网络药理学探究丹参治疗冠心病合并抑郁或焦虑障碍的潜在机制
时间：2022-12-08 18:05:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
王怡雯，韩 拓，王丽霞，范雅洁，李 盈，张 婷，姚智会，王聪霞
（西安交通大学第二附属医院心血管内科，陕西西安 710004）
随着社会老龄化和生活方式改变，心血管疾病已经成为危害我国居民生命健康的头号杀手。据统计，2013 年我国心血管疾病患病人数已达2.9 亿，其中冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）1 100 万，老龄人群中冠心病患病率更是显著增加[1]。同时，冠心病死亡率居高不下，2016 年中国城市和农村居民冠心病死亡率分别为113.46/10 万和118.74/10 万，造成严重的卫生健康负担[1]。此外，心血管疾病多属于长期慢性疾病，患者普遍存在焦虑、抑郁等心理健康问题[2]。然而，目前临床上对于冠心病合并抑郁或焦虑患者仍缺乏足够关注和有效干预措施。
传统中药制剂如通心络胶囊、复方丹参滴丸、芪参益气滴丸等，对于缓解情绪紧张、睡眠障碍等具有良好效果[3]。丹参作为一种经典的传统中草药，已被广泛用于临床冠心病、心绞痛患者治疗中[4-6]。丹参具有的抗炎、抗氧化作用，能够改善心肌缺血或急性梗死后心室重构和心功能[7-8]。此外，有研究报道，丹参所具有的清心除烦功效，可以改善急性心梗患者支架术后的焦虑状况[9]。然而，有关丹参改善冠心病合并抑郁或焦虑障碍的潜在作用机制尚有待明确。
本研究回顾性收集我院心血管内科收治的稳定型冠心病患者，调查中药复方制剂在冠心病治疗中的使用情况，并基于网络药理学方法，探究丹参及其活性单体成分在冠心病合并抑郁和（或）焦虑障碍患者中的潜在作用机制，以期为后续相关研究提供理论依据。
1.1 临床病例资料的收集
连续收集2021 年3 月至4 月间西安交通大学第二附属医院心血管内科收治的冠心病患者，排除急性冠脉综合征、临床资料不完整者，最终纳入147 例患者。所有患者诊断均经冠脉CTA 或冠脉造影证实存在冠状动脉管腔狭窄＞50%。收集患者基本信息、合并基础疾病情况、常规生化检查、用药情况及中药制剂使用情况。本研究中所有患者个人隐私信息已经匿名化处理，研究符合西安交通大学第二附属医院临床伦理委员会要求。
1.2 丹参活性成分及靶点预测
利用TCMSP 数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以“丹参”为关键词进行检索，根据单体化合物的口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%和类药性（drug likeness,DL）≥0.18，筛选有效化合物单体。基于PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索各化合物单体，从而获得各单体化合物对应理化特性与其SMILES 结构式。利用SwissTargetPrediction 在 线 数 据 库（http://www.swisstargetprediction.ch/）检索各化合物结构式进行匹配，获取对应单体成分预测靶点。归总所有预测靶点并删除重复基因后，筛选出中药丹参潜在作用靶点。
1.3 疾病靶点预测与中药-疾病靶点匹配
基 于OMIM（https://www. omim. org/）、Gene-Cards（https://www. genecards. org/）及Therapeutic Target Database（http://db.idrblab.net/ttd/）数 据 库[10]，通过关键词“depression”和“anxiety”检索所有与抑郁和焦虑相关基因，归纳并删除重复项，获得疾病相关基因。基于在线Venny 软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对丹参与抑郁和焦虑相关靶基因进行匹配，获得中药-疾病共同相关基因。
1.4 蛋白-蛋白互作网络分析
