乳酸菌降解发酵蔬菜中亚硝酸盐的研究现状
时间：2022-12-08 08:45:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
龚福明，何彩梅，吴桂容，郭继毅
(1.贺州学院 食品与生物工程学院，广西 贺州 542899；
2.德宏职业学院 基础医学院，云南 芒市 678400)
发酵蔬菜历史悠久，是一类以新鲜蔬菜为原料，加入一定量食盐后，在原料本身附着的有益微生物的作用下，通过控制其益生性微生物生长条件对蔬菜进行加工而成的风味独特，具有抗衰老、减脂、抗氧化、甚至抗COVID-19等功效的发酵蔬菜产品。不同的发酵原料及发酵工艺可得到泡菜、酸菜、酱菜等多种形式的发酵蔬菜产品，现阶段的代表性产品包括四川泡菜、涪陵榨菜、东北酸菜、贵州辣椒酱以及以甘肃兰州和陕西陕南的浆水菜为代表的传统腌制蔬菜；
营养丰富、保健功效良好、酸鲜可口、开胃下饭等特性使传统腌制的发酵蔬菜逐渐成为人们不可或缺的日常小菜，并逐渐形成一定的产业规模。然而在粗放的传统发酵工艺条件下，蔬菜中富积的硝酸盐在长期发酵腌制过程中容易被硝酸还原菌等微生物还原为亚硝酸盐并大量积聚，导致发酵蔬菜中亚硝酸盐超标，影响发酵蔬菜品质与食用。相关报道表明，过量摄入含亚硝酸盐的食物会导致中毒性高铁血红蛋白症，甚至死亡；
同时亚硝酸盐还能与蛋白质分解产物胺类反应生成具有极强致畸、致癌特性的亚硝胺等N-亚硝基化合物引发癌症及胎儿畸形。因而筛选高效降解亚硝酸盐的优良菌株，设法降低亚硝酸盐及其前体化合物硝酸盐的摄入成为提高发酵蔬菜品质、实现发酵蔬菜产业规模化与标准化发展亟需解决的核心技术。
乳酸菌是国际公认的食品安全级(generally recognized as safe, GRAS)微生物，被广泛运用于食品加工等产业。相关报道表明，蔬菜中分布着大量的乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌及少量的其他菌群，其中乳酸菌是蔬菜发酵的主要作用微生物，在发酵过程中除具有降低发酵液pH值，发挥抑制有害菌生长的防腐作用及加强营养，赋予产品芳香的风味、良好口感与优良保健功效外，还具备显著降低发酵蔬菜产品中亚硝酸盐含量的活性。随着人们认识的深入及健康生活理念的兴起，发酵蔬菜日益受到消费者的关注，通过乳酸菌作用有效降低发酵蔬菜中亚硝酸盐含量，提升产品质量与口感成为制备绿色发酵蔬菜的关键。本文将对蔬菜发酵过程中降解亚硝酸盐的主要作用乳酸菌及其亚硝酸盐降解机制与影响因素等进行综述，为乳酸菌发酵制备绿色低亚硝酸盐发酵蔬菜提供了理论依据与参考。
发酵蔬菜是历史悠久的世界性发酵食品，传统的固态高盐发酵会因蔬菜发酵过程中产生大量亚硝酸盐而影响发酵蔬菜的品质与安全性。相关研究报道表明，微生物降解亚硝酸盐是生物降解亚硝酸盐的主要方式，而蔬菜发酵过程中分属于乳杆菌属()、明串珠菌属()、肠杆菌属()、乳球菌属()、肠球菌属()、片球菌属()及魏斯氏菌属()7个属20余个种的乳酸菌，因其普遍具有降解亚硝酸盐、安全且高效的特性而成为发酵蔬菜生产过程中降解亚硝酸盐的优势候选微生物。张兴吉等分离得到的275株乳酸菌均具有降解亚硝酸盐的能力，半数以上乳酸菌菌株的亚硝酸盐降解率>90%，优势菌中发酵乳杆菌()的降解率最差且不稳定，降解率最低，仅为4.8%；
植物乳杆菌()的降解率最强且稳定，其亚硝酸盐降解率>96.7%，最高可达99.6%；
