投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈生长性能、肠道结构和肝脏生长相关基因表达量的影响

黄文庆，黄 龙，赖明建，李湘妮，陈佳佳，刘凤坤，徐志雄，胡俊茹

（1.广东省农业科学院动物科学研究所/农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室/广东省动物育种与营养公共实验室/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东 广州 5106 40；
2.广州飞禧特生物科技有限公司，广东 广州 510640；
3.佛山市农业科学研究所，广东 佛山 528145；
4.北部湾大学海洋学院/广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室，广西 钦州 535011）

【研究意义】大口黑鲈又称加州鲈，隶属于鲈形目（Perciformes）鲈亚目（Porcoidei）太阳鱼科（Cehtrachidae）黑鲈属（Micropterus），原产于美国加利福尼亚州密西西 比河流域［1］，具有广温性、耐低氧［2］、长速快、易捕获、无肌间刺等生物学特性。大口黑鲈已成为我国大宗特种淡水经济鱼类之一，因其肉质鲜美和营养价值高等 优点［3］而广受消费者喜爱，在国内具有广阔的消费市场。近几年大口黑鲈养殖规模和年产量快速扩增，我国大口黑鲈养殖区域主要集中分布在广东、江苏、浙江、江西、四川和福建等地［3］。据统计，2021 年全国大口黑鲈养殖产量达50 万t 以上，其中广东占比近60%。随着大口黑鲈营养需求与饲料配方技术研究的不断深入，通过开发优质实用型全价配合饲料，推广科学的食性驯化和饲料投喂技术，有望替代投喂冰鲜杂鱼的养殖模式。

【前人研究进展】人工养殖条件下鱼类的生长受环境因素和养殖管理因素的双重作用。水温是影响鱼类摄食、生长、繁殖、新陈代谢及渗透压调节等机体活动的关键环境因素之一。不同品种的鱼类适宜在不同水温条件下生长。草鱼的最适生长水温为28～32 ℃［4］，鲤鱼更适宜在20 ℃水温条件下生长［5］。陈思等［6］比较分析了17～37 ℃水温条件下龙虎斑幼鱼的生长情况，认为33 ℃水温条件下龙虎斑幼鱼生长最快。大口黑鲈的最适生长水温在20～30 ℃［7］。而养殖密度、投喂频率通常被认为是集约化人工养殖模式下影响鱼类产量的重要管理因素［8-9］。谢苏明等［10］研究认为，大口黑鲈在工程化循环水养殖条件下的适宜投喂频率为2 次/d。倪金金等［11］研究发现，大口黑鲈放养密度以0.2～0.4 kg/m3为宜，有利于促进鱼的生长和提高肝脏生长基因的表达量。王裕玉等［12］认为，在养殖前期的幼鱼阶段采取高密度养殖方式不影响大口黑鲈的生长，养成至大规格鱼种阶段再降低密度可减少应激引起的生长变缓。

【本研究切入点】大口黑鲈在养殖过程中，往往受到投喂频率、水温和养殖密度的交互影响，目前有关三因素对大口黑鲈交互作用的研究未见报道。在一定水温范围内，养殖过程中投喂频率和养殖密度与水温往往呈正相关；
但在过高的水温范围，投喂频率和养殖密度与水温呈负相关，而投喂频率与养殖密度呈正相关，尤其是在鱼苗的标粗阶段。研究发现，鱼类生长主要取决于摄食率和饲料转化率［13］，在适宜的水温范围内，鱼类对营养物质的消化和吸收与水温呈正相关［14］，而适当提高养殖密度和投喂频率，可提高鱼类的生长速度和单位养殖产量［11,15］。本试验研究不同水平的投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈的交互影响，除比较生长性能指标的差异外，还基于肠道组织发育和肝脏生长相关基因表达量作进一步探讨。【拟解决的关键问题】通过研究不同投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈生长性能、肠道组织结构和肝脏生长激素（GH）、类胰岛素样生长因子-1（IGF-1）基因表达量的影响，从而确定适宜的投喂频率、水温和养殖密度，为大口黑鲈高效养殖提供科学依据。

1.1 试验材料

大口黑鲈鱼苗购自阳山利阳水产科技有限公司。鱼苗在广东省农业科学院动物科学研究所水泥池中暂养驯化2 周，每天早、晚投喂2 次，待鱼苗健康稳定且摄食正常后，挑选规格均匀、体格健康、平均体质量为17 g 左右的鱼苗作为试验对象。试验期间各处理均投喂相同的大口黑鲈商品配合饲料（购自佛山顺德区丰华饲料实业有限公司），饲料含粗蛋白质50.68%、粗脂肪10.15%、水分8.46%、粗灰分12.57%、钙44.81%和总磷2.82%。

