸡蛋具有壳绿、蛋白质含量高、氨基酸组成丰富等优点，具有较高的经济价值，深受消费者喜爱[2]。
茶多酚(tea polyphenols，TP)是茶叶中具有保健作用的主要成分，是茶中多酚类物质的总称，包括儿茶素类(黄烷醇类)、黄酮类和黄酮醇类等成分，约占绿茶干质量的 30%～42%[3-4]。研究表明：TP 具有抗氧化及改善畜禽产品品质等功能[5]。前期研究发现：在长顺绿壳蛋鸡日粮中添加400 mg/kg TP 能显著提高血浆抗氧化性能[6]。有关TP 对机体脂质及胆固醇影响的研究表明：TP 能够显著降低人和其他动物肝脏及外周组织中的脂质水平，有效降低高血脂病的发生率[7-8]。在蛋鸡日粮中添加TP 能够降低鸡蛋中的胆固醇含量[9-10]。然而，蛋鸡通过外源性途径吸收胆固醇的量极低，主要是内源性合成[11]。肝脏是机体合成胆固醇的主要部位，其合成量约占机体胆固醇合成总量的75%以上，蛋鸡每天合成约300 mg胆固醇，且大部分存在于蛋黄中，以产蛋的形式排出[12]。但到目前为止，有关TP 添加对长顺绿壳蛋鸡肝脏胆固醇合成及脂质代谢影响的研究还较少。本研究以长顺绿壳蛋鸡为研究对象，饲喂含有不同水平的TP 日粮，研究TP 对血清脂质指标、蛋黄胆固醇含量及肝脏脂质代谢相关基因表达的影响，以期为长顺绿壳蛋鸡低胆固醇蛋生产提供技术参考。
1.1 试验设计及饲养管理
选择180 日龄的长顺绿壳蛋鸡240 羽，随机分为对照组(饲喂基础日粮)、200 mg/kg TP 组和400 mg/kg TP 组(分别在饲喂基础日粮的基础上添加200 和400 mg/kg TP)，每组10 个重复，每个重复8 羽。TP 由遵义陆圣康源科技开发有限责任公司提供(纯度≥95%)，添加量参照何柳青[10]的研究。预饲期为7 d，正试期为56 d。在整个饲养期间，所有鸡只自由采食和饮水。具体日粮配方及营养成分见表1。
表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)Tab.1 Diet composition and nutrient level (air-dry basis)
1.2 血清采集
宰杀前(正式试验期第55 天)所有鸡只进行空腹处理(宰前12 h 断料不断水)。每个重复随机选择1 羽进行翅下静脉采血至10 mL 离心管中，倾斜放置4 h 后4 ℃、3 000 r/min 冷冻离心10 min，然后收集血清并保存于-20 ℃冰箱待测。
1.3 蛋清及蛋黄收集
试验结束前1 d，每个处理选择10 枚蛋，用蛋清分离器分离蛋清和蛋黄，分别收集至10 mL离心管中，-20 ℃条件下保存待测。
1.4 肝脏样品收集
翅下静脉采血完毕后将鸡只立即宰杀，打开腹腔，采集肝脏样品约5 g 至5 mL 冻存管中，保存于液氮中待测。
1.5 测定指标与方法
1.5.1 血清脂质指标
血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量采用购自南京建成生物工程研究所的商品化试剂盒测定，方法参照说明书。
1.5.2 蛋清总巯基含量及羰基含量测定
采用购自南京建成生物工程研究所的商品化试剂盒测定蛋清中总巯基及羰基含量，方法参照说明书。
1.5.3 蛋黄TC 含量的测定
参照RODJAN 等[13]的方法并稍作修改。利用磁力搅拌器将蛋黄搅匀，称取蛋黄液0.25 g 置于盛有10 mL 2% KOH 乙醇溶液中离心，然后在50 ℃水浴中孵育2 h；
将冷却后的混合物加入蒸馏水5 mL，冷却至室温后进行涡旋混匀，将分离得到的上清液加入正己烷10 mL，涡旋2 min 至分离，重复提取2 次；
将收集到的正己烷相转移至另一个50 mL 的离心管中，取混合正己烷馏分20 mL 于旋转蒸发器中干燥，用2 mL 正己烷重组；