其中植物乳杆菌()与短乳杆菌()是当前降解亚硝酸盐能力极强且报道比较多的乳酸菌菌种。
蔬菜发酵乳酸菌菌种及发酵工艺的差异导致不同菌种甚至是同一菌种不同菌株之间在降解亚硝酸盐能力方面存在显著差异。相关研究报道证实，乳酸菌除具有防腐，加强营养，赋予产品芳香风味及良好口感与优良的保健功效外，还具备降低亚硝酸盐等有害代谢产物，提升品质与安全的特性，其发酵制备的泡菜等发酵蔬菜产品也更符合大众消费口味。张雪梅等在萝卜发酵过程中证实，人工接种乳酸菌发酵的萝卜泡菜中亚硝酸盐含量明显低于自然发酵泡菜，3种乳酸菌降解亚硝酸盐能力的排序为短乳杆菌>肠膜乳杆菌>植物乳杆菌；
且多菌种混合发酵降解亚硝酸盐的能力强于单菌种发酵，当肠膜明串珠菌和短乳杆菌混合发酵，且比例为1∶3时，萝卜泡菜的发酵效果最佳，降解亚硝酸盐的能力也最强。
乳酸菌是蔬菜发酵过程中的主要作用菌群，同时也具备极强的亚硝酸盐降解能力，菌株自身直接降解亚硝酸盐的途径主要是酶解途径和酸降解途径，蔬菜发酵过程中两种机制共同发挥作用，但在作用时间上存在差异。迟乃玉等研究发现，莱氏乳杆菌()、植物乳杆菌()、乳脂链球菌()等多种乳酸菌降解亚硝酸盐的活性会随发酵产酸后溶液pH值变化而被分为两个阶段：当发酵培养液pH>4.5时即发酵前期以酶降解为主；
当发酵培养液pH<4.0时即发酵后期以酸降解为主。微生物酶解亚硝酸盐的途径有反硝化路径和铵形成途径(硝酸盐异化还原成铵,DNRA)，Liu等在干酪乳杆菌鼠李糖亚种(subsp.)6013(LCR 6013)亚硝酸盐降解的研究中证实，LCR 6013等乳酸菌能通过反硝化路径实现亚硝酸盐的酶解，而不是铵形成途径。在酶解途径中反硝化路径的关键酶是亚硝酸盐还原酶，在该酶及一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶的作用下对NO→NO→NO进行依次降解，最终将亚硝酸盐转为氮气以完成酶解过程。酸降解途径是乳酸菌代谢过程中产生乳酸等有机酸释放的H能与发酵液中NO结合生成亚硝酸，进而发生非酶歧化反应最终将亚硝酸盐降解生成NO，进而有效降低发酵蔬菜中亚硝酸盐含量。相关研究证实，类似5-7-3等菌株的非酶歧化化学反应降低亚硝酸盐的能力与环境酸度成正比关系，与pH值成反比，即总酸度越高(pH越低)，菌株降低亚硝酸盐的非酶歧化反应能力越强，反之越弱。
另外，发酵蔬菜中的乳酸菌还存在降解亚硝酸盐的间接途径，即通过其代谢产物的抑菌作用发挥降解亚硝酸盐的功效。有研究报道证实，乳酸及细菌素等乳酸菌代谢产物能通过抑制大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、荧光假单胞菌、产碱假单胞菌等硝酸还原菌生长的机制降低发酵蔬菜中亚硝酸盐的生成与积累。此外，发酵过程中产生的V等微生物代谢产物也在一定程度上存在降低亚硝酸盐产生和积累的作用，具体机制还有待于深入研究。
乳酸菌是蔬菜发酵过程中的主要作用微生物，其自身蛋白分解能力弱，氨基酸、维生素等营养物质合成能力弱，代谢产物的自身抑制作用及营养要求较高，生长易受温度、pH值及渗透压的影响，以及亚硝酸盐还原酶在催化反应时需要适宜温度、pH值、一定金属离子等条件，使发酵蔬菜原料、发酵pH值、发酵温度、NaCl添加量与发酵乳酸菌菌种及接种量等外界因素与条件成为影响乳酸菌发酵降解发酵蔬菜中亚硝酸盐的关键。
3.1 发酵原料