1.2 试验设计

试验采用3 因素（投喂频率、水温和养殖密度）2 水平（2×2×2）交互设计8 个处理（表1），各处理4 个重复。投喂频率，设 2 次/d（8:00、20:00）、3 次/d（8:00、14:30 和20:00）；
水温，设25、30 ℃；
养殖密度，设25、35 尾/缸（150 升）。投喂频率、水温和养殖密度的水平设置参考人工养殖常见管理模式和水质条件。

表1 试验处理Table 1 Experimental treatment

养殖试验于2021 年6 月在广东省农业科学院动物科学研究所室内温控循环水养殖系统中开展，系统缸水体为150 L，每4 个缸体配备一套独立循环过滤装置。采用饱食方式投喂，并根据各处理摄食情况调整投喂量。养殖试验期间为自然光照，水温根据各处理目标值设定，氨氮浓度＜0.02 mg/L，亚硝酸盐浓度＜0.05 mg/L，溶氧浓度＞5.0 mg/L，pH 7.8～8.2。养殖试验为期8 周。

1.3 样品采集和检测分析

养殖试验结束前禁食24 h，称量每缸大口黑鲈的总质量，并统计每缸的存活尾数，计算生长性能指标。从每缸中选取接近均重的6 尾鱼，测量体长，称量体质量、腹脂质量，计算形体指标。计算公式如下：

特定生长率（SGR,%/d）=100×（ln 终末均重-ln 初始均重）/试验天数；

摄食率（FR，g/尾）=摄食总量/（初始尾数+末尾数）/2；

成活率（SR，%）=100×终末鱼的尾数/初始鱼的尾数；

饲料系数（FCR）=摄食量/（终末总质量+死亡总质量-初始总质量）；

肥满度（CF，%）=100×体质量/体长3；

腹脂率（AFY，%）=100×腹脂质量/体质量。

采集3 尾鱼的前肠样品，置于福尔马林固定液中保存，用于肠道组织结构测定；
采集肝脏样品，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于GH和IGF-1基因表达量测定。

肠道组织切片：通过脱水、包埋、切片、染色、封片后使用PANNORAMIC 全景切片扫描仪进行观察，通过Image-Pro Plus 6.0 分析软件测定绒毛高度、绒毛宽度和肌层厚度。

肝脏GH和IGF-1基因的相对表达量测定：根据TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒方法提取肝脏总RNA，通过电泳检测总RNA 的完整性。采用TaKaRa PrimeSciptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒合成cDNA（-20 ℃保存待用）。应用 Primer Premier 5.0 设计引物，根据NCBI 获得的大口黑鲈转录组数据及其相关基因的全长序列设计特异性引物，所有引物（表2）均由广州兴誉生物科技有限公司合成。

表2 实时定量 PCR 引物Table 2 Real-time quantitative PCR primers

GH、IGF-1、18S和β-actin基因的表达量采用 TaKaRa TB GreenTMFast qPCR Mixc 进 行RTPCR 反应，然后采用 SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行实时定量PCR 扩增反应，反应条件为：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性5 s、58 ℃复性10 s，进行40 个循环；
熔解反应条件为65～95 ℃。反应结束后确认 RT-PCR 的扩增曲线和熔解曲线。以β-actin和18S为内参，对得到的各样品Ct值进行均一化处理，以投喂频率2 次/d 处理的各基因mRNA 水平为基准，应用2-ΔΔCt法确定不同频率处理大口黑鲈的mRNA 相对表达量。

1.4 数据统计分析

采用 SPSS22.0 软件对所有组间数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan 氏多重比较，用一般线性模型单变量方法分析投喂频率、水温和养殖密度的主效应以及交互效应。

2.1 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈生长性能的影响

单因素方差分析结果（表3）显示，处理Ⅴ的大口黑鲈特定生长率比处理Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ，分别显著提高10.16%、10.61%、9.27%和8.40%；
摄食率比处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ分别显著提高10.94%、27.02%、26.45%和17.38%，饲料系数比处理Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ，分别显著降低7.87%、8.89%和8.89%，肥满度高于其他各处理，且与处理Ⅲ、Ⅶ差异显著，腹脂率与其他处理相比差异不显著，存活率各处理间均无显著差异。主效应分析结果（表3）显示，仅养殖密度对摄食率的影响和投喂频率对肥满度的影响达显著水平。交互效应对肥满度影响达显著水平，对特定生长率、摄食率、饲料系数、存活率和腹脂率影响均未达显著水平。