基于String 数据库（https://string-db.org/）对匹配基因进行蛋白-蛋白互作网络分析（Protein-Protein Interaction, PPI），将分析结果导入CytoScape 软件，网络分析获得每个节点的度（degree）和接近中心性（closeness centrality）等并进行排序，获得中药-疾病网络枢纽基因。
1.5 基因功能富集分析
基于R Studio 软件（https://www.rstudio.com/）调用clusterProfiler 安装包和org.Hs.eg.db 注释包，进行靶基因GO（Gene Ontology）与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析和功能注释，包括分子功能（molecular function,MF）、生物学过 程（biological process, BP）和 细 胞 定 位（cellular component, CC）。
1.6 中药-靶点-疾病网络图
基于CytoScape 软件，将丹参化合物单体与丹参-抑郁和（或）焦虑相关基因进行匹配（compoundtargets-disease, C-T-D），建立中药-靶点-疾病网络。节点大小和（或）颜色深浅直观反映网络中各节点度的高低。
1.7 数据分析
采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，计数资料用例数和百分率[n(%)]表示。两组间均数比较采用两独立样本t检验或Wilcoxon秩和检验，构成比的比较采用卡方检验或Fisher精确检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。
2.1 研究对象组间基本资料的比较
研究最终纳入147 例稳定型冠心病患者，其中女性60 例（40.8%），平均年龄（62.76±10.91）岁；
其中72 例（49.0%）合并有高血压，38 例（25.9%）合并2 型糖尿病，18 例（12.2%）合并不同程度睡眠障碍。冠心病患者中普遍使用降脂药（94.6%）和抗血小板药物（85.7%）。不同性别组间比较，男性患者平均年龄小于女性患者（P＜0.05），而女性患者中合并睡眠障碍者较男性更普遍（20.0%vs. 6.9%,P＜0.05）。男性中AST、ALT 指标均升高，而总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）均较女性偏低（均P＜0.05），这可能与男性患者中他汀类降脂药使用及其肝脏副作用有关。不同性别之间心肌酶谱与肌钙蛋白I 无明显差异。此外，男性患者中抗血小板药物（如阿司匹林）和β受体阻滞剂（如美托洛尔）使用频率均高于女性（均P＜0.05），而女性其他药物（主要是阿普唑仑、劳拉西泮）的使用远高于男性（21.7%vs.6.9%,P＜0.05），这可能与女性患者中合并睡眠障碍比例较高有关。
2.2 中药复方制剂在冠心病治疗中的使用情况
舒血宁（44.9%）、丹参（27.9%）及大株红景天（21.8%）是冠心病临床治疗中最常用的中药复方制剂或注射液，且不同性别之间使用频率无显著差异（图1）。
图1 冠心病临床治疗中药制剂使用情况（A）及性别组间差异（B）Fig.1 The use of Chinese herbal compound for clinical treatment of CHD (A)and gender difference (B)
2.3 丹参活性单体及下游靶点预测
丹参是草本科植物Radix Salviae干燥后的根茎，主要产自中国、朝鲜半岛等东亚地区。本研究基于TCMSP 数据库，检索关键词“Danshen”共查找到丹参202 种活性成分。根据生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18），筛选出50种潜在药物单体（表1）。基于PubChem 网站分别检索相应化合物单体，获得其对应理化特性与结构式，通过SwissTargetPrediction数据库进行匹配，筛选出对应单体成分靶点预测评分最高的前15 个靶点基因。归总所有预测靶点并删除重复基因后，最终筛选出246 个丹参潜在作用靶点。
表1 冠心病患者不同性别组间基本资料的比较Tab.1 Comparison of clinical characteristics between genders