随后加入乙酸，在硫酸亚铁中饱和，并用浓硫酸滴定。将TC 标准品[ 购自生工生物工程(上海)股份有限公司 ]用甲醇配制成1 mg/mL 的溶液，将不同体积的TC 标准溶液(0.5～5.0 mL)与测定样品进行同样处理，并绘制标准曲线。将上述制备的测定样本反应10 min 后测定490 nm 处的光密度值，并依据标准曲线计算蛋黄TC 含量。
1.5.4 荧光定量PCR
利用荧光定量PCR 法对肝脏腺苷单磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein，AMPK)、乙酰辅酶A 羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、β-羟-β-甲基戊二酸单酰辅酶A 还原酶(β-hydroxy-β-methylglutaric acid monoacyl coenzyme A reductase，HMGR)、胆固醇-7-羟化酶(cholesterol-7-hydroxylase，CYP7A1)和低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR) mRNA 表达水平进行测定。称取冷冻肝脏约18 mg，加入预冷的RNAiso Plus 试剂1 mL，均浆30 s 后提取RNA，并用微量分光光度计测定RNA 浓度。采用反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，荧光定量PCR 程序为：95 ℃预变性30 s，1 个循环；
95 ℃延伸5 s，40 个循环；
60 ℃ 退火34 s，1 个循环。内参基因为βactin；
引物序列见表2。采用2-ΔΔCt法测定目的基因的表达[14]，所有样品均测定3 次。
表2 引物序列Tab.2 Sequences of primers
1.6 数据处理
采用SPSS 20.0 的单因素方差分析(ANOVA)进行数据处理，采用Duncan’s 多重比较对数据进行显著性分析。结果均以“平均值±标准差”表示。
2.1 日粮添加茶多酚(TP)对血清脂质代谢指标的影响
由表3 可知：400 mg/kg TP 组蛋鸡血清TC、TG 和LDL-C 含量显著低于对照组(P＜0.05)，HDLC 含量显著高于对照组(P＜0.05)，但LDL-C/HDL-C 与对照组无显著差异(P＞0.05)；
200 mg/kg TP对上述指标均无显著影响(P＞0.05)，且200 和400 mg/kg TP 组之间的各血清脂质代谢指标均无显著差异(P＞0.05)。
表3 日粮添加茶多酚(TP)对长顺绿壳蛋鸡血清脂质代谢指标的影响Tab.3 Effects of tea polyphenols (TP) supplementation on indexes of lipid metabolism in serum of Changshun green-shell laying hens
2.2 日粮添加茶多酚(TP)对蛋清总巯基及羰基含量的影响
由图1 可知：400 mg/kg TP 组蛋鸡蛋清羰基含量显著低于对照组(P＜0.05)，蛋清总巯基含量显著高于对照组(P＜0.05)；
与对照组相比，添加200 mg/kg TP 对蛋清总巯基和羰基含量均无显著影响(P＞0.05)；
与200 mg/kg TP 组相比，400 mg/kg TP 组蛋鸡蛋清羰基含量显著降低(P＜0.05)，而蛋清总巯基含量无显著差异(P＞0.05)。
图1 日粮添加茶多酚(TP)对长顺绿壳蛋鸡蛋清羰基和总巯基含量的影响Fig.1 Effects of tea polyphenols (TP) supplementation on the contents of carbonyl and total sulfhydryl in egg white of Changshun green-shell laying hens
2.3 日粮添加茶多酚(TP)对蛋黄TC 含量的影响
由图2 可知：200 和400 mg/kg TP 组蛋鸡蛋黄TC 含量均显著低于对照组(P＜0.05)，且400 mg/kg TP 组蛋鸡蛋黄TC 含量显著低于200 mg/kg TP 组(P＜0.05)。
