五种杀菌剂在水稻上的吸收与传导性能研究

张硕佳, 王超杰, 徐 博, 冉刚超, 曹立冬,曹 冲, 黄啟良, 朱 峰, 赵鹏跃*,

(1. 中国农业科学院 植物保护研究所，北京 100193；
2. 河南省药肥缓控释工程技术中心，河南好年景生物发展有限公司，郑州 450000；
3. 贵州省农业科学院 植物保护研究所，贵阳 550006)

水稻病害是影响水稻健康生长和丰产丰收的重要因素之一[1]。目前，国际上普遍采用茎叶喷施化学农药的方法防治水稻病害[2]，但茎叶喷雾的防治效果会受到植株高度、冠层结构、有害生物在叶片的正面或背面的分布以及光照、温度、湿度及风速等气象因子的影响。农药对靶剂量传递过程中存在着药液蒸发飘移、弹跳破裂、因过度铺展而脱靶流失等缺陷，导致农药利用率低；
同时，农药会飘移到非靶标生物上，对非靶标生物造成危害[3]。根部施药技术是一种根据防治对象发生与为害位置，将选定剂量的农药通过撒施、种子处理、土壤处理等处理方式施用在作物根部，利用作物的蒸腾拉力把根部的农药吸收并转运到靶标部位的技术措施[4-5]。相比于茎叶喷雾施药，根部施药避免了药液飘移、弹跳、流失等缺陷，减小了对非靶标生物的危害，也避免了药剂受到外界环境的影响而分解。通过农药制剂加工技术，以农药有效成分为芯材，利用天然或人工材料将有效成分包裹加工成微囊、颗粒剂及种衣剂等剂型，通过根部施药的方式，可避免农药受光照、温度等外界环境的影响而分解，从而延长了农药持效期[6]。

农药种类的选择对于通过根部施药防治植物地上病害十分重要，选择能够被植物根部吸收并易向上传导的农药可提高防治效果[7]。农药被作物吸收转运的程度取决于其油水分配系数 (logKow)、水溶性 (Sw)、解离常数 (pKa)、农药分子质量、土壤有机质含量和外部水相的pH 值等众多因素[8-13]。通过这些因素的理论值可以快速判定农药的内吸性，但是实际生产中，每种农药在不同场景和不同植物中的吸收转运情况有所不同，选用哪种农药进行根部施药需要通过实际应用来论证[14]。

按照农药在植物体内的吸收传导性能，可将其分为内吸性和非内吸性两类。内吸性农药可被植物体吸收，从施药部位渗入到植物体内并向其他部位移动，最终达到防治病虫害的目的，该类农药受雨量、气候等环境因素的影响小[15]；
而非内吸性农药施用于种子、茎、叶片或果实上，由于大部分有效成分存留于植物体外表面，小部分有效成分虽能渗透进内表皮但不会远距离移动，使得有效成分易于脱离靶标部位，对于已受病虫害侵染的植物组织或植物的新生组织保护效果低[16]。然而，各类农药均会在植物体上表现出不同程度的渗透和扩散作用，几乎没有绝对的非内吸性农药，只是因植物种类、吸收部位、植物生长时期的不同而表现出较大的差异[17-18]。在农药制剂加工过程中，助剂的添加和使用可调节农药在靶标作物上的渗透性，从而改善农药的吸收和传导性能。三环唑、己唑醇、嘧菌酯、氟环唑和噻呋酰胺是常用于防治水稻病害的5 种不同类型的杀菌剂，其中三环唑抑制附着孢黑色素的形成，从而抑制孢子萌发和附着孢形成[19]；
己唑醇和氟环唑可破坏和阻止病菌的细胞膜重要组成成分麦角甾醇的生物合成，导致细胞膜不能形成，使病菌死亡[20]；
嘧菌酯能够抑制病原菌呼吸产能过程而使孢子萌发和菌丝侵染受到抑制[21-22]；
噻呋酰胺可抑制病原菌三羧酸循环中的琥珀酸去氢酶的活性，最终导致菌体死亡[23]。本研究通过构建室内水稻生长模型，研究根部施药后上述5 种杀菌剂在水稻幼苗根部和茎叶部的分布规律，明确在根部施用过程中影响植物对农药吸收及传输的重要因素，旨在为筛选适合水稻根部施用的药剂提供技术指导，为高效防治水稻病害提供理论依据。

