丝素蛋白多孔支架用于口腔软组织增厚的初步研究
时间：2023-01-16 11:05:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
李德雄 曹润源 陈江
1.福建医科大学附属口腔医院，福州 350000；
2.福建医科大学口腔医学院口腔颅面种植研究中心，福州 350002
在临床种植中，尤其是在美学区种植中，充足的口腔软组织厚度常常是术区轮廓丰满度和避免唇侧牙槽骨吸收的保障[1]。但患者往往存在不同程度的软组织厚度不足，需要施行软组织增量手术。这往往需要在术区植入自体软组织或人工替代材料以增加局部软组织的厚度，从而达到恢复缺损轮廓丰满度、改善美观及保障种植成功率的目的[2]。
目前，尽管上皮下结缔组织移植仍然是最有效的软组织增厚方式[3-4]，但自体组织移植需开辟额外术区，增加了患者感染、疼痛、不适等并发症。因此，探索其替代材料便成为了研究热点[4]。目前常用于软组织增厚的替代材料主要为脱细胞真皮基质及胶原基质。然而，脱细胞真皮基质厚度不足，需折叠使用才能获得足够的初始厚度，但将其折叠一定程度上可能会影响移植后局部组织的血运重建[5-6]。而胶原基质的降解速率快，移植后收缩率较高，效果不及自体结缔组织移植[7-8]，而交联后的胶原虽然降解时间延长，但生物相容性会受到影响，植入初期炎症反应较重[9-10]。因此，自体结缔组织移植在口腔软组织增厚中的“金标准”地位依然稳固，要想获得理想的替代材料，还需要更多的相关研究。理想的口腔软组织增厚材料应当在具备良好生物相容性的前提下，能够获得三维空间上软组织量的增加，并长期维持稳定。因此，保证支架材料具有一定的机械强度和适当的降解性能，是探索口腔软组织增厚材料的关键。
丝素蛋白作为一种天然来源的材料，近年来被广泛应用于皮肤创伤修复、肌肉或神经重建，脏器再生等生物医学领域[11-14]，但在口腔软组织增厚方面的研究却鲜有报道。丝素蛋白分子存在SilkⅠ和SilkⅡ两种构型，Ⅰ型结构不稳定，易降解；
Ⅱ型结构比较稳定，其占比越高，材料机械强度越大，可降解性越低[11]，而SilkⅠ、Ⅱ两种结构的相对比例受到许多因素（如丝素种类、温度、浓度、处理方式）的影响。因此，通过控制制备过程中的各项因素，就可以调节丝素蛋白材料的机械性能和降解速率[15]，从而获得适用于口腔软组织增厚的丝素蛋白支架，达到“因地制宜”的效果。
本研究旨在利用不同浓度的再生丝素蛋白溶液制备多孔支架材料，通过检测其理化性能及体内生物学性能，初步探索丝素蛋白支架材料在口腔软组织增厚方面的应用潜能。
1.1 材料和试剂
甲醇（汕头市西陇化工厂有限公司），纯度≥99.5%的无水碳酸钠（Sigma 公司，美国），ⅩⅣ型蛋白酶（链蛋白酶E）（Sigma 公司，美国）；
吉特瑞医用胶原基质（福州市福建博特生物有限公司），4%Biosharp 组织固定液（合肥兰杰柯科技有限公司），纯度99.9%溴化锂；
36 mm 析袋，Mas‐son 三色染色试剂盒（福州迈新生物有限公司），苏木素-伊红（hematoxylin-eosinra，HE）染色液（厦门泰普生物技术有限公司）。
1.2 不同浓度丝素蛋白多孔支架的制备与表征检测
洗净后的蚕茧壳在0.02 mol·L-1的碳酸钠水溶液中经30 min 煮沸脱胶多次、去离子水冲洗及烘干后制得蚕丝，取20 g 蚕丝于60 ℃下溶解于100 mL溴化锂（9.3 mol·L-1）溶液中，经透析、离心、过滤后获得质量分数6%的丝素蛋白原液。将原液进一步稀释为质量分数分别为1%、3%及5%后，分别加入24 孔模具中冷冻，再经真空冷冻干燥，甲醇浸泡30 min 以获得不溶性，一级水反复冲洗，真空干燥箱内干燥，最终得到3种不同质量分数的丝素蛋白多孔支架：1%记为SF1组、3%记为SF3组、5%记为SF5组。
