连翘叶减肥颗粒剂辅料筛选及质量标准研究
时间：2023-01-17 17:05:08 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
张磊，纪思慧，赵建斌，杜俊民，柴建新，李飞鹤 ，乔尚杰，李靖 ，张立伟*，陈廷贵*
（1.山西大学 分子科学研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006；
2.山西振东制药股份有限公司，山西 长治 047100；
3.山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西 榆次 030619；
4.山西华卫药业有限公司，山西 榆次 030600）
连翘为木犀科（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）植物，主要分布于山西、陕西、河北、河南、山东、甘肃、湖北、四川等地，具有清热解毒、散结消肿、疏散风热等功效[1-3]。连翘中含多种化学成分，主要包括苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类、挥发油及萜类等[4-7]。连翘作为山西大宗药材，其叶资源量在山西中草药中更是占据首要位置[8]。本实验室所制定的连翘叶食品地方标准已获得山西省批准，证明了其安全性[9]。侯改霞、Kang和Zhang等分别对连翘叶或果实进行了降血脂、抗疲劳、抗氧化、抗糖尿病等方面的研究[10-12]，本课题组前期研究表明，连翘叶中8种成分都可通过抑制胰脂肪酶达到减肥目的[13]。两次动物实验表明连翘叶水提物具有显著或极显著减肥和辅助降血脂功能[14]。本文在细胞水平上进一步对连翘叶水提物是否具有减肥作用进行了研究，然后针对该水提物特点，对颗粒剂辅料进行了筛选，将其制备成颗粒剂，最后对所制颗粒进行了质量评价，为后续进一步对其开发利用打下了基础。
颗粒剂系指原料药物与适宜的辅料混合制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂[15]。颗粒剂可吞服，也可溶于水中服用。颗粒剂稳定性好，运输、携带和贮藏方便[16]，且生产工艺相对简单，易实现工业化生产。
1.1 主要试剂与仪器
连翘叶于2019年8月5日采集于山西省长治县，经山西大学分子科学研究所张立伟教授鉴定。
HepG2细胞购于上海富衡生物科技有限公司。
无水乙醇、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、甲酸（天津市大茂化学试剂厂）；
连翘苷、连翘酯苷A、芦丁（成都曼思特生物科技有限公司）；
淀粉（北京厨大妈食品集团有限公司）；
麦芽糊精、β环状糊精、微晶纤维素、阿斯巴甜（河南万邦实业有限公司）；
DMEM细胞培养基、尼罗红、4%多聚甲醛溶液（Solarbio公司）；
胎牛血清（杭州四季青公司）；
噻唑蓝（MTT）（Sigma公司）：二甲基亚砜（DMSO）（Solarbio公司）。
GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；
OHAUS CP114电子天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；
Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；
BPS-250恒温恒湿培养箱（金坛市天竟实验仪器厂）。
1.2 连翘叶水提物提取工艺
课题组前期实验以抑制胰脂肪酶活性和得率为综合指标，对连翘叶中抑酶活性组分进行工艺优化，确定了最佳工艺路线[14]，如图1所示。
图1 连翘叶水提物提取工艺Fig.1 Preparaion of water extract from forsgthia suspensa leaves
1.3 连翘叶水提物对HepG2细胞中脂质含量抑制作用研究
用MTT法检测细胞存活率。在96孔板中培养细胞，将HepG2在培养箱中培养12 h后，空白对照组不加药，给药组加连翘叶水提物，其终浓度分别为1、5、10、50、100、200 μg/mL，再继续培养24 h后，每孔加入10 μL MTT，培养4 h后，吸出孔中液体，加入 150 μL DMSO，振荡 10 min，用酶标仪在 490 nm波长下测定吸光度值。
荧光法检测HepG2细胞中的脂质含量。用低糖DMEM（含5.5 mM/L D-glucose）和10%胎牛血清培养HepG2细胞24 h。24 h后用低糖DMEM无血清培养基继续培养12 h，然后吸掉培养基，共设6组：低糖DMEM无血清组、高糖DMEM（含30 mM/L D-glucose）无血清组、高糖DMEM无血清组加 1、50、100、200 μg/mL连翘叶水提物，再培养12 h。12 h后，用PBS洗涤细胞，4%的多聚甲醛固定细胞，尼罗红染色。染色后放置在倒置荧光显微镜下检测荧光，并拍照记录[17]。
1.4 连翘叶水提物粉末性质考察