图2 日粮添加茶多酚(TP)对长顺绿壳蛋鸡蛋黄胆固醇含量的影响Fig.2 Effects of tea polyphenols (TP) supplementation on the contents of cholesterol in egg yolk of Changshun green-shell laying hens
2.4 日粮添加茶多酚(TP)对肝脏脂质代谢相关基因表达的影响
由图3 可知：与对照组相比，200 和400 mg/kg TP 组蛋鸡肝脏ACC、HMGR及CYP7A1mRNA表达水平均显著降低 (P＜0.05)，而AMPK及LDLRmRNA 表达水平均显著增加 (P＜0.05)；
与200 mg/kg TP 组相比，400 mg/kg TP 组肝脏ACC、HMGR及CYP7A1mRNA 表达水平显著降低(P＜0.05)，但AMPK及LDLRmRNA 表达水平显著升高 (P＜0.05)。
图3 日粮添加茶多酚(TP)对长顺绿壳蛋鸡肝脏脂质代谢相关基因表达的影响Fig.3 Effects of tea polyphenols (TP) supplementation on the mRNA expressions of relative genes of lipid metabolism in liver of Changshun green-shell laying hens
3.1 日粮添加茶多酚(TP)对血清脂质指标的影响
血清TC、TG、LDL-C 及HDL-C 是反映机体脂质代谢状态的重要指标。研究表明：LDLC 是循环TC 的主要载体，是引起动脉粥样硬化的血脂高危因素，可导致心血管疾病的发展[15]；
相反地，HDL-C 参与脂质从外周组织转移到肝脏进行分解代谢[16]，引导多余的TC 排出血浆，从而有助于降低心血管疾病的风险。本研究发现：添加400 mg/kg TP 可显著降低长顺绿壳蛋鸡血清LDL-C 含量，显著增加血清HDL-C 含量。何俊金等[17]和HUANG 等[18]等研究也均表明：添加绿茶多酚能显著增加蛋鸡血清HDL-C 含量，降低血清LDL-C 含量。以上结果提示：TP 添加有利于降低蛋鸡体内脂质积累。有研究表明：日粮添加高剂量TP (600 和800 mg/kg)可显著降低蛋鸡血清HDL-C 含量，这可能意味着高剂量TP 添加对蛋鸡机体代谢产生了副作用[17]。本研究还发现：添加TP 可降低蛋鸡血清TC 及TG 含量。与此相似，WANG 等[9]在罗曼粉蛋鸡日粮中添加不同剂量TP，结果发现：日粮添加300 mg/kg TP 可显著降低蛋鸡血清TC 及TG 含量。此外，HUANG等[18]研究表明：灌服100 mg/kg TP 可显著降低肉鸡血清TG 及TC 含量。以上结果提示：日粮添加TP 有利于降低蛋鸡血清脂质水平。
3.2 日粮添加茶多酚(TP)对蛋清羰基及总巯基含量的影响
哈夫单位是衡量鸡蛋蛋白品质的重要指标。课题组前期研究表明：添加400 mg/kg TP 可显著增加鸡蛋的哈夫单位[7]。鸡蛋蛋清约含80%的蛋白质，是良好的蛋白来源[19]。随着蛋鸡产蛋日龄的增加，活性氧含量增加，蛋白质受活性氧攻击的概率增加，蛋白质被氧化[20]，引起其结构改变，从而使得羰基含量增加，巯基含量降低[21]。蛋白质羰基和巯基是衡量蛋白质氧化的重要指标[22]。本研究表明：日粮添加400 mg/kg TP 可显著降低蛋鸡蛋清羰基含量，显著增加巯基含量。汪小红[19]以64 周龄海兰褐蛋鸡为试验对象，在其日粮中添加200 mg/kg TP，结果发现：添加TP可增加蛋清巯基含量，降低羰基含量；
王晓翠[22]的研究也表明：日粮添加200 mg/kg 绿茶多酚能够显著增加蛋清巯基含量，降低蛋清羰基含量。这可能是由于添加TP 能够降低蛋白氧化，改善蛋鸡的抗氧化防御体系，进而改善蛋鸡氧化/抗氧化体系。此外，TP 可与蛋白质形成多酚—蛋白质复合物以增加蛋白质的抗氧化性能，从而保护细胞和组织免受蛋白氧化损伤[20,22]。