利用EVO18 型扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）（Zeiss 公司，德国）、Nicolet 6700 型傅里叶转换红外光谱（fourier transform in‐frared spectrum，FTIR）（Thermo Scientific 公司，美国）、D8 Advanced 型X 射线衍射（X-ray dif‐fraction，XRD）（Bruker 公司，德国）、Sta205 型差示扫描量热仪（differential scanning calorimetry，D-SC）（Netzsch 公司，德国）检测3 组支架的物理表征。使用Image J 软件旋转SEM 图片的5 个区域孔隙，分析支架的孔径大小。支架孔隙率则用液体（甲醇）称重法测得，每组均取5 个样品进行测试。
1.3 支架降解性检测
将3 组支架分别称重（n=5），记录初始质量m0，在37 ℃环境下浸泡于1 U·mL-1含链蛋白酶E的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBS）中，分别于2、4、8、12、24 h及3、5、7、10、14、21 d时间点取出支架，冲洗、烘干后再次称重，记录剩余质量m1，剩余质量百分比=m1/m0×100%。
1.4 动物模型的建立
将12 只雄性新西兰大白兔（2～3 月龄，2.5～3.0 kg）随机分为3 组，根据将要植入的支架材料分别记为SF1、SF3、SF5组，每组各4只，分别于上颌左右两侧随机植入丝素蛋白支架（实验侧）及胶原基质（对照侧）。
具体术式如下：耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉实验兔，起效后于上颌切牙远中3 mm 处作一约5 mm 垂直切口达骨膜（图1A），随后沿切口向远中钝性分离黏膜，形成一“软组织袋”（图1B），然后在袋内将预先润湿修剪为5 mm×5 mm×5 mm的3 组支架或胶原基质分别植入，缝合关创（图1C、D）。术后肌注青霉素钠（1×105U·kg-1）预防感染，进软食3 d。
1.5 黏膜厚度及形态观测
分别于术前（T0）、术后即刻（T1）及术后3个月（T2）记录实验兔的黏膜厚度变化情况，黏膜厚度测量方法如下：采用10#K 锉垂直于术区黏膜刺入黏膜直达骨面，将K 锉橡胶垫与黏膜表面轻轻接触，锉尖端至橡胶垫的距离即为该处黏膜厚度（取5点记平均值）。
1.6 组织学观察
实验兔处死后切取术区及周围1 mm 范围组织，经4%多聚甲醛液固定、脱水、浸蜡、包埋后制作石蜡切片，分别利用HE 染色及Masson 三色染色切片后观察：1）材料降解程度；
2）炎症反应程度；
3）新生血管；
4）新生胶原纤维。
1.7 统计分析
本研究采用SPSS 22.0 软件处理和分析数据，所有数据的展示均采用均数±标准差（xˉ±s），采用K-S检验分析数据的正态性，并利用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）统计差异性，多组间比较采用Tukey法，检验效能取α=0.05。
2.1 丝素蛋白多孔支架的表征
图2 示：3 种不同浓度的丝素溶液冷冻干燥形成的支架都具有相互连通的不规则多孔隙结构，其孔壁呈薄叶状；
而不同浓度的支架孔径大小及孔隙率则略有不同，SF1、SF3、SF5 组的孔径分别为（80.61±30.63）、（133.40±22.85）、（34.88±15.96）μm；
孔隙率分别为95.13%±6.56%、90.05%±4.23%、86.85%±3.13%。同样的合成方法下，随着浓度的增加，丝素蛋白多孔支架的孔隙率呈递减趋势（SF1 组＞SF3 组＞SF5 组）；
而孔径大小则是SF3组＞SF1组＞SF5组。
3组支架的不同表征分析结果见图3。图3A 中3 组支架材料均在1 630 cm-1波段附近出现吸收峰，表明其主要结构为更加稳定的SilkⅡ型。图3B 的XRD 结果也显示3 种浓度的支架都在20°左右出现Silk Ⅱ结构的特征峰；
而在10°～35°区间内，SF1衍射峰比SF3 及SF5 更加陡峭，表明其结晶度更高，β 折叠结构占比更高。DSC 曲线（图3C）显示：3 组支架均在50 ℃附近出现一个吸热峰，在250～300 ℃出现第二个吸热峰，3 组材料的吸热峰和降解峰未发现明显差异，表明其结晶度或二级结构接近。热重结果（图3D）表明：3 组材料在300 ℃附近才出现了明显的失重，热重曲线接近，也说明了3组支架的主要结构相似，浓度的差异并未对其基础构象造成太大影响。