1.1 供试材料与仪器

96%三环唑 (tricyclazole) 原药、96%噻呋酰胺 (thifluzamide) 原药、96%己唑醇 (hexaconazole)原药、95%氟环唑 (epoxiconazole) 原药和98%嘧菌酯 (azoxystrobin) 原药，分别购自江苏长青农化股份有限公司、海利尔药业集团公司、江苏常隆农化有限公司、浙江禾本科技有限公司和江苏连云港立本农药化工有限公司。Dispersogen LFS，诺农 (北京) 国际生物技术有限公司；
ATLOX4919-LQ-(AP)，禾大化学品 (上海) 有限公司；
SP-SC29和SP-27001，江苏擎宇化工科技有限公司；
农乳602 号，邢台市燕诚化学助剂有限公司；
BY-140，沧州鸿源农化有限公司；
丙二醇 (分析纯) 和乙二醇 (分析纯)，国药集团化学有限公司；
硅酸镁铝，苏州国建慧投矿物新材料有限公司；
消泡剂622，中农立华 (天津) 农用化学品有限公司；
有机硅消泡剂和4%黄原胶，上海源叶生物科技有限公司；
多聚甲醛，上海吉至生化科技有限公司；
色谱级乙腈，默克公司 (德国)；
N-丙基乙二胺(PSA)，安捷伦科技有限公司 (中国)；
石墨化碳黑(GCB)，天津博纳艾杰尔科技有限公司；
无水硫酸镁，上海麦克林生化科技有限公司；
氧化锆珠(1.0～1.2 mm)，北京中科捷瑞生物科技有限公司。

营养土，黑龙江五常杨晓东育苗基质加工厂。水稻种子：M163，中国农业科学院植物保护研究所提供。

高效液相色谱-串联质谱仪 (SCIEX-5 500)、数显型顶置式机械搅拌器和高性能分散机 (T25 digital ULTRA-TURRAX®) 分别购自美国AB SCIEX 公司和德国 IKA 公司。

1.2 供试杀菌剂悬浮剂的制备

由于三环唑、己唑醇、嘧菌酯、氟环唑和噻呋酰胺常见的剂型为悬浮剂，且易于制备，对操作者和环境安全性好，故本研究中将5 种杀菌剂均加工成悬浮剂用于室内试验，配方见表1。

表1 5 种杀菌剂悬浮剂制备配方Table 1 Formulations of five fungicides SC

每种悬浮剂按照水、助剂 (黄原胶除外)、原药、水、锆珠 (m(物料量) :m(锆珠量) =1.0 : 1.2)的顺序添加至容器中，使用转速为1 900 r/min 的机械搅拌器砂磨1.5 h 后，过滤去除锆珠，按照黄原胶的质量比向回收的制剂里添加黄原胶，再使用高性能分散机剪切10 min，转速为6 000 r/min。最终制得40%三环唑悬浮剂(D90：6.630 μm)、24%噻呋酰胺悬浮剂(D90：7.153 μm)、30%己唑醇悬浮剂(D90：1.795 μm)、25% 氟环唑悬浮剂(D90：2.704 μm)和25%嘧菌酯悬浮剂(D90：1.632 μm)。

