红花调控皮肤色素沉着网络药理学分析及实验验证＊

常 霞，杨凯业，韩 萍，刘光荣，刘晓英，杜志云＊＊

（1.广东工业大学生物医药学院 广州 510006；
2.无限极（中国）有限公司 江门 529000；
3.佛山市康伲爱伦生物技术有限公司 佛山 528231）

皮肤色素沉着是人体皮肤由于多种原因损伤而使皮肤呈现不同颜色、不同范围及深浅各异的色素变化，是一种常见的多发性皮肤疾病[1-2]。皮肤色素沉着主要是由表皮黑素细胞产生的黑色素的结果，黑素细胞活性、黑色素的类型和分布，是皮肤色素沉着多样性的主要驱动因素[3-4]。皮肤色素沉着病因复杂，紫外晒伤、黑色素合成异常、氧化损伤、炎症反应及内分泌异常等均影响皮肤色素沉着[5]。黄褐斑、晒斑、炎症后色素沉着等常见皮肤色素沉着疾病，不仅损伤了患者皮肤的健康和美观，还对其心理健康造成极大危害。目前，常采用激光的方法进行皮肤色素沉着的治疗，但该方法具有色素去除不彻底、形成永久斑点和皮肤损伤等问题，而氢醌、氨甲环酸等药物也具有过敏和干燥的副作用，不能长期使用。鉴于目前皮肤色素沉着治疗效果不理想、难以根治的现状，开发新型抗皮肤色素沉着的药物迫在眉睫。

红花（Carthamus tinctorius L.）又称草红花或刺红花，在历代医书及《本草纲目》中均有详细记载，具有活血通经、祛瘀止痛的效果，现常用于心血管、痛经闭经和跌打损伤等疾病[6]。红花主要化学成分是红花甙、前红花甙、红花黄色素、绿原酸、儿茶酚等。它是应用最广泛的活血化瘀药剂之一[7]，在皮肤方面，红花可减轻皮肤氧化损伤，治疗硬皮病，促进和毛发生长[8-10]，酪氨酸酶（Tyrosinase,TYR）是黑色素合成关键调节酶，近期有报道红花中的黄色素具有抑制TYR的作用，呈剂量依赖性[11]，红花种子乙酸乙酯组分对蘑菇酪氨酸酶有明显的抑制作用[12]，红花和丹参中原儿茶醛、羟基红花黄和丹参酮具有较高的TYR抑制活性[13]，临床上，研究应用口服红花逍遥片，同时配合氨甲环酸片和激光的治疗策略，能有效淡化患者色斑，降低复发率与不良反应发生率[14]。然而，红花调控皮肤色素沉着的研究主要集中于不同活性物对TYR的调控，对于皮肤色素调控机制研究相对较少，限制了红花在皮肤色素调控中应用。本研究首次利用网络药理学结合蛋白芯片的方式对红花调控皮肤色素沉着的调控机制进行初步研究，通过中药系统药理数据库和分析平台数据库查找红花活性物和皮肤色素沉着的靶标，并构建“成分-靶点-疾病”的网络，分析筛选出红花调控色素沉着的关键靶点和通路，并采用动物模型和蛋白芯片的检测方式，对部分调控靶点进行验证，为进一步研究红花治疗抗色素沉着疾病的作用机制提供理论基础（图1）。

图1 红花调控皮肤色素沉着研究的流程图

1.1 红花相关靶点的筛选

以红花作为关键词，在TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和SymMap（http://www.symmap.org/）收集红花的活性成分，筛选标准为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，同时收集和整理出活性成分对应的靶标。

1.2 色素沉着相关靶点的筛选

以“skin hyperpigmentation”和“skin pigmentation”为关键词，通过Gencards数据库（https://www.genecards.org/）以Relevance score＞20为原则选取目标靶点，参考相关文献对未筛选的靶点进行补充，删除重复值后得到与疾病发生发展相关的靶点。随后，利用Venny 2.1.0绘制韦恩图，获得红花治疗皮肤色素沉着的交集靶点。

1.3 蛋白相互作用PPI图

利用STRING数据库（https://string-db.org/）对交集的靶点进行蛋白相互作用分析，获得潜在靶点的相互作用的图，可根据相互作用的边的数量，预估靶点的重要性。

1.4 通路富集分析

将红花调控皮肤色素沉着的交集靶点导入David信息平台（https://david.ncifcrf.gov/），设置阈值为P＜0.05，进行KEGG信号通路富集分析。随后利用PubMed数据库对通路进行搜索，去除与皮肤色素沉着文献报道不相关的通路，最后获得红花调控皮肤色素沉着的潜在调控通路。