主要考察连翘叶水提物粉末吸湿性、溶解性、口感以及制粒情况。吸湿性考察方法：精密称取连翘叶水提物干燥粉末，平铺在恒重的称量瓶底部，厚度约2 mm，置于25℃（室温）、相对湿度为75%的恒温恒湿干燥箱中密闭放置，在1、2、3、6、9、12、24、36、48 h后取出精密称重，计算吸湿率。吸湿率计算公式：吸湿率（%）=（吸湿后重量−吸湿前重量）/吸湿前重量×100%[18]。溶解性及口感考察方法：精密称取连翘叶水提物干燥粉末5.5 g，加入200 mL热水，搅拌3 min，观察溶解情况，并品尝。制粒情况考察方法：称取连翘叶水提物干燥粉末，加入乙醇制粒，观察制粒情况。
1.5 颗粒剂制备工艺的筛选
将连翘叶水提物干燥粉末粉碎、过100目筛后与辅料充分混合，涓流加入润湿剂混合均匀，按照“手握成团，轻按即散”的标准制成软材，挤压过14目筛制粒，在电热恒温鼓风干燥箱40℃干燥30 min，然后用16目筛整粒，成品于自封袋中置干燥器中室温保存。
1.5.1 颗粒稀释剂的选择
用连翘叶干燥粉末、淀粉、麦芽糊精、β环状糊精、微晶纤维素以不同比例、不同组合组成配方，保持其他因素不变，按“1.5”方法制备颗粒，进行吸湿性测定，并观察48 h后颗粒外观变化。稀释剂组合配比共设置16组，见表1。
表1 稀释剂组合配比Table 1 Diluent combination ratio
1.5.2 颗粒润湿剂的选择
分别用65%、75%、85%、95%乙醇作颗粒润湿剂，保持其他因素不变，按“1.5”方法制备颗粒，观察制粒情况。
1.5.3 颗粒甜味剂剂量的选择
称取5.5 g连翘叶减肥颗粒分别添加阿斯巴甜0.5%，1%，1.5%，用200 mL热水冲泡，品尝口感来筛选较优添加量。
1.5.4 验证试验
按筛选出最优配方用“1.5”方法制备3批颗粒，对制粒情况、吸湿性、溶解性以及口感进行验证。
1.6 颗粒剂质量标准研究
1.6.1 薄层鉴别
薄层色谱分析方法：分别取连翘对照药材和连翘叶颗粒粉末1 g，加石油醚（30℃～60℃）20 mL，密塞，超声处理15 min，滤过，弃去石油醚液，残渣挥干石油醚，加甲醇20 mL，密塞，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为对照药材溶液和供试品溶液。再取连翘苷、芦丁、连翘酯苷A对照品，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，作为对照品溶液。点板第一次以氯仿-甲醇（8∶2）为展开剂展开，找到连翘苷的荧光位置后，标注，第二次以乙酸乙酯-甲酸-水（9∶1.5∶0.5）展开，溶剂前沿在连翘苷位置下方0.2 cm处时取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰[19]。
1.6.2 含量测定
用Agilent 1200型高效液相色谱仪进行HPLC分析。分析条件：Thermo Scientific SHIMADZU VP-ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱，柱温25 ℃，检测波长270 nm，进样量10 μL，流速0.8 mL/min，流动相以甲醇为A，0.3%醋酸水溶液为B，梯度洗脱条件：0～8 min，30%～33%A；
8 min～24 min，33%～40%A；
24 min～39 min，40%～48%A；
39 min～55 min，48%～64%A[20]。主要对连翘叶中含量高且减肥效果好的连翘酯苷A和芦丁和含量高成分连翘酯苷A、连翘苷以及芦丁三种成分进行含量测定。
2.1 HepG2细胞存活率和细胞中的脂质含量
如图2所示，连翘叶水提物在1 μg/mL～200 μg/mL浓度范围内，细胞存活率均为90%以上，即在此浓度范围内连翘叶水提物对HepG2细胞没有毒性。从图3和图4可知，与高糖无血清组对比，随着连翘叶水提物浓度（1、50、100、200 μg/mL）增加，荧光强度逐渐减弱，其中连翘叶水提物浓度为200 μg/mL时荧光强度最弱，降低脂质积累效果最好。结果表明：连翘叶水提物能够抑制HepG2细胞中高糖诱导的脂质积累。
图2 不同浓度连翘叶水提物对HepG2细胞存活率的影响Fig.2 The effect of water extracts of Forsythia suspensa leaves at different concentrations on the survival rate of HepG2 cells
图3 连翘叶水提物对高糖诱导的HepG2细胞脂质积累的抑制作用。#表示与低糖组相比，P<0.05，*表示与高糖组相比，P<0.05Fig.3 Inhibitory effect of water extract of Forsythia suspensa leaves on lipid accumulation in HepG2 cells induced by high glucose(#means P<0.05 compared with low glucose and serum-free group,*means P<0.05 compared with high glucose and serum-free group)