1.3 水稻幼苗处理

根据预试验得到的水稻幼苗可承受的各杀菌剂的最大剂量，参考“中国农药信息网”登记中5 种杀菌剂防治水稻病害的推荐剂量[24]，最终确定在营养液培育条件下水稻幼苗的施药浓度为：每千克水三环唑100 mg、噻呋酰胺30 mg、氟环唑30 mg、己唑醇20 mg 和嘧菌酯60 mg；
在营养土培育条件下水稻幼苗的施药浓度为：每千克土壤三环唑400 mg、噻呋酰胺120 mg、氟环唑120 mg、己唑醇80 mg 和嘧菌酯240 mg。按照上述浓度对水稻幼苗进行施药处理。

待种子萌发后，将水稻幼苗分别移植到水稻营养液和营养土中栽培，进行土培试验和水培试验。当幼苗生长至三叶一心期时，按照上述施药浓度分别对水稻幼苗进行根部施药处理，其中营养液条件下，先将农药悬浮剂稀释于营养液中达到相应的浓度，然后将水稻移栽于营养液中；
在营养土条件下，先将对应剂量的悬浮剂稀释于少量水中，然后浇灌于根部附近的土壤中。分别于施药处理后4 h 和1、2、3、5、7、10、14 d 采集水稻样品。对于水培样品，采样期间及时补充试验中被蒸发和吸收的水分，使水稻幼苗在采样期间保持在相同环境条件下生长。

1.4 杀菌剂在水稻幼苗中的分布试验

先用大量水冲洗水稻样品根部表面的杀菌剂，再把茎叶部和根部分离并分别匀浆，装入封口袋中称重，于 -20 ℃冰箱储存，待测。

均参照QuEChERS 方法对样品进行提取[25]。称取样品 (茎叶部1.0 g，根部0.5 g，精确到0.01 g)于离心管中，加入超纯水 (茎叶部3 mL，根部1 mL)，静置5 min 后加入5 mL 乙腈，涡旋振荡5 min 后加入3 g 氯化钠，继续涡旋振荡5 min，以4 000 r/min 的转速离心5 min。取上清液1 mL 于装有净化剂的2 mL 离心管中 (茎叶部净化剂为50 mg PSA、10 mg GCB 和150 mg 无水硫酸镁，根部净化剂为50 mg PSA 和150 mg 无水硫酸镁)，涡旋振荡1 min 后，以4 000 r/min 的转速离心5 min，取上清液过0.22 μm 有机滤膜，用乙腈稀释至基质标准曲线浓度范围内，待测。

分析方法验证：分别配制0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 和2 mg/L 的三环唑、噻呋酰胺、己唑醇、氟环唑和嘧菌酯在水稻茎叶部和根部基质中的标准溶液，在对应的仪器条件下，绘制5 种杀菌剂的线性回归方程。根据实测质量浓度，对水稻茎叶部及根部样品进行3 个不同水平的添加回收试验，并稀释至基质标准曲线浓度范围内进样分析。每个试验重复5 次。

1.5 水稻幼苗中杀菌剂的检测分析方法

利用高效液相色谱-串联质谱仪 (HPLC-MS/MS) 测定水稻样品中的供试杀菌剂含量。使用Hypersil GOLD C18(50 mm × 2.1 mm，1.9 μm，美国赛默飞公司) 色谱柱分离目标物。柱温40 ℃；
流速0.3 mL/min；
进样量5.0 μL；
流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为乙腈，5 种杀菌剂的洗脱程序如下：

三环唑：0～1.0 min，95% A + 5% B～40% A +60% B；
＞1.0～4.0 min，40% A + 60% B；
＞4.0～4.5 min，40% A + 60% B～95% A + 5% B；
＞4.5～6.0 min，95% A +5% B。保留时间为2.29 min。

噻呋酰胺：0～1.0 min，80% A + 20% B～20% A +80% B；
＞1.0～4.5 min，20% A + 80% B；
＞4.5～5.0 min，20% A + 80% B～80% A + 20% B；
＞5.0～7.0 min，80% A + 20% B。保留时间为2.51 min。