2.2 支架体外降解结果
链蛋白酶E 对3 种支架中的蛋白酶解后支架剩余质量比重的结果如图4所示：SF1、SF3、SF5三组支架的酶解趋势相似，在前7 d 最为迅速，而后逐渐变缓；
但不同SF 浓度的支架在24 h 内的质量变化稍有不同，降解量SF1组最大，随着丝素蛋白浓度的增加，SF3、SF5 组的降解量逐渐减小；
浸泡于链蛋白酶E-PBS 溶液中21 d 后，SF1、SF3、SF5组的剩余质量分别为65.85%、73.67%、76.28%。
2.3 实验兔黏膜厚度改变
图5A 显示了实验侧与对照侧3 个时间T0、T1、T2时的术区黏膜厚度变化，由此可见，3 组的实验侧在术后即刻（T1）的黏膜厚度都明显增加，除SF1 组外，增加幅度也大致相同；
而到术后3 个月（T2），SF1 实验侧与对照侧的黏膜厚度明显萎缩，SF3 组实验侧的厚度略微减少，SF5 组实验侧的厚度维持较稳定。
图5B 则进一步统计分析了术后3 个月黏膜净增厚量Δ（T2-T0）与材料收缩量Δ（T2-T1）：与术前（T0）相比，术后3 个月（T2）各组实验侧及对照侧黏膜厚度Δ（T2-T0）均有增加；
但相比于对照侧的增加量，除SF1组与对照侧的差异无统计学意义外，SF5 及SF3 组厚度的增加量均远大于对照侧（F=1 131，P＜0.000 1）；
而相对于术后即刻（T1），各组材料在3 个月后的黏膜厚度都有一定收缩量Δ（T2-T1），但是SF5＜SF3＜SF1＜对照侧（F=608.9，P＜0.000 1）。
2.4 组织学染色结果
术后3 个月的组织切片染色结果如图6 所示，图6可见对照侧的HE及Masson染色未见胶原基质残留及炎症浸润，难以明确鉴别新生组织（图6A、B），胶原纤维排列较密集（图6C）。
在SF1 组中，HE 染色也未见明显支架残留或炎症浸润，骨膜上方可见新生胶原纤维，与黏膜下层原有胶原纤维排列方向不同，之间可见较多新生血管（图6E）；
Masson 染色可见蓝染的新生胶原纤维（图6F）。
而在SF3 组中，HE 染色可见SF3 支架大部分降解，无明显炎症浸润，新生组织中可见数量较多的血管与胶原纤维，个别层面可观察到细小的、尚未完全降解的支架碎片（图6H），有的碎片周围有胶原纤维包裹，纤维中可见少量炎症细胞；
Masson 染色可见较密集的新生胶原纤维及血管（图6I）。
SF5 组的HE 染色可以明显发现支架内部仍未降解，外周被新生的胶原纤维包裹，中心部可见支架碎片残留及大量蛋白黏液渗出物（图6J），纤维包囊中可见炎症细胞浸润，如红色箭头示巨噬细胞（图6K）；
Masson 染色（图6L）可观察到材料中心的残留及大量渗出物，外周被致密的胶原纤维包裹。
支架材料用于口腔软组织增厚具有良好的应用前景，但降解过快等问题很大程度限制了诸如目前常用的胶原基质材料在软组织增厚应用的远期效果[9]。与胶原在体内的快速降解不同，结构呈高度结晶状的天然丝素蛋白在体内完全降解需要数月甚至数年[11]，且其可通过工艺改善和调节其降解性能并加工成纤维、凝胶或三维支架等各种形态[16-17]。
通常冷冻干燥法制得的丝素蛋白材料易溶于水，为了使其获得不溶性，一般采用水退火或甲醇浸泡处理，但是水退火处理后材料无定形结构更多，易降解，而经甲醇浸泡处理后会形成更多的SilkⅡ型结构，相同条件下降解速率减慢[18-20]。本研究中，SF1、SF3、SF5 主要构象也均为稳定性较高的SilkⅡ型，其体外降解速率也较以往对丝素蛋白支架的研究类似，在1周内稍快，而后降解率逐渐减慢并稳定，但总体较以往研究为慢[21-23]。结合体内病理观测到的3个月后的支架残留，可以发现除SF1 外，SF3、SF5 的降解周期要大于3个月。