1.5 成分-靶点-通路网络构建及可视化

1.6 动物实验

1.6.1 动物

健康成年的花色Hartly豚鼠，SPF级，雌性，8周龄，体质量250±80 g，24只，采购自广东医学院实验动物中心（44007200086389）。实验动物采取自由进食和饮水，饲养条件温度为18-25℃，相对湿度为50%-70%。

1.6.2 试剂和仪器

抗MITF（microphthalmia-associated transcription factor，MITF），抗p38，抗 磷 酸 化p38，抗ERK（extracellular signal regulated kinase，ERK），抗磷酸化ERK，抗JNK（C-Jun,N-terminal kinase，JNK），抗磷酸化JNK，购自Affinity，根据提供的抗体，定制蛋白芯片（生物素标记的抗体阵列，载玻片格式）由RayBiotech（广州RayBiotech，中国广州，20190818）制备。硫化钠、乙醇，无锡市展望化工试剂有限公司；
红花，北京同仁堂。

FA1004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
离心机Z326K，德国Hermle公司；
北京博仪恒业科技发展有限公司。

1.6.3 样品制备

将红花经粉碎过14目药典筛，取50 g碎粉，按料液比（g·mL-1）为1:20加入70%乙醇溶液，经超声波在常温条件下处理30 min后，再置于80℃保温提取1.5 h，提取液经过滤离心，于60℃浓缩至含生药量为1 g·mL-1的红花粗提取物，将其置于4℃冰箱密封保存，备用。

1.6.4 UVB照射豚鼠动物造模、分组及给药

当前微课、慕课建设潮流已经形成，各高校和中小学也投入了相当物力和人力，但教育资源形成后又难以融入日常教学体系，如果不能进入应用的良性循环之中，而是陷入制作——待用——搁置乃至最后失去使用价值的不良循环中，这无疑是巨大浪费。

参考文献[15]方法构建豚鼠皮肤色素沉着动物模型，豚鼠分为3组，空白组，模型组，红花实验组，每组6只。剃除豚鼠颈背部位置的毛发，直至完全显露，为保证效果，显露部分皮肤用浓度为6%硫化钠涂抹在豚鼠上述位置，使绒毛充分脱掉，选择1.5 cm×1.5 cm独立的棕色皮肤区域，模型组和实验组每日20 min UVB照射，照射10天，照射区域的色素明显加深，皮肤粗糙脱屑，色素沉着的模型造模成功。实验组开始涂抹给药，红花组涂抹100 µL（200 µg·mL-1）每天1次，持续20天。实验结束后，对老鼠背部的皮肤进行拍照，随后老鼠脱颈处死，分别取其脱毛部位皮肤组织，将皮肤组织分为2份，1份用于Fontana-Masson染色，1份放置-80℃保存，用于后续检测。

1.6.5 蛋白芯片法检测靶蛋白的表达

称取皮肤组织0.1 g，加入裂解液制成匀浆，离心机12000 r·min-1离心15 min，吸取上清液，-20℃保存，BCA法测定蛋白浓度，随后根据美国Raybiotech公司定制的抗体蛋白芯片操作方法进行测试，添加生物素对蛋白进行标记，将标记的蛋白稀释到500µg·mL-1，与载有抗体的蛋白芯片过夜孵化。洗涤后，用Cy3标记的亲和素混合物共同孵育2 h，随后用InnoScan 300芯片扫描蛋白芯片，检测荧光信号，用内部阳性对照和RayBiotech分析工具对信号进行读取和归一化。

1.6.6 统计学处理

组织的染色图片采用Image Pro Plus6.0软件对图像进行分析，计算表皮基底层黑色素细胞的积分光密度（光密度和切片面积的比值）；
芯片信号选取可信值进行数据分析及对比，用SPSS19.0软件统计分析，并采用t检验分析显著性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 红花的有效成分及其作用靶点的筛选

通过TCMSP平台，分别以红花为关键词进行筛选，筛选标准为OB≥30%，DL≥0.18，共获得22个成分（表1）。利用TCMSP平台和SymMap平台，分别对成分的靶点进行收集和去重，有2个成分6-Hydroxynaringenin和lupeol-palmitate，未收集到调控靶点，最后共得到20个成分的351个靶点。目前TCMSP是中药主要查询平台，部分活性物收录不全，存在局限性，研究中同时结合SymMap平台进行活性物靶点的补充。

2.2 红花调控色素沉着的“成分-靶点”预测

以“skin hyperpigmentation”和“skin pigmentation”为关键词，通过Gencards和DisGeNET数据库筛选靶点删除重复项，共获得12122个靶点；
以Relevance score＞20为原则选取目标靶点，获得203个疾病靶点。红花活性成分的靶点和色素沉着的靶点利用Venny 2.1.0进行交集分析，并绘制韦恩图，获得潜在作用靶点26个（图2）。