可用于制备发酵蔬菜的原料繁多，常见的有芥菜、黄瓜、甘蓝、辣椒、萝卜、大白菜、雪菜、豇豆、豆角等原料，并可制备成泡菜、酸菜、酱菜三大类发酵蔬菜制品。一般来说，各类蔬菜的硝酸盐平均积累量排序为根菜类>叶菜类>茎菜类>果菜类>花菜类，而硝酸盐积累量越高，蔬菜在发酵过程中也越容易累积亚硝酸盐。闫亚梅等以大白菜为主料，加入豇豆、白萝卜、胡萝卜与黄瓜等蔬菜进行组合发酵，发现“亚硝峰”峰值仅为13 mg/kg，比单一发酵时低得多，说明原料也是影响泡菜发酵的关键因素。另外，发酵蔬菜自身原料决定了发酵工艺的差异，导致原料处理、添加姜、糖、蒜、葱、辣椒、八角等香辛料及NaCl与有机酸等成分和含量也存在差异，而热漂烫和低温贮藏及类似于姜等香辛料含有的生姜精油、姜辣素等活性物质及高浓度盐和酸在一定程度上能通过物理作用、抗氧化、抑制硝酸盐还原菌生长等特性降低或减少发酵蔬菜中亚硝酸盐的积累。
3.2 发酵条件
3.2.1 pH值
乳酸菌及其产生的亚硝酸盐还原酶在作用时对pH值都有一定要求，乳酸菌生长发酵最适pH值介于5.5～6.5之间，亚硝酸盐还原酶最适pH值为5.0。同时亚硝酸盐在酸性条件下极不稳定，可发生一定程度的自然降解，加速亚硝酸盐的降解进而降低其含量。有报道表明，乳酸菌降解亚硝酸盐的酶解和酸降解机制共同作用，pH值是乳酸菌降解亚硝酸盐的主要决定因素且与亚硝酸盐降解率成反比关系。另外，发酵环境pH值高于或低于细胞正常pH值(5.5～6.5)时，亚硝酸盐还原酶活性降低，亚硝酸盐还原速率也随之迅速下降；
发酵后期乳酸等酸性物质大量积累导致pH值降低，当pH值<4.0时亚硝酸盐还原酶降解作用不明显，乳酸菌主要以酸降解途径来降解亚硝酸盐。迟雪梅等在三段式(即发酵初期为自然发酵,发酵中期接种高产亚硝酸还原酶的乳酸菌,发酵后期接种产酸的乳酸菌)发酵甘蓝的研究中证实pH值确实是影响乳酸菌降解亚硝酸盐的主要因素，其发酵过程中接种乳酸菌的差异导致pH值变化能决定发酵甘蓝中乳酸菌降解亚硝酸盐的方式并能有效将发酵蔬菜中的亚硝酸盐含量降至最低。
3.2.2 温度
乳酸菌生长的温度介于30～40 ℃之间，所产生的亚硝酸盐还原酶的作用温度也介于30～40 ℃之间，一旦超过此范围，温度过高或过低均会影响乳酸菌生长及其所产生亚硝酸还原酶的活性与乳酸等有机酸和细菌素等活性物质的含量，最终使乳酸菌降解亚硝酸盐的途径受到影响或阻断。隋明等在甘蓝泡菜发酵制备中发现，30 ℃是最有利于泡菜制备和添加乳酸菌制剂发酵的温度，此温度条件下发酵基质的pH值最低，降解亚硝酸盐的能力最强，亚硝酸盐残留量最低，泡菜感官评分最高。另外，发酵乳酸菌菌株不同会导致最适温度有所差异，苏肖晶用戊糖乳杆菌 B1、植物乳杆菌 C1和植物乳杆菌D等23种乳酸菌进行组合发酵研究发现，最适发酵温度为35 ℃，在相应生长及作用温度范围内发酵体系温度越高，亚硝酸盐降解率越高。与此同时，有报道表明提高温度能缩短乳酸菌发酵蔬菜的周期，使“亚硝峰”较早出现，同时最终的“亚硝峰”峰值也会最低且一直低于其他温度值。然而温度过高会导致丁酸梭菌()等杂菌生长，因而结合泡菜多采用常温发酵的实际，筛选嗜冷且安全性高的乳酸菌作为发酵起子成为发酵蔬菜产品未来的发展趋势。Kim等在韩国泡菜(kimchi)的温控实验中发现，-1 ℃条件下发酵7 d，清酒乳杆菌、弯曲乳杆菌和短乳杆菌的亚硝盐降解率依次为87.9%、66.0%、57.1%，但温度提高到15 ℃时，3种乳酸菌的亚硝酸盐降解率几乎为100%。
3.2.3 NaCl浓度