不同浓度丝素蛋白也会影响支架的性能[15]，其中支架的孔隙等微观结构对细胞的黏附、增殖有着重要的影响，足够大小的孔径以及孔隙内部的相互连通对新生组织内氧的传输及代谢产物的排出十分重要[24-25]。Salem 等[25]提出，适宜的组织工程学支架孔径大小应该在30～500 μm之间。对于孔隙率而言，有研究[26-27]指出，90%以上的孔隙率可能有利于细胞长入支架内部及增殖。本研究中，除SF5 的孔径及孔隙率较低外，SF1、SF3 均满足生物应用要求。冷冻干燥制作支架的方式则能够通过冰晶的升华从而在支架内直接产生空的腔隙，其产生的孔隙最适合于细胞的生长与组织的新生。浓度增加后，丝素蛋白溶液更为黏稠，导致制取的支架孔隙随浓度增加而减小。但相比于SF3，SF1浓度低而孔径却小，可能是由于其支架结构较疏松，抗压能力较差，甲醇浸泡过程中支架体积收缩所致。
体内实验在评价材料的组织相容性方面有重要意义，对于软组织支架材料，现有研究多采用大鼠背部皮下移植或兔头皮下移植作为动物实验模型[21,23,28-32]，虽易于操作和取材观察，但无法模拟口腔内复杂的环境。本研究动物实验首次选择兔上颌前、后牙之间的口腔黏膜作为术区，不仅定点容易，左右两侧均可手术，手术仅有一垂直切口，创伤小，移植材料不易暴露，并且该处黏膜较薄，黏膜下骨面平坦，易于研究和测量取材，可重复性好，将支架材料植入此处，一定程度上能够模拟材料在口腔的受力情况。此外，尽管本实验未能模拟临床上常见的牙槽嵴缺损或软组织量不足的实际情况，但有研究[33-34]指出，人为创造的牙槽嵴缺损在短期内会产生自发性修复的现象，故本研究仅将支架材料植入黏膜下，单纯观察和对比各种材料在软组织中的支架作用和组织整合能力。
支架材料植入口腔软组织后受力复杂，手术方式、切口设计、植入物大小等诸多因素的影响使得植入部位具体的受力情况难以分析，因而难以依据机械性能对材料进行筛选或直接测量口腔内的各种作用力，体外采用生物模拟器等也难以精准模拟[35]。本研究动物实验手术前将各组材料于生理盐水中浸泡，随后将它们的厚度均修剪为5 mm，SF1 支架抗压强度显然不足，其植入实验兔口腔黏膜下后，受局部组织牵拉和表面黏膜压力的影响，连同黏膜测得厚度仅为3.52 mm±0.10 mm，而SF3 和SF5 支架在植入即刻能够维持一定的厚度（分别为4.86 mm±0.02 mm及5.01 mm±0.05 mm）。
术后3个月，术区黏膜厚度较术前均有所增加（SF1＜对照＜SF3＜SF5），但与材料植入即刻相比，SF1 组丝素蛋白支架及对照侧胶原基质收缩率较大，3个月时材料已完全降解，软组织厚度都出现了显著的减小；
SF5组支架增厚效果最明显，并且与术后即刻相比，术后3个月时黏膜厚度几乎无变化，提示在此期间，SF5组支架能够抵抗实验动物口腔内各种作用力，很好地维持了支架的空间形态。然而，其组织学染色结果显示，SF5组支架大部分未降解，内部主要为蛋白黏液渗出物，而组织长入较少，并在周围的纤维包囊中观察到了明显的炎症细胞浸润，说明SF5 植入后异物反应较重，自体细胞难以长入支架内部，材料被新生胶原纤维包裹，且炎症持续存在；
SF3组黏膜增厚效果介于SF1 组和SF5 组之间，且术后3 个月大部分已降解，有较密集的新生血管与胶原纤维，虽然在个别层面上观察到了尚未完全降解的细小支架碎片，但其周围胶原纤维包囊中炎症细胞数量已明显减少，倘若增加观察时间，这些残留材料能够完全降解的可能性很大。
不过，本研究仍存在一些局限：首先，采用穿黏膜法测量实验兔的口腔软组织厚度，虽然简便，但精确度欠佳，多点测量取平均值亦难以避免误差，且无法反映术区三维体积的变化，取模后数字化扫描-计算机重建-三维分析的方法（Moiré 法）[36]精确度更高，并且能反映特定区域组织三维体积的变化；
其次，本实验组织学观察未做免疫组化染色分析，因而无法量化分析新生血管密度等指标，后续研究中，应分阶段、系统地观察材料在体内的降解模式，并且需要更长的观察时限，从而更好地评估增厚组织长期的稳定性。
综上所述，形态学测量以及组织病理学染色结果初步证明了丝素蛋白支架应用于增厚口腔软组织的可行性，且质量分数3%的丝素蛋白支架的理化性能、组织相容性及黏膜增厚效果最佳。
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
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