己唑醇：0～1.0 min，80% A + 20% B～20% A+ 80% B；
＞1.0～5.0 min，20% A + 80% B；
＞5.0～5.5 min，20% A + 80% B～80% A + 20% B；
＞5.5～8.0 min，80% A + 20% B。保留时间为2.96 min。

氟环唑采用等度洗脱：0～5.0 min，50% A +50% B。保留时间为2.79 min。

嘧菌酯：0～1.0 min，80% A + 20% B～20% A +80% B；
＞1.0～5.0 min，20% A + 80% B；
＞5.0～5.5 min，20% A + 80% B～80% A + 20% B；
＞5.5～8.0 min，80% A + 20% B。保留时间为2.80 min。

质谱扫描模式为选择性多反应监测模式 (MRM)。正离子模式下：雾化气温度500 ℃，输入电压10 V，输出电压10 V，辅助气压力379.2 kPa，鞘气压力379.2 kPa，喷雾电压500 V；
负离子模式下：雾化气温度500 ℃，输入电压 -10 V，输出电压 -18 V，辅助气压力379.2 kPa，鞘气压力379.2 kPa，喷雾电压 -4 500 V。其他质谱参数见表2。5 种杀菌剂标准溶液的色谱图见图1。

图1 杀菌剂标准溶液的总离子流图Fig. 1 Total ion flow diagrams of fungicide standard solutions

表2 5 种杀菌剂的质谱参数Table 2 Mass spectrum parameters of five fungicides

1.6 转运因子计算

转运因子 (translocation factor，简称TF) 常用来评价化合物在作物中向上传导能力，通过计算5 种杀菌剂在水稻中的TF 值可评估其在水稻植株中的传导能力。计算公式为TF=Ca/Cr[26]，其中Ca和Cr分别为化合物在植物茎叶和根中的含量。TF ＞ 1 表示该化合物易于由根部向上传导。

2.1 分析方法的确证

5 种杀菌剂在水稻茎叶部和根部基质中的质量浓度与对应的响应值呈良好的线性关系，其线性方程决定系数 (R2) 均大于0.99 (表3)。

表3 5 种杀菌剂在水稻茎叶部和根部基质中的线性方程与决定系数Table 3 Linear equations and determination coefficients of five fungicides in stem, leaves and roots

添加回收试验结果 (表4) 显示，在不同添加水平下，5 种杀菌剂在水稻茎叶部及根部样品中的平均回收率在82%～117%，相对标准偏差 (RSD)均小于10%，表明该方法符合分析要求。以信噪比为10 分别计算三环唑、噻呋酰胺、己唑醇、氟环唑和嘧菌酯在不同基质中的定量限(LOQ)[27]，LOQ 范围在0.001～0.010 mg/kg 之间。

表4 5种杀菌剂在水稻茎叶部和根部基质中的添加回收率、相对标准偏差 (RSD) 及定量限 (LOQ)Table 4 Recoveries, relative standard deviations (RSD), and limits of quantitation (LOQ) of five fungicides in rice aerial portions and roots

续表4Table 4 (Continued)

2.2 杀菌剂在营养土栽培水稻幼苗中的分布

在营养土栽培条件下， 用5 种杀菌剂分别处理水稻幼苗根部后，在4 h～14 d 内其含量如图2所示，其中三环唑处理14 d 后的样品未采集，噻呋酰胺处理1 d 后及氟环唑处理4 h 后水稻茎叶部杀菌剂的含量未检出。

由图2(a)可以看出：用三环唑处理后，水稻幼苗根部三环唑的含量在4 h～2 d 内明显高于茎叶部；
处理后3 d，其根部和茎叶部的含量分别为29.96 和28.37 mg/kg，且无显著差异；
处理5～10 d后，三环唑在茎叶部的含量明显高于根部；
三环唑在水稻幼苗茎叶部的含量呈现增加的趋势，并在处理后10 d 到达最高值75.88 mg/kg，而在水稻幼苗根部中，三环唑含量保持在20.00～41.64 mg/kg范围内。该结果表明，三环唑能够被水稻幼苗根部吸收，并能够迅速向上传导到茎叶部位，具有良好的向上传导性能。

