基于网络药理学与分子对接技术探讨健骨注射液治疗骨质增生及类风湿性关节炎的作用机制
时间：2023-05-29 16:25:17 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
郑苏楠，彭维，苏薇薇，程春雷，王永刚*
(1.中山大学生命科学学院，广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心/广东省热带亚热带植物资源重点实验室，广东 广州 510275；
2.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)
健骨注射液是由马鞭草科植物黄毛豆腐柴(PremnafulvaCraib)的干燥茎加工制成，具有活血散瘀、强筋健骨、祛风止痛等功效。健骨注射液对于类风湿性关节炎和骨质增生均有一定疗效[1-2]。目前健骨注射液的研究主要集中于临床疗效及成分分析方面，尚未有针对其药理及作用机制的研究。本研究拟采用网络药理学方法及分子对接技术预测健骨注射液治疗骨质疏松及类风湿性关节炎的作用通路。
1.1 健骨注射液化学成分检测 本课题组前期研究中，应用了超快速高效液相色谱串联三重四级杆飞行时间质谱(UFLC-Triple TOF-MS/MS)对健骨注射液的化学成分进行分析[3-5]。
1.2 化学成分对应靶点收集 通过TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库检索活性成分作用靶点，并通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将其蛋白名称转化为相应的基因名称。同时通过Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行健骨注射液活性成分作用靶点筛选，以Probability>0为筛选标准，预测作用靶点。将上述2个数据库平台筛选得到的作用靶点进行合并、去重，即为健骨注射液活性成分的作用靶点。
1.3 疾病相关靶点收集 分别以“rheumatoid arthritis”和“hypertrophic osteoarthropathy”为关键词，在Genecards数据库(https://www.genecards.org/)中检索类风湿性关节炎(RA)和骨质增生相关靶点，Score值越高就表明此靶点与疾病的联系越密切，选取Score≥5的靶点作为作用潜在靶点，整理合并得到类风湿性关节炎和骨质增生对应的疾病靶点。
1.4 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建 将筛选得到的健骨注射液活性成分靶点与疾病相关靶点取交集，并利用在线网站Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制Venn图。所得靶点交集即为健骨注射液活性成分主要作用靶点。将上述靶点导入Cytoscape 3.9.0中进行可视化处理，构建“健骨注射液-成分-靶点-疾病”网络图。
1.5 PPI网络构建 将上述所得健骨注射液活性成分主要作用靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/)，选择Multiple proteins之后将物种设置为Homo sapiens，选取中置信度medium confidence(0.400)，其余设置默认，得到蛋白质相互作用(PPI)网络。
1.6 信号通路富集分析 利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对作用靶点进行GO(Gene Ontology)富集分析，并通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析探寻健骨注射液治疗骨质增生及类风湿性关节炎生物功能以及主要信号通路分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
1.7 分子对接 使用“Network Analyzer”插件计算网络的拓扑属性，选取健骨注射液核心成分和PPI网络中Score排名前五的核心靶点进行分子对接。通过PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载核心成分的2D结构，利用ChemBioOffice Ultra 13.0.2-Chem3D软件将其转化为3D结构并进行优化，使能量最小化。在RCSB数据库(https://www.pdbus.org/)下载核心靶点对应的蛋白结构，利用PyMOL 2.5.2软件进行去水去残基等处理。在AutoDockTools-1.5.7软件中设置对接网格点及尺寸，使对接盒子(grid box)包裹整个蛋白。使用Vina软件进行半柔性分子对接，结合能绝对值越高，代表受体和配体亲和力越高。
2.1 活性成分检测结果 用 UFLC-Triple TOF-MS/MS 技术，对健骨注射液进行在线分离、鉴定了31种成分，去除同分异构体筛选后得到15种化学成分用于进行网络药理学研究(见表1)。
表1 健骨注射液活性成分
2.2 活性成分及疾病相关靶点收集 通过TCMSP数据库及Swiss Target Prediction数据库搜索共得健骨注射液活性成分相关靶点261个。将成分和靶点导入Cytoscape 3.9.0中进行可视化处理，构建“健骨注射液-成分-靶点”网络(见图1)。其中黄色节点代表健骨注射液活性成分，蓝色节点代表成分对应相关靶点。对该网络进行分析可知，该网络图中共有276个节点和524条边。
图1 “健骨注射液-成分-靶点”网络图