图4 不同浓度连翘叶水提物培养HepG2细胞后脂质荧光图（1～6分别表示低糖组、高糖组、连翘叶水提物粉末（1、50、100、200 μg/mL）组）Fig.4 Lipid fluorescence map of HepG2 cells incubated with water extracts of Forsythia leaves at different concentrations(1−6 represent the low-sugar group,high-sugar group,and water extract powders groups of Forsythia leaves(1,50,100,200 μg·mL-1)
2.2 连翘叶水提物粉末的性质
如表2所示，连翘叶水提物粉末易溶解、易吸湿、易粘连，只加润湿剂无法制粒，需加入吸湿性小、黏度小的辅料进行制粒。同时其具有苦味，口感较差，需添加甜味剂进行口感改良。
表2 连翘叶水提物干燥粉末性状考察Table 2 Investigation of dry powder properties of water extract of Forsythia suspensa leaves
2.3 颗粒剂制备工艺的筛选结果
2.3.1 颗粒稀释剂筛选结果
由图5可知，稀释剂比例增加，吸湿率降低；
且不同稀释剂对颗粒吸湿率有不同程度影响。进一步增加稀释剂比例和不同配比，结果见图6。综合图5、图6、表3可知，吸湿率：麦芽糊精>可溶性淀粉>微晶纤维素≈β环状糊精，稀释剂与连翘叶水提物的比例越大，吸湿率越低。从辅料抗吸湿性和辅料48 h后外观变化考虑，选择β环状糊精∶维晶纤维素∶连翘叶水提物粉末=1∶1∶1，吸湿率最低，并且24 h后颗粒无软化、不粘连。
表3 连翘叶减肥颗粒稀释剂配方考察结果Table 3 Investigation results of formula of Forsythia leaves slimming granule diluent
图5 连翘叶水提物粉末与稀释剂混合物吸湿曲线1Fig.5 Moisture absorption curves of water extract powder and diluent mixture of Forsythia leaves 1
图6 连翘叶水提物粉末与稀释剂混合物吸湿曲线2Fig.6 Moisture absorption curves of water extract powder and diluent mixture of Forsythia leaves 2
2.3.2 颗粒润湿剂筛选结果
由表4可知，润湿剂为65%乙醇与75%乙醇时，软材粘，不易制粒，85%乙醇、95%乙醇时软材适中，且颗粒成型率较高，从节约成本角度考虑，乙醇浓度选择85%。
表4 不同润湿剂对制粒难易的影响Table 4 Influence of different wetting agents on the difficulty of granulation
2.3.3 颗粒甜味剂剂量筛选结果
由表5可知，阿斯巴甜添加量为0.3%时味苦涩；
0.5%时甜度适中，口感较好；
1%时稍甜，1.5%时过甜。综合考虑，阿斯巴甜剂量拟选择为0.5%。
表5 不同用量阿斯巴甜对颗粒剂口味的影响Table 5 Influence of different dosages of aspartame on the taste of granules
2.3.4 验证实验
通过三批验证实验得出颗粒溶解性好，甜度适中。同时从表6及表7可以看出：3批验证试验制得的颗粒质量基本一致，说明该工艺稳定可行。
表6 优化工艺验证Table 6 Optimized process verification
表7 吸湿率验证Table 7 Verification of moisture absorption rate
2.4 颗粒剂质量标准研究结果
2.4.1 薄层鉴别结果
图7为连翘颗粒样品的薄层色谱图。
图7 连翘颗粒样品薄层色谱图Fig.7 Thin layer chromatogram of Forsythia granule sample
2.4.2 含量测定结果
根据图8、表8、表9，计算出连翘酯苷A、芦丁和连翘苷含量。按低于平均值的20%作为限度，规定每袋连翘叶颗粒剂中连翘酯苷A质量分数不得少于1.73%，芦丁质量分数不得少于0.78%，连翘苷质量分数不得少于1.22%。
图8 连翘叶减肥颗粒HPLC图Fig.8 HPLC diagram of Forsythia leaves slimming granules
表8 各标准曲线回归方程Table 8 Regression equation of each standard curve
表9 平行样品中连翘酯苷A、芦丁、连翘苷质量分数Table 9 Mass fractions of forsythin A,rutin and forsythin in parallel samples
综上所述连翘叶水提物能够抑制HepG2细胞中高糖诱导的脂质积累；
针对连翘叶水提物易吸湿、黏性大、流动性差、易结块、难以单独制粒且味苦，这些缺陷，筛选出连翘叶减肥颗粒的最佳配方：β环状糊精∶维晶纤维素∶连翘叶粉末=1∶1∶1，添加0.5%阿斯巴甜，用85%乙醇制粒；
质量标准为连翘叶颗粒剂中连翘酯苷A质量分数不得低于1.73%，芦丁不得低于0.78%，连翘苷不得低于1.22%。本文研究为后续中试放大提供了可靠依据。同时后期还需进行连翘叶减肥颗粒稳定性研究。