图2 营养土栽培条件下，根部施药后水稻茎叶部和根部中的杀菌剂含量Fig. 2 Fungicide dose distributions in rice aerial portions and roots after root application under soil cultivation

在用噻呋酰胺、己唑醇、嘧菌酯和氟环唑进行根部处理4 h～14 d 内，水稻幼苗根部的杀菌剂含量远远高于茎叶部位 (图2 (b～e))。例如，在全部采样期间内，己唑醇在幼苗根部的含量保持在4.51～5.52 mg/kg 范围内，无明显变化；
而幼苗茎叶部的己唑醇含量仅为0.37～0.83 mg/kg。用嘧菌酯、噻呋酰胺和氟环唑处理后4 h～2 d 内，幼苗根部的含量保持增加的趋势，3 d 后趋于稳定。用噻呋酰胺和嘧菌酯处理后，幼苗茎叶部杀菌剂含量在10 d 前呈现增加趋势，14 d 后有所下降；
而己唑醇处理后，幼苗茎叶部的杀菌剂含量在5 d 前呈现增加趋势，7 d 后呈现下降趋势。由于水稻的生长稀释及植物对杀菌剂的代谢作用，虽然水稻根部能够不断吸收杀菌剂，但部分杀菌剂在幼苗相同部位的含量出现随采样时间延长而下降的现象。该结果表明，噻呋酰胺、己唑醇、嘧菌酯和氟环唑虽然能够被水稻幼苗根部吸收，少部分杀菌剂可向上传导到茎叶中，而大部分仍在根部分布，向上传导性能较差。

2.3 杀菌剂在营养液培养水稻幼苗中的分布

在营养液培养条件下，用5 种杀菌剂悬浮剂分别处理水稻幼苗根部，在处理后4 h～14 d 内各杀菌剂在水稻茎叶部和根部的含量如图3 所示，其中三环唑于处理14 d 后的样品未采集。

图3 营养液培养条件下，根部施药后水稻茎叶部和根部中的杀菌剂含量Fig. 3 Fungicide dose distributions in rice aerial portions and roots after root application under nutrient solution cultivation

由图3(a)可以看出：用三环唑处理后，水稻幼苗根部三环唑的含量在4 h～2 d 内明显高于茎叶部；
处理后3 d，其在根部和茎叶部的含量分别为351.31 和345.53 mg/kg，且无显著差异；
处理5～10 d 后，其在茎叶部的含量明显高于根部；
三环唑在水稻幼苗茎叶部的含量在处理5 d 后呈下降趋势，而在根部中剂量保持在253.08～351.31 mg/kg 范围内。该结果表明，三环唑先被水稻幼苗根部快速吸收并达到一定浓度，然后向上传导到茎叶部位，与营养土培养的结果类似。

除三环唑外，其他4 种杀菌剂在水稻幼苗茎叶部的含量在4 h～14 d 中均呈现上升趋势 (图3(b～e))。处理后14 d，己唑醇和氟环唑在茎叶部的含量与根部无明显差异，而噻呋酰胺和嘧菌酯在整个采样时期茎叶部的含量均低于根部。与营养土培养结果相比，噻呋酰胺、己唑醇、嘧菌酯和氟环唑也能够被水稻幼苗根部吸收并向上传导，其中水稻幼苗在营养液中对己唑醇和氟环唑向上传导的效果更好。在营养液培养条件下，噻呋酰胺和嘧菌酯大部分仍分布在根部，向上传导性能较差，该结果与营养土培养类似。