通过Genecards数据库检索得到骨质增生及类风湿性关节炎相关靶点共520个，与健骨注射液成分对应靶点取交集，如图2所示，得到健骨注射液治疗骨质增生及类风湿性关节炎主要作用靶点53个(见表2)。
图2 健骨注射液与疾病的共同基因靶点数
2.3 网络构建与分析
2.3.1 “健骨注射液-成分-主要靶点-疾病”网络 将上述健骨注射液主要靶点及疾病导入Cytoscape 3.9.0中进行可视化处理，构建“健骨注射液-成分-靶点-疾病”网络图，如图3所示。其中黄色节点代表健骨注射液活性成分，蓝色节点代表成分对应相关靶点。对该网络进行分析可知，该网络图中共有64个节点和165条边。其中同一活性成分可能对应不同靶点，不同活性成分也可能对应同一靶点，这表明健骨注射液是通过多成分多靶点作用于疾病。其中度值(degree)排名前四的节点所对应的化学成分分别为芹菜素、木犀草素、柚皮素、香草酸，这4种成分作用靶点数量较多，表明它们可能是健骨注射液中主要药理活性成分。因此选取这4种成分作为健骨注射液核心成分，后续进行分子对接操作。
图3 “健骨注射液-成分-主要靶点-疾病”网络图
2.3.2 PPI网络 将53个交集靶点导入STRING数据库进行分析，得到PPI蛋白互作图(如图4)。该网络中包含53个节点，592条边，平均连接度为22.3，平均局部聚类系数为0.776。其中度值排名前五的节点为TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53，表明这些节点在PPI网络中处于核心位置，节点联系较为紧密。上述5个基因靶点可能为健骨注射液治疗骨质疏松和类风湿性关节炎的核心靶点，健骨注射液发挥药效的机制可能与这5个基因的表达相关。因此选取这5个靶点作为核心靶点进行后续分子对接操作。
图4 健骨注射液主要作用靶点的蛋白PPI网络图
2.3.3 GO和KEGG富集分析 利用DAVID数据库对作用靶点进行富集分析，共得到328条GO富集条目，其中属于生物学过程(biological process，BP)的264条，属于细胞组成成分(cellular component，CC)的23条，属于分子功能(molecular function，MF)41条。靶点基因主要参与凋亡过程的负调控、对药物的反应、胶原分解代谢过程、炎症反应、一氧化氮生物合成过程正调控等生物学进程，对应细胞外间隙、胞外区、质膜外侧、蛋白质细胞外基质等细胞组分以及同种蛋白结合、细胞因子活性、转录因子结合、蛋白酶结合等分子功能。GO分析结果按P值从小到大排序，排名前十的条目见表3，P<0.05表示差异具有统计学意义，R语言可视化结果如图5所示。
表3 GO分析结果
图5 GO分析结果
此外，上述靶点共富集得到88条KEGG通路，相关通路有癌症通路、美洲锥虫病、TNF信号通路、T细胞受体信号通路等。富集通路按P值从小到大排序，排名前二十的条目如表4所示。将上述结果导入R语言进行可视化，结果如图6所示。
表4 KEGG通路富集结果
图6 KEGG分析结果
2.4 分子对接 利用Vina软件将芹菜素、木犀草素、柚皮素和香草酸分别与TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53这5个核心基因靶点对应的蛋白质建立分子对接模型，预测20种对接模式，保留结合能绝对值最大的模式(见表5)。将对接结果导入PyMOL 2.5.2进行可视化(见表6)，图中黄色虚线表示小分子配体与蛋白受体之间通过氢键相互作用。当结合能小于-4.25 kcal·mol-1时，化合物与靶点有一定结合活性；
结合能小于-5 kcal·mol-1时，化合物与靶点有较好的结合活性；
结合能小于-7 kcal·mol-1时，化合物与靶点具有强烈的结合活性[6-7]。
表5 分子对接最低结合能(kcal·mol-1)
表6 分子对接结果
在健骨注射液治疗骨质增生和类风湿性关节炎的蛋白互作网络中，核心靶点有TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53等。其中白细胞介素6(IL-6)是一种多功能炎性细胞因子[8]，由炎性细胞因子介入导致的炎性反应在类风湿性关节炎过程中具有重要作用[9]。有研究表明，IL-6在类风湿性关节炎患者的关节滑液中大量存在，通过多种效应途径参与类风湿性关节炎的发病机制，可诱导破骨细胞分化，加快类风湿性关节炎患者软骨破坏[10-11]。有研究表明TNF-α刺激滑膜细胞与成纤维细胞，大量分泌产生IL-6影响疾病经进程。此外，类风湿性关节炎的发生和发展与TNF信号通路中IL-6、TNF和PTGS2的异常表达有关[12]。
通过KEGG信号通路气泡图颜色和大小可以得出，健骨注射液作用的主要通路包括癌症通路、美洲锥虫病、TNF信号通路、T细胞受体信号通路等。炎症因子与癌症密切相关，可以作用于肿瘤的发生、恶性转化及转移等疾病进程。NF-κB信号转导作为炎症的一个整体启动子，在炎症和肿瘤之间起到重要作用[13]。研究表明，在骨性关节炎患者滑膜组织中发现了肿瘤信号通路的高调控，肿瘤通路可能为骨性关节炎治疗和诊断的潜在靶点基因[14]。T细胞受体在T细胞的功能和免疫突触的形成中起着关键作用。T淋巴细胞的活化是免疫系统有效反应的关键，T细胞受体的活化受多种共刺激受体的调节[15]。目前，尚未发现骨质增生及类风湿性关节炎与美洲锥虫病存在直接联系。
综上所述，本研究通过网络药理学方法，构建出“健骨注射液-靶点-疾病”网络模型，对健骨注射液治疗骨质增生和类风湿性关节炎的机制进行了初步预测，分析了健骨注射液治疗疾病相关靶点及信号通路，发现健骨注射液通过多成分多靶点对疾病反应进行调控。但本研究尚未对预测的作用机制进行验证，将在后续研究中继续验证。
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