3.3 日粮添加茶多酚(TP)对蛋黄TC 的影响
鸡蛋中脂质含量高达30%，且蛋黄中TC 含量达195～230 mg[23]。过量食用鸡蛋会增加中老年人和糖尿病患者血液中的TC 水平，从而增加患心血管疾病的风险[24-25]。研究证实：天然多酚、儿茶素和黄酮醇可清除活性氧并螯合金属离子，从而降低鸡蛋的TC 含量[26]。本研究表明：日粮添加200 和400 mg/kg TP 可显著降低长顺绿壳蛋鸡蛋黄TC 含量。已有研究表明：日粮添加3%绿茶粉可显著降低蛋黄TC 含量[27]。何柳青[10]以44 周龄绿壳蛋鸡为对象，分别在其日粮中添加0、200 和400 mg/kg TP，结果发现：日粮添加200 和400 mg/kg TP 能显著降低蛋黄TC 含量，这可能是由于TP 可减少极低密度脂蛋白进入卵母细胞的数量，以此降低蛋黄TC 含量[10]，但具体的机制还有待于进一步研究。
3.4 日粮添加茶多酚(TP)对肝脏脂质代谢相关基因表达的影响
AMPK 是蛋白激酶信号级联通路的下游组成部分，是感知细胞内能量状态的关键因素，是生物体能量代谢调控的关键因子[28]。研究表明：AMPK 可调控ACC 和HMGR 的表达从而抑制肝脏TC 的合成[29]。本研究表明：添加TP 可显著增加肝脏AMPKmRNA 的表达水平，但显著降低ACCmRNA 的表达水平。BANERJEE 等[30]研 究表明：灌服绿茶提取物可显著增加小鼠肝脏AMPK 蛋白的表达水平；
黄进宝[29]研究表明：灌服TP 可显著增加肉鸡AMPKmRNA 表达水平；
陈晓春等[31]研究表明：日粮中添加0.6%洛伐他汀(HMGR 抑制剂)可显著提高蛋鸡肝脏AMPK酶活性，而降低ACC 酶活性，且显著降低鸡蛋中TC 含量。以上研究结果提示：添加TP 可能通过增加肝脏的AMPKmRNA 表达而降低ACCmRNA 表达，进而影响蛋黄TC 含量。
肝脏和卵巢是蛋鸡合成TC 的场所，其中，肝脏合成的TC 量占机体TC 合成总量的75%以上，是蛋鸡合成TC 的主要场所[12]。HMGR 是内源性TC 合成的重要限速酶，当TC 吸收增加时，HMGR 表达降低，进而导致内源性TC 合成下降[32]。本研究表明：添加TP 可显著降低肝脏HMGRmRNA 的表达水平，说明添加TP 有利于降低肝脏TC 的合成。已有研究表明：抑制肝脏TC 合成可以降低鸡蛋TC 含量[33]，这与本研究中TP 添加降低蛋黄中TC 含量的结果一致，但TP 抑制HMGRmRNA 表达的机制还有待于进一步研究。
多数学者认为：LDLR、HMGR 和CYP7A1在肝脏TC 合成、运输及分泌中发挥重要作用[34]。LDLR 还广泛分布于肝细胞表面，负责细胞和血浆中LDL-C 的运输和清除[15]。有研究表明：饮食诱导的TC 合成抑制与肝脏HMGR 表达水平的降低有关，并可能激活肝脏LDLR 表达增加，进而促进LDL-C 的清除[34-35]。本研究表明：添加TP可显著增加肝脏LDLRmRNA 的表达水平，这可能是由于添加TP 可降低肝脏TC 的内源性合成，促进LDL-C 的清除，进而降低鸡蛋中的TC 含量。肝脏中TC 转化为胆汁酸，最终通过粪便排出体外，是机体清除多余TC 最主要的方式[36]。CYP7A1 是肝脏中TC 转化为胆汁酸的限速酶，参与维持机体TC 代谢的平衡[37]，但本研究中添加TP 可显著降低肝脏CYP7A1mRNA 的表达水平，这可能意味着肝脏TC 分解代谢水平的下降，也可能是对添加TP 使得蛋鸡肝脏TC 合成下降结果的反馈，从而维持体内TC 含量的动态平衡[38]。
日粮添加400 mg/kg 茶多酚可增强长顺绿壳蛋鸡蛋清的抗氧化性，降低蛋黄总胆固醇含量，有利于改善血清及肝脏脂质代谢。
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