NaCl是蔬菜发酵过程中不可或缺的添加剂，一方面有着调节泡菜风味、防腐抑菌的作用，另一方面也可作为乳酸菌等发酵作用微生物生长繁殖的营养条件，并通过盐浓度让蔬菜中可溶性营养成分进入发酵液，供发酵微生物吸收利用。相关报道表明，发酵蔬菜由来的乳酸菌都具有一定耐盐性，能在NaCl含量1%～10%的发酵蔬菜中生长并表现出降解亚硝酸盐的特性。因耐盐性，低浓度NaCl对乳酸菌生长及其亚硝酸盐降解能力影响不大甚至有促进作用，但不能完全抑制腐败菌生长；
随着NaCl浓度增加至一定值后，乳酸菌等发酵微生物的生长受到抑制，进而影响了乳酸菌的亚硝酸盐降解能力。熊涛等在NaCl添加量对自然发酵圆白菜影响的研究中证实，不同NaCl含量对泡菜中乳酸菌降解亚硝酸盐的能力有明显影响，低浓度(NaCl浓度为2%)时乳酸菌繁殖最快，产酸最多，pH值最低；
食盐浓度为2%时有害微生物得到有效抑制，快速降解了泡菜中的亚硝酸盐，仅发酵0.5 d后就快速出现了“亚硝峰”，高浓度(NaCl浓度为8%)时泡菜中乳酸菌生长受到了抑制，泡菜成熟期也相应的延长。
3.2.4 乳酸菌接种量
传统泡菜发酵中以乳杆菌属()、明串珠菌属()、片球菌属()等乳酸菌为主要发酵菌群的阶段是决定泡菜风味、品质及其亚硝酸盐等代谢产物分解转化的关键。因此，改善风味与口感，降低亚硝酸盐含量，提升品质，筛选发酵速度快、风味优且亚硝酸盐降解能力强的功能性乳酸菌进行纯种发酵或混合发酵成为现代泡菜产业的发展趋势。报道表明，接种乳酸菌降解亚硝酸盐有一个最适接种量，低于最适接种量之前，乳酸菌接种量与亚硝酸盐降解量成正比，大于最适接种量后则成反比，因此接种量过多或过少均不利于泡菜发酵及代谢产物亚硝酸盐等物质的降解与转化。赵慧娟等在乳杆菌Lyoflora V3接种量对亚硝酸盐降解的研究中证实菌株Lyoflora V3的最佳接种量为5%，低于或高于此接种量，乳杆菌Lyoflora V3的亚硝酸盐降解效果均较差。随着研究深入，混合发酵逐渐成为泡菜等发酵蔬菜产业的发展趋势，姜雪晶等在副干酪乳杆菌()、布氏乳杆菌()和凝结芽孢杆菌()3种乳酸菌混合发酵酸菜的研究中发现，混合菌群发酵酸菜的亚硝酸盐浓度(1.593 mg/kg)明显低于自然发酵酸菜(3.641 mg/kg)，且其感官品质、风味及氨基酸、Vc与有机酸L-乳酸等营养物质及风味物质含量均优于自然发酵酸菜。
3.3 其他影响因素
乳酸菌降解亚硝酸盐的特性与乳酸菌及其产生的亚硝酸盐还原酶直接相关，而降解亚硝酸盐特性除受上述发酵原料与主要发酵条件影响外，还受到接种乳酸菌种类、抗氧化物质(黄酮类、维生素A、维生素C、维生素E)、益生元、亚硒酸钠等添加剂及酶激活剂(EDTA 与金属离子Zn、K、Fe、Fe、Cu)等因素的影响，具体作用机理还有待深入研究。
综上所述，当发酵条件适合时，发酵蔬菜中的主要作用微生物乳酸菌确实能通过酶解途径与酸解途径及代谢产物抑制硝酸还原菌与腐败菌生长等直接与间接机制降解发酵蔬菜中的亚硝酸盐；
加之乳酸菌能增强发酵蔬菜的营养，改善其风味与口感，提升相应产品质量与安全的特性，乳酸菌是良好的蔬菜发酵起子。但乳酸菌降低发酵蔬菜中亚硝酸盐，改善品质，提升口感的研究大多处于实验室研究阶段，对其安全性评价与控制体系及运用工业化、标准化发酵蔬菜实现规模化生产的研究还有一定差距。但随着人们认识的深入及健康生活理念的兴起，凭借降解亚硝酸盐分子机理与基因组学研究及乳酸菌与发酵食品体系相互作用机制的阐明，乳酸菌发酵蔬菜产品将成为备受人们关注与喜爱的绿色发酵产品。