图2 红花与皮肤色素沉着交互的26个靶点

2.3 潜在靶点的PPI互作网络分析

红花调控皮肤色素沉着交集靶点蛋白相关作用网络见图3，包含26个蛋白节点，224条相互作用的关系。从图中可以看出，关键节点主要包括Akt1（protein kinase B,Akt1）、VEGFA（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、TP53（Transformation-Related Protein 53,TP53）、EGFR（epidermal growth factor receptor,EGFR）、MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1/ERK2）、TNF（tumor necrosis factor,TNF）、IGF1（Insulin-like growth factor 1,IGF-1）等，这些靶点可能是红花调控皮肤色素沉着的的核心靶点。

图3 潜在靶点调控网络图

2.4 通路富集分析

利用David数据库对红花及皮肤色素沉着的候选作用靶点进行富集分析。KEGG通路分析筛选得到146条通路（P＜0.05），结合文献检索出色素沉着调控相关的通路，将无文献报道通路剔除，共得到10个色素调控机制相关的通路。按通路富集的靶点数（n）进行排序见表2。

表2 通路富集分析信息

2.5 Cytoscape网络图

将红花有效成分、共同靶点、疾病通路信息上传Cytoscape 3.7.2得到有效成分-靶点-疾病通路网络图。红花中调控皮肤色沉着的主要活性物有9个，根据节点的度值和此节点边的条数进行分析，均排名前3的活性物分别为槲皮素（24）、木犀草素（13）、黄芩素（9），提示以上成分是红花调控色素沉着的潜在活性成分；
红花调控皮肤色素沉着的交集靶点26个，根据靶点与活性成分相互作用的次数进行排序，排名前4的靶点分别为AKT1、TNF、MAPK1、VEGFA，提示以上靶点是潜在调控皮肤色素沉着的关键靶点；
根据KEGG通路富集分析的P值排序，排名前6为的通路分别为黑色素瘤、EGFR、P13K-Akt、MAPK、HIF-1和TLR信号通路，提示以上信号通路的可能性与准确性较高。结合网络药理分析结果，后续动物实验选择MAPK1靶点及MAPK通路作为验证的目标（图4）。

图4 红花成分-靶点-信号通路网络

2.6 红花抗皮肤色素沉着动物实验

皮肤组织的黑色素染色的结果见图5，空白组的在基底层、棘皮层和毛囊有少数黑素颗粒（a），模型组的基底层和棘皮层可见大量的黑素颗粒，呈现连续分布（b），红花组在基底层可见少量的黑素颗粒（c）。利用软件计算表皮基底层黑色素细胞的积分光密度（d），模型组与空白组的积分光密度差异显著（P＜0.01），相对于模型组，红花组的黑素颗粒积分光密度显著降低（P＜0.05）。

图5 豚鼠皮肤组织的Fontana-Masson染色图和积分光密度（200×）

利用蛋白芯片检测皮损组织中相关色素沉着的MAPK/MITF通路靶点的荧光信号数值，每个样品有3个荧光信号。其中不同组之间的相对于模型组的信号差异见表3。其中空白组与模型组相比，模型组的MITF（P＜0.05），p-ERK（P＜0.05）表达量显著上调。红花组与模型组相比，红花组的MITF（P＜0.01）、p38（P＜0.05）、p-p38（P＜0.01）、p-ERK（P＜0.05）、p-JNK（P＜0.05）的表达均显著下调。蛋白芯片的结果验证了红花可通过调控MAPK通路的靶点，进而抑制MITF的表达，减轻皮肤色素沉着的作用。

表3 色素沉着蛋白芯片的荧光信号数值（xˉ±s，n=6）

网络药理学利用分析药物与疾病相关的通路靶点，可预测药物的治疗效果，具有提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用的优势[16]，通过参考网络药理学评价方法指南，将不同平台数据信息收集和分析，利用该方法进行红花治疗皮肤色素沉着调控机制的探索，指导后续实验验证[17-18]。