2.4 抑郁焦虑疾病相关基因与靶点匹配
通过OMIM、GeneCards和TTD疾病数据库，检索关键词“depression”和“anxiety”获取疾病相关基因，归纳后删去重复基因，最终筛选出505个抑郁相关基因和410个焦虑相关基因。将丹参下游预测靶点与失眠相关基因取交集，得到25个共同基因（表2，图2）。其中包括儿茶酚-O-甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase,COMT）、5-羟色胺1A 受体（5-hydroxytryptamine receptor 1A,HTR1A）、淀粉样β蛋白A4蛋白（amyloidbeta A4 protein,APP）、多巴胺受体（dopamine receptor D4, DRD4）、μ 型阿片受体（mu-type opioid receptor,OPRM1）等与睡眠、情绪及昼夜节律密切相关基因。
图2 丹参-抑郁-焦虑匹配基因Fig.2 Danshen-Depression-anxiety matching gene
表2 基于TCMSP 预测丹参中药成分（OB≥30%，DL≥0.18）Tab. 2 Prediction of the component of Salvia miltiorrhiza based on TCMSP (OB≥30%, DL≥0.18)
续表
2.5 蛋白互作网络分析
基于String 数据库，建立上述25 个匹配基因蛋白互作网络（图3），其中共有25 个节点和95 条边。通过Cytoscape 软件中的Network Analysis 分析，根据节点度（degree）和接近中心性（closeness centrality）进行排序，前5 位分别为COMT、HTR1A、APP、DRD4和OPRM1（表3）。这提示丹参中活性成分可能通过调控儿茶酚胺、5-羟色胺受体信号通路和内源性阿片类系统，改善抑郁与焦虑障碍。
表3 丹参-抑郁-焦虑匹配基因注释及其节点度和近中心性Tab. 3 Annotation of Danshen-depression-anxiety matched genes ranked by degree and closeness centrality
图3 PPI 蛋白互作网络分析Fig.3 PPI protein interaction network analysis
2.6 基因功能富集分析
基于R 代码调用clusterProfiler 安装包，实现GO和KEGG 基因富集分析，并通过org.Hs.eg.db 包对富集基因进行功能注释（图4）。GO 富集结果显示，上述基因主要参与调节神经递质转运、多巴胺与儿茶酚胺类代谢及应激反应等生物学过程，在细胞定位上主要参与构成突触（前）膜、膜筏、膜微结构域及胞膜区域等，涉及神经递质受体激活、铵离子结合、氯离子跨膜转运体激活等多种分子功能。KEGG 富集分析提示，其参与神经活性配体-受体结合、5-羟色胺能突触、多巴胺能突触等重要生理过程。
图4 丹参-疾病匹配基因功能GO 及KEGG 富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analyses of Salvia miltiorrhiza disease matching gene function
2.7 中药-靶点-疾病网络
将筛选出的50 种丹参单体成分与丹参-焦虑相关基因进行匹配，建立中药-靶点-疾病网络（图5）。其中糖原合成酶激酶3β（GSK3B）、单胺氧化酶A（MAOA）、单胺氧化酶B（MAOB）、5-羟色胺受体2B（HTR2B）、1型大麻受体（CNR1）等，与丹参中多种活性成分相关，可能成为丹参改善抑郁或焦虑的潜在作用靶点。
图5 丹参-靶点-疾病网络分析Fig.5 Analysis of Salvia miltiorrhiza-target-disease network