2.4 5 种杀菌剂在水稻上的吸收传导性能

根据在水稻茎叶部和根部样品中检测出的5 种杀菌剂的含量，分别计算营养土和营养液培养模式下水稻对5 种杀菌剂的TF 值，结果见表5。在营养土培养模式下，三环唑处理后4 h～10 d，TF 值一直保持增长的趋势，10 d 时达到最高值(1.93)；
在营养液培养模式下，三环唑TF 值呈现先增长后稳定的趋势，3 d 达到0.98，5 d 后TF 值均大于1，表明三环唑在植物中具有良好的向上传导性能。在营养液培养模式下，氟环唑和己唑醇TF 值也保持一直增长的趋势，14 d 时TF 值达到1 或以上；
而在营养土培养模式下，己唑醇和氟环唑TF 值较低，可能是受到土壤对已唑醇和氟环唑的吸附作用影响。在两种培养模式下，噻呋酰胺和嘧菌酯的TF 值均小于1，均呈现先增加后降低的趋势，表明噻呋酰胺和嘧菌酯在水稻幼苗体内的向上传导性能较差。

表5 5 种杀菌剂在水稻上的转运因子TF 值Table 5 TF values of five pesticides in rice

在预试验中，分别研究了水稻幼苗可承受的各杀菌剂的最大浓度，并以此作为施药浓度。由于不同杀菌剂对水稻生长的影响不同，最终5 种杀菌剂对水稻幼苗根部施药的浓度有一定差异。本文研究在水稻幼苗最大承受浓度下不同杀菌剂在水稻上的吸收传导性能。另外，在农药制剂加工过程中，助剂的加入可改善农药在靶标作物上的渗透性。本研究中，5 种悬浮剂制备时使用的助剂均为常规产品，虽然部分助剂添加量有少许不同 (如表1 所示)，但对其有效成分渗透性的影响较小。

本研究建立了水稻幼苗茎叶部和根部中三环唑、噻呋酰胺、己唑醇、氟环唑和嘧菌酯5 种杀菌剂的QuEChERS 样品前处理方法和HPLCMS/MS 检测方法，该方法操作简便，灵敏度和准确性均符合农药分析检测要求。利用该方法研究了在营养土和营养液培养条件下5 种杀菌剂在水稻幼苗中的吸收传导行为。结果表明，5 种杀菌剂均可被水稻幼苗根部吸收并向上传导，但吸收传导性能受到杀菌剂本身性质等因素影响，其中三环唑在营养土和营养液培育试验中，相对于100 mg/kg 的营养液施药浓度和400 mg/kg 的营养土施药浓度，水稻茎叶部的含量在营养土培育中最高可达到75.88 mg/kg，在营养液培育中可达到655.84 mg/kg，表明三环唑在水稻中表现出良好的吸收和向上传导性能，而水稻幼苗对于其他4 种杀菌剂的吸收传导性能较差；
5 种杀菌剂在营养土和营养液两种不同的培育条件中吸收传导性能差异较大，表明了土壤对杀菌剂的吸附会影响植物对杀菌剂的吸收及传导。因此，与其他4 种杀菌剂相比，三环唑更加适合水稻根部施药，更易于通过根部吸收后向上传导，并抵御植物病害的侵染。结合不同种类杀菌剂的防治对象，在水稻苗期根部施用三环唑可有效预防稻瘟病的发生。

然而，目前三环唑在水稻上常用的施药方式是茎叶喷雾，根部施药的应用较少。作为一种保护性杀菌剂，三环唑需要在病害潜伏期施用以减少其对植物的侵染。若提前进行茎叶喷雾会导致杀菌剂因受到光照、空气、水和微生物的影响而分解，还存在药液飘移、弹跳、流失等问题。相比茎叶喷雾方式，根部施药能够避免喷雾过程中药液流失的问题，而且不受雨量、风速等环境因素的影响，从而可有效提高农药利用率。目前，根部施药的剂型以颗粒剂为主，可按规定药量通过撒施的方式施药。在颗粒剂研发过程中，可先通过对农药内吸传导性能的筛选，选择合适的农药有效成分进行研发并登记使用，该方法是一种可以提高农药利用率且对环境友好的技术手段，对于农药安全使用具有重要意义。

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