表3 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈生长性能的影响Table 3 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on growth performance of largemouth bass

2.2 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈肠道组织结构的影响

单因素方差分析结果（表4）显示，处理Ⅴ的大口黑鲈肠道绒毛高度比处理Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ，分别显著提高27.12%、19.05%和27.12%。处理Ⅰ绒毛宽度比处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ分别显著提高25.00%、36.36%、25.00%、25.00%、15.38%和25.00%；
处理Ⅴ绒毛宽度比处理Ⅲ显著提高27.27%。处理Ⅰ、Ⅲ肌层厚度比处理Ⅶ分别显著提高46.15%和30.77%，其他各处理间均无显著差异。主效应和交互效应对肠道绒毛高度、绒毛宽度和肌层厚度的影响均未达显著水平（表4）。

表4 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈肠道组织结构的影响Table 4 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on intestinal tissue structure of largemouth bass

2.3 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈肝脏GH 和IGF-1 基因表达量的影响

单因素方差分析结果（表5）显示，大口黑鲈肝脏的GH和IGF-1基因表达量存在显著差异，但处理Ⅳ、Ⅷ以及处理Ⅲ、Ⅵ的GH 基因表达量组间差异不显著，处理Ⅲ、Ⅵ以及处理Ⅳ、Ⅶ的IGF-1基因表达量差异不显著，GH基因表达量大小依次为处理Ⅰ＞Ⅴ＞Ⅱ＞Ⅵ＞Ⅲ＞Ⅶ＞Ⅳ＞Ⅷ，IGF-1基因表达量大小依次为处理Ⅴ＞Ⅰ＞Ⅶ＞Ⅳ＞Ⅵ＞Ⅲ＞Ⅷ＞Ⅱ。主效应和交互效应对肝脏GH和IGF-1基因表达量影响均未达显著水平（表5）。

表5 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈肝脏GH 和IGF-1 基因表达量的影响Table 5 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on hepatic GH and IGF-1 gene expression levels of largemouth bass

3.1 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈生长性能的影响

养殖过程中鱼类摄食往往受到水温、养殖投喂频率和养殖密度等外部条件的影响。有研究报道投喂频率影响鱼类的摄食率和饲料转化率［16］，鱼类的摄食率与投喂频率在一定范围内呈正相关，对代谢速度快的肉食性鱼类可适当提高投喂频率，提高鱼类的摄食率和饲料转化率，增加营养物质的摄入，从而促进鱼类生长［17］。但过高的投喂频率，易造成营养物质消化吸收不完全排出体外，且频繁的摄食活动会增加鱼体的能量消耗，反而不利于鱼类生长［18］。研究发现，在饱食投喂的实验条件下，增加投喂频率可提高军曹鱼［17］和黄盖鲽［19］的采食量和生长速率，但谢苏明［18］研究发现，60 d 的养殖周期以2～4 次/d 的频率投喂，大口黑鲈的末均重、增重率和特定生长率无显著差异，2 次/d 的投喂频率足以满足大口黑鲈生长发育的营养需求。檀晨曦［20］研究认为，养殖花鳗鲡的最优投喂频率为2 次/d。

鱼类属于变温动物，水温是其生长发育的重要环境因子之一［21］。据报道大口黑鲈属于温水性鱼类，其最适水温为15～30 ℃，最佳生长水温为20～25 ℃［22］。杨斯琪等［23］研究发现，幼鱼阶段的大口黑鲈的最适生长水温为21～25 ℃，与本研究结果基本一致。养殖密度是决定鱼类生长速度和单位产量的主要因素之一［24］，适当提高单位养殖密度，可提高单位产量和养殖效益。但过度的高密度养殖对鱼类形成拥挤胁迫，反而对鱼类的生长起抑制作用［20］。本试验结果表明，主效应仅投喂频率对肥满度和养殖密度对摄食率的影响达显著水平，投喂频率、养殖密度对其他生长性能和形体指标的影响未达显著水平，而水温对生长性能特定生长率、摄食率、饲料系数、存活率以及形体指标的肥满度和腹脂率均无显著影响；
交互效应均仅对肥满度有显著影响，对特定生长率、摄食率、饲料系数、存活率和腹脂率均无显著影响。单因素方差分析结果显示，处理Ⅴ（3 次/d，25 ℃，25 尾/缸）大口黑鲈的特定生长率、摄食率、饲料系数显著优其他各处理，其次为处理Ⅰ（2 次/d，25 ℃，25 尾/缸），处理Ⅴ与处理Ⅰ相比，生长性能各指标无显著差异，说明本试验条件下，大口黑鲈幼鱼最适宜投喂频率为2～3 次/d，水温为25 ℃，养殖密度为25 尾/缸，这一结果与谢苏明［18］和杨斯琪等［23］的报道结果基本一致。