通过网络药理学的方法，预测出红花治疗皮肤色素沉着的功效成分20个，分别为槲皮素、黄芩素、山奈酚、儿茶素、芍药苷、β-谷甾醇、豆甾醇等，其中槲皮素、木犀草素、黄芩素的作用靶点较多，可能是红花潜在的作用成分。槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血压、降血糖、抑制癌细胞生长等功效，在色素调控方面，槲皮素以竞争性抑制剂的形式与TYR相互作用[19]，槲皮素对黑素细胞没有杀伤作用，其抗炎和抗氧化的功能，可保护黑素细胞损伤[20]。黄芩素通过激活MAPK中ERK信号通路抑制黑素生成，同时黄芩素可通过激活转录因子2（Nrf 2）信号通路，保护黑色素细胞免受氧化应激损伤[21-22]。木犀草素具有抗炎和抗敏的功效，木犀草素可通过抑制CREB和MITF介导的TYR的表达来抑制黑色素的合成[23]。由此可见红花中的活性成分，具有抗炎，抗氧化的效果，同时参与黑色素合成调控和抑制TYR的效果，并对黑素细胞没有损伤，没有影响到皮肤黑色素细胞的正常生理功能。

红花活性成分收集到351个靶点和26个交集靶点，蛋白相互作用于KEGG分析，预测红花参与色素沉着的主要调控通路有黑色素瘤、P13K-Akt、MAPK、EGFR、HIF-1和TLR信号通路，关键靶点为Akt1、TP53、EGFR、MAPK1、VEGFA、TNF。皮肤色素沉着与黑色素瘤调控密切相关，皮肤恶性黑色素瘤风险的增加与色素沉着基因的变异有关。Akt1可与PI3K产生级联反应，可保护黑素细胞免于凋亡[24]，PI3K/AKT通路在黑素细胞存活中起着关键作用。MITF是黑色素合成的主要的调节因子，可调控TYR、TRP-1、TRP-2，促进黑色素的合成，其受体介导MAPK信号通路，其中ERK、JNK和p38是MAPK通 路 的 关 键 蛋 白。MAPK1又名ERK2，他是MAPK信号通路中的关键靶点，临床上药物大沙替尼就是调节ERK/CREB/MITF通路抑制正常人黑素细胞中的信号转导[25]。表皮生长因子EGF及其信号通路抑制激光诱导的黑色素生成[26]，外泌体miR-21对紫外线刺激的黑色素生成的抑制作用可能与EGFR的激活有关[27]。临床实验中EGF软膏可作为激光治疗晒伤的有效辅助手段[28]。p53在晒黑反应和病理性色素沉着中的发挥重要作用，p53直接调控紫外线诱导产生的POMC/MSH的表达[29]，同时p53是调控角质细胞-黑色素细胞信号周期的重要组成部分[30]。HIF-1通路与细胞氧化损伤相关，通过抑制缺氧引起的HIF-1α蛋白上调，可抑制黑色素瘤细胞A375增殖和迁移[31]，UVB通过p38/HIF-1通路可诱导人角质形成细胞的凋亡[32]。黑色素生成能显著刺激血管生成的表达[33]，正常人黑素细胞VEGFR-2表达显著上调，临床发现黄褐斑皮损部位真皮血管密度增加和VEGF过度表达的现象[33]。最新研究表明，天然免疫刺激通过TLRs影响黑素合成和黑素小体运输，调节皮肤色素沉着，其中TLR4和TLR9分别通过p38和NF-κB信号通路促进酪氨酸酶的表达和黑素生成[35]。TNF肿瘤坏死因子与IL-17联合PKA和MAPK信号通路抑制黑色素的形成[36]。预测的结果和已有的研究发现，红花参与色素沉着的调控的信号通路和靶点大都涉及细胞代谢、黑色素合成、光损伤、氧化应激、免疫调控等环节。

为了验证网络药理的部分预测结果，本研究检测了豚鼠皮肤组织中黑色素合成相关的MAPK通路相关靶点，包含MITF、ERK、p38、JNK等。结果表明：红花提取物能使减轻紫外诱导的豚鼠皮肤色素颜色及损伤的症状，降低皮肤组织中MITF、p-ERK、p-p38、p-JNN蛋白的表达，此结果与网络药理学的预测结果一致。

综上所述，本研究初步揭示了红花治疗皮肤色素沉着的潜在活性成分及其可能的作用机制，红花中槲皮素、木犀草素、黄芩素为潜在色素沉着的药效成分，其潜在的调控靶点为Akt1、IL-6、VEGFA、MAPK1等，主要涉及的通路有黑色素瘤、PI3K-Akt、MAPK、TLR和HIF-1信号通路等，网络药理的分析结果预测了红花通过抑制黑色素合成、减轻氧化损伤、抑制炎症反应发挥治疗皮肤色素沉着的作用，并进一步经实验证实，红花可通过抑制MAPK/MITF通路中蛋白的表达，发挥治疗皮肤色素沉着的功效，红花在色素沉着中关于氧化应激和免疫调控功效验证，以及红花中主要活性成分的物质基础分析和应用还有待深入研究，本研究可为进一步红花治疗皮肤色素沉着的调控机制和应用研究提供参考。

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