丹参作为经典的传统中草药，具有祛瘀止痛、活血通经的作用，可促进血液循环、改善微循环障碍，已被广泛用于心脑血管疾病的临床治疗[11]。此外，丹参还具有清心除烦的功效，在用于治疗冠心病合并失眠的患者中具有较好临床效果[12]。本研究基于临床病例资料和网络药理学，探究丹参改善心血管疾病合并抑郁和（或）焦虑患者的潜在作用机制。结果显示，丹参普遍用于冠心病临床治疗中，其活性成分可能作用于神经活性配体-受体结合、5-羟色胺能突触、多巴胺能突触等，参与调节神经递质转运、多巴胺与儿茶酚胺类代谢及应激反应等多种生物学过程。中药-靶点-疾病网络分析显示，丹参多种活性成分与糖原合成酶激酶3β、单胺氧化酶、5-羟色胺受体及阿片类受体等存在相互作用，可能成为丹参改善抑郁和焦虑的潜在作用靶点。
焦虑是面对即将到来的负面事件所产生的情绪状态，表现为过度担心、回避和肌肉紧张等[13]；
而抑郁则主要表现为快感缺失、情绪低落以及自杀倾向[14]，也是许多心血管疾病发生和预后不良的重要危险因素[15]。目前普遍认为抑郁的发生与突触间隙5-羟色胺（5-HT）耗竭、脑源性神经营养因子缺乏以及下丘脑-垂体-肾上腺轴的过度活跃等有关，然而其具体发病机制仍不清楚[14]。5-HT 是由胃肠道肠嗜铬细胞和中枢神经元合成的单胺神经递质，能够被肝脏或突触前膜内单胺氧化酶（MAO）氧化产生5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)，最终经肾脏排出[16]。中枢内5-HT 主要位于神经元突触前囊泡，经神经冲动发放后，释放进入突触间隙，作用于突触后膜上5-HT2型受体等，参与调控睡眠、进食、情绪、学习和记忆等生理过程[17]，还可进一步增强突触前膜5-HT 分泌，改善焦虑、抑郁症状[18]。目前，选择性5-HT 再摄取抑制剂（SSRIs）和单胺氧化酶抑制剂（MOAI）已成为治疗焦虑抑郁的临床一线药物[19]。
脑内单胺系统主要包括多巴胺、去甲肾上腺素与5-羟色胺，其功能异常与多种精神系统疾病发生有关[20]。多巴胺能够作用于D1 和D2 型受体，参与运动、认知、学习记忆及情绪等活动[21]，并能抑制额叶谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体的激活，发挥抗抑郁作用[22]。中脑腹侧被盖区的多巴胺能神经元活性下调被认为与抑郁发生密切相关[20]。此外，焦虑障碍患者常伴有交感神经系统过度兴奋，外周血中去甲肾上腺素和多巴胺的水平上升，在药物治疗后出现下降趋势[23-24]。儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）能够将儿茶酚胺类代谢生成3-甲氧酪胺（3-methoxytyramine, 3-MT），后者经MOA 进一步氧化产生终产物高香草酸（homovanillic acid, HVA）。COMT 抑制剂能够增加多巴胺半衰期和生物利用度，可用于帕金森病、精神分裂症及抑郁等治疗[25]。
内源性阿片肽系统是由脑啡肽、内啡肽等前体水解产生的20 多种活性肽与μ、σ、κ 类阿片受体组成，发挥中枢镇痛和呼吸抑制等作用[26]。其中μ 型阿片受体属于G 蛋白偶联受体，广泛存在于大脑纹状体、海马、前额叶皮质、伏隔核等脑区，除参与镇痛和成瘾外，还参与调节情绪、行为变化和精神症状[27]。大量证据表明内源性阿片系统在调节情绪及许多精神疾病中具有重要作用[28]。μ 阿片受体失调可影响大脑内神经营养因子与神经递质水平，导致抑郁的发生，而给予阿片类药物能够在短期内迅速改善抑郁症状[28]。丹参及其活性成分能够靶向HTR1A、MAOA/MAOB、COMT 及OPRM1，参与调控5-HT 与多巴胺能神经元、儿茶酚胺类代谢及内源性阿片系统，可能成为改善冠心病合并抑郁或焦虑障碍的潜在作用机制。
本研究基于网络药理学探究丹参及其活性成分改善抑郁或焦虑的潜在机制存在一定的局限性。首先，通过数据库筛选的有效成分可能与临床患者体内实际有效成分并不一致；
其次，中药网络分析难以区分不同单体成分之间的抑制效应和激活效应；
最后，富集分析结果可能与生物体内实际情况有所偏差，仍需要进一步实验验证。
综上，丹参及其复方制剂广泛用于冠心病患者临床治疗当中，其活性单体具有的调节脑内单胺递质、儿茶酚胺代谢及内源性阿片系统等潜在作用，成为治疗冠心病合并焦虑抑郁障碍的潜在药物，其安全、有效及经济易得使之具有良好的临床应用前景。
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