3.2 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈肠道组织结构的影响投喂频率

肠道是鱼类运输食物和营养物质消化吸收的重要场所［25］。在鱼类营养学领域，一般通过研究肠道组织结构来评估鱼类对营养物质的消化吸收能力，从而间接反映鱼类的生长情况。肠道绒毛长度、绒毛宽度和肌层厚度是反映肠道组织结构的3 个重要指标，其中绒毛长度和绒毛宽度可反映肠道组织消化吸收的表面积大小，而肌层厚度可反映肠道的收缩能力，可间接反映机体肠道组织的消化吸收能力。本试验肠道组织切片结果显示，投喂频率、水温、养殖密度及三因素交互作用对肠道绒毛高度、绒毛宽度和肌层厚度均无显著影响。谢苏明［18］研究发现，投喂频率对大口黑鲈肠道绒毛高度和绒毛宽度无显著影响，但2 次/d 投喂频率处理的大口黑鲈肠道肌层厚度显著厚于4 次/d 的投喂处理。本试验处理Ⅰ、Ⅴ大口黑鲈的肠道绒毛高度、绒毛宽度和肌层厚度整体大于其他处理，与个别处理差异达显著水平，这一结果与本试验大口黑鲈的生长性能特定生长率和摄食率结果呈正相关。

3.3 投喂频率、水温和养殖密度对大口黑鲈肝脏GH 和IGF-I 基因表达量的影响

鱼类的营养代谢和生长发育受到GH、IGF-1相关基因调控。鱼类的GH 主要由鱼脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌，研究发现GH 在罗非鱼肝脏中也有表达，但在肝脏中的表达量远低于脑垂体［26］。GH 作为鱼类生长发育过程中的调控因子，发挥了促进生长、调控摄食、促进蛋白质和脂肪代谢、调节鱼类渗透压和提高饲料转化率的生理作用。鱼类IGF-1 主要由GH 与靶细胞膜表面的GHR结合后，开启细胞内的信号传导机制，促成鱼类肝脏组织细胞合成和分泌一类多肽类激素［11,27］，IGF-1 在鱼类生长发育过程中发挥的主要作用是作为GH的介导激素，介导GH 促进动物机体生长的因子［28］。本研究单因素方差分析结果显示，各试验处理肝脏GH和IGF-1基因表达量均有显著差异，但无明显的规律趋势；
肝脏GH和IGF-1基因表达量各处理比较，处理Ⅰ（2 次/d，25 ℃，25 尾/缸）和处理Ⅴ（3 次/d，25 ℃，25 尾/缸）整体高于其他处理，表明大口黑鲈幼鱼在投喂频率为2～3 次/d、水温为25 ℃、养殖密度为25 尾/缸的养殖条件下，肝脏GH和IGF-1基因表达量高于其他条件。这一结果与本试验特定生长率结果一致，表明肝脏GH和IGF-1基因表达量可作为评估指标来反映鱼类的生长情况，这与谢苏明等［10］报道的观点相一致。以往关于投喂频率、水温和养殖密度三因素交互对鱼类影响的研究未见报道，本试验主效应分析结果表明，投喂频率、水温、养殖密度及三者交互效应对肝脏GH和IGF-1基因表达量均无显著影响。但肝脏GH和IGF-1基因表达量与投喂频率、水温和养殖密度均呈负相关关系，这一结果与前人研究结果基本一致。谢苏明等［10］研究发现以2 次/d频率投喂的大口黑鲈幼鱼肝脏GH（P＞0.05）和IGF-1（P＜0.05）的基因表达量高于以3 次/d 频率投喂的处理。王晓梅等［29］研究发现，胡子鲶低密度处理GH基因表达量高于高密度处理。

本试验条件下，主效应投喂频率仅对形体指标肥满度有显著影响，养殖密度仅对采食率有显著影响，水温对生长性能、肠道组织结构、肝脏GH和IGF-1基因表达量各指标均无显著影响，3 因素交互效应仅对肥满度有显著影响，对其他各指标均无显著影响。经单因素方差分析和Duncan 氏多重比较，大口黑鲈生长性能、肠道组织结构及肝脏GH和IGF-1基因表达量结果表明，本试验条件下大口黑鲈最适宜的投喂频率为2～3 次/d，水温为25 ℃，150 L 水体养殖25